专利名称：淀粉酶多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽，特别是淀粉酶多肽和编码它们的核酸，及其用途，例如在食品或饲料产品生产中作为非麦芽生成性外切淀粉酶。
背景技术：
改进的淀粉酶可减轻某些方法中内在的问题，例如在植物淀粉的转换中或烘焙中。烘焙后数天在淀粉颗粒中发生支链淀粉的结晶，这引起面包硬度增加并引起面包陈化。当面包陈化时，面包失去面包心的柔软性和面包心水分。作为结果，面包心变得弹性更小并且面包产生皮革似的外皮。支链淀粉侧链的酶促水解(例如，通过淀粉酶)可减少结晶并增加抗陈化。结晶取决于支链淀粉侧链的长度侧链越长，结晶越多。大多数淀粉颗粒是由两种聚合物的混合物构成的支链淀粉和直链淀粉，其中大约75%为支链淀粉。支链淀粉是非常大的分支的分子，其由(1-4)连接相连的α -D-卩比喃葡萄糖基单元的链组成，其中所述链通过α -D-(1-6) 连接附着以形成分支。直链淀粉是(1-4)连接的α-D-吡喃葡萄糖基单元的线性的链，具有少数α-D-(1-6)分支。含淀粉的面包产品(例如白面包、由低麸黑麦粉和小麦粉制备的面包以及面包卷 (roll))的烘焙是通过在180°C至250°C的范围内在烤箱中烘焙面包生面团15至60分钟而实现的。在烘焙过程中，陡的温度梯度至120°C )在外层生面团占优势，而在此形成烘焙产品的外皮。然而，由于蒸汽，面包心中的温度在烘焙过程结束时仅为约100°C。超过约85°C的温度，可发生酶失活并且酶将不具有抗陈化特性。因此，只有热稳定的淀粉酶能够在烘焙过程中有效地修饰淀粉。内切淀粉酶活性通过由于分支糊精的累积而产生粘性的或胶粘的面包心，可负面地影响最终面包产品的品质。优选外切淀粉酶活性，因为其实现了引起陈化延缓的所需的淀粉修饰，具有更少的与内切淀粉酶活性相关的负面影响。减少内切淀粉酶活性可引起更好的外切特异性，这可减少分支糊精并产生更高品质的面包。将植物淀粉(特别是玉米淀粉)转化为乙醇是快速扩展的工业。麦芽四糖(G4或 DP4)糖浆是源自酶促处理淀粉的许多商业上重要的产品之一。将植物淀粉(特别是玉米淀粉)转化为麦芽四糖和更低的糖(例如葡萄糖或麦芽糖)是快速扩展的工业。当前的方法由引起葡萄糖或麦芽糖产生的两个相继的酶催化步骤组成。然后可使用酵母来将葡萄糖发酵为乙醇。第一个酶催化步骤是淀粉熔解。通常，通过快速加热至85°C或更高而对淀粉悬浮物进行凝胶化。使用α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)来将粘性熔解物降解为麦芽糊精。α -淀粉酶是催化内部α-1，4_D-糖苷键的随机剪切的内切水解酶。当α-淀粉酶分解淀粉时，粘性减小。因为熔解通常是在高温下进行的，在此步骤中优选的是热稳定的α-淀粉酶，例如来自芽孢杆菌属(Bacillus)的种的α-淀粉酶。以此方式生产的麦芽糊精通常不能被酵母发酵以形成醇。因此需要第二个酶催化的糖化步骤来分解麦芽糊精。葡糖淀粉酶和/或麦芽生成性α-淀粉酶通常被用于催化熔解后形成的麦芽糊精的非还原末端的水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。脱支酶(例如支链淀粉酶)可被用于辅助糖化。糖化通常在升高的温度、在酸性条件下(例如60°C， pH 4. 3)发生。G4(也称为DP4)糖浆与蔗糖糖浆相比具有许多有利的特性。例如，在食物中用G4 糖浆部分地替代蔗糖减少食物的甜度而不影响其味道或风味。由于其更低的葡萄糖和麦芽糖含量，G4糖浆在食物中具有高保水性并显示出更少的有害的美拉德反应产物。G4糖浆还比蔗糖具有更高的粘性，因而改进食物质地。G4糖浆比蔗糖或高果糖糖浆更少地降低水的冰点，因此G4糖浆可更好地控制冷冻食物的冰点。消化后，G4糖浆还比蔗糖更少地影响渗透压。总之，这些品质使得G4糖浆理想地适于作为食物和医疗产品中的成分。G4糖浆也可用于其它的工业。例如，G4糖浆赋予光泽并可被有利地用作纸张浆料。参见，例如 Kimura 等人，"Maltotetraose, a new saccharide of tertiary property,，，Starch 42: 151-57(1990)。用于生产乙醇的酵母之一是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。酿酒酵母含有α-葡糖苷酶，其被显示利用单糖、二糖和三糖作为底物，^on等人(Carbohydrate Res. 338 1127-32 (2003))。可通过Mg2+补给和过表达AGTl通透酶Gtambuck等人，Lett. Appl. Microbiol. 43 :370-76 (2006))、过表达 MTTl 和 MTTlalt 以增加麦芽三糖摄取(Dietvorst等人，Yeast 22 :775-88 (2005))、或在细胞表面上表达麦芽糖酶 MAL32 (Dietvorst等人，Yeast 24 =27-38(2007))来改善酿酒酵母利用三糖的能力。可以省略糖化步骤，如果熔解步骤产生了足够水平的单糖、二糖或三糖并且酿酒酵母或其经遗传修饰的变体被用于发酵步骤。嗜糖假单胞菌(I^eudomonas saccharophila)表达形成麦芽四糖的麦芽四糖水解酶(EC 3. 2. 1. 60 ；形成G4的淀粉酶；G4-淀粉酶)。已确定了编码PS4的嗜糖假单胞菌基因的核苷酸序列(Zhou 等人，"Nucleotide sequence of the maltotetraohydrolase gene from Pseudomonas saccharophila,，，FEBS Lett.255 :37-41(1989) ；GenBank Acc. No.X16732)。PS4是作为具有N末端21个残基信号肽的前体蛋白表达的。如SEQ ID N0 10中所显示的，PS4的成熟形式含有530个氨基酸残基，其在N末端具有催化结构域而在C 末端具有淀粉结合结构域。PS4显示内切和外切α-淀粉酶活性。内切α-淀粉酶活性可用于降低凝胶化淀粉的粘性，而外切α-淀粉酶活性可用于将麦芽糊精分解成更小的糖。发明概述本发明涉及多肽，特别是淀粉酶多肽和编码它们的核酸，及其用途，例如在食品生产中作为非-麦芽生成性外切淀粉酶。本发明的淀粉酶被工程化以具有更多有益的品质。 具体地，本发明的淀粉酶显示出改变的外切特异型和/或改变的热稳定性。特别地，所述多肽衍生自具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性(特别是葡聚糖1，4-α_麦芽四糖水解酶(EC 3.2. 1.60)活性)的多肽。一方面，本申请中所定义的多肽与SEQ ID NO :1的淀粉酶相比具有改进的抗陈化效果。另一方面，本申请中所定义的多肽与SEQ ID NO :1的淀粉酶相比具有改进的热稳定性。提供了如权利要求中所列的变体多肽。另一方面，提供了所述变体多肽的用途，如权利要求中所列的，包括用于和用作食物添加剂、食品、烘焙产品、改进剂组合物、饲料产品(包括动物饲料)等。另一方面，提供了如权利要求中所列的编码和涉及变体多肽的核酸。 权利要求中还列出了用于生产此类变体多肽的方法，以及其它的方面。
所附的图被并入并作为本说明书的一部分且阐释了各种实施方式。图1显示了与用包含SEQ ID NO 1的组合物烘焙的面包相比，用pMS1776 (SEQ ID NO :12)，pMS2020(SEQ ID NO :14)，pMS2022(SEQ ID NO :15)和 pMS2062(SEQ ID NO :16)烘焙的面包的硬度发展。图2显示了与用包含SEQ ID NO :1和Novamyl 1500的组合物烘焙的面包相比，用 pMS1776(SEQ ID NO 12)、pMS1934 (SEQ ID NO 13)、pMS2022 (SEQ ID NO :15)和 PMS2062 (SEQ ID NO :16)烘焙的面包的硬度发展。发明详述根据此详细描述，适用下列简称和定义。应当注意如本申请中所使用的，单数形式 “a”、“an”和“the”包括复数指代，除非上下文中清楚地另外指出。因此，例如提及“酶”包括多个所述酶，而提及“制剂”包括指的是一种或多种制剂以及本领域技术人员已知的等同
物，等等。一方面，提供了具有淀粉酶活性的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列具有a)与SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少65%的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代88或205，和/或b)与SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少78%的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代:16，48，97，105，235，240，248，266，311，347，350， 362，364，369，393，395，396，400，401，403，412 或 409，和 / 或c)与SEQ ID NO :1的氨基酸序列至少78%的序列同一性，并且其中所述多肽包含下列一个或多个氨基酸取代4I/A/V/N/I/H/F，34Q，100Q/K/N/R, 272D，392K/D/E/Y/N/Q/ R/T/G 或 399C/H,和 / 或d)与SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少95%的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代44，96，204，354或377，和/或e)与SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少95%的序列同一性，并且其中所述多肽包含下列氨基酸取代392S ；参考如SEQ ID NO 1所示的序列的位置编号。一方面，提供了具有淀粉酶活性的多肽，其包含的氨基酸序列具有与SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少65%的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代88或205和/或包含一个或多个下列氨基酸取代42K，235H/K/R，240Ε, 392Κ/ D/E/Y或409Ε，参考如SEQ ID NO 1所示的序列的位置编号。本发明还包括了下述多肽的应用其与本申请中所定义的氨基酸序列或与具有本申请中所定义的特定特性的多肽有一定程度的序列同一性或序列同源性。本发明特别包括与SEQ ID NO :1(如下文所定义的)或其同源物具有一定程度的序列同一性的肽。在此，术语“同源物”指与主体氨基酸序列或主体核苷酸序列有序列同一性的实体，其中所述主体氨基酸序列优选为SEQ ID NO 1且所述主体核苷酸序列优选为SEQ ID NO :52。
一方面，所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应当提供和/或编码这样的多肽 其保持了 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 10的多肽的功能活性和/或提高了 SEQ ID NO :1或 SEQ ID NO 10的多肽的活性，优选SEQ ID NO 1的多肽的活性。在当前的情境中，同源序列包括这样的氨基酸序列其可与主体序列至少65%， 70%，75%，78%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少 98%或至少99%同一。通常，所述同源物与主体氨基酸序列将包括相同的活性位点等。虽然也可在相似性方面考虑同源性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，在本发明的情境中优选按照序列同一性来表述同源性。可通过眼睛，或更经常是借助容易获得的序列比较程序来进行序列同一性比较。 这些商业可得的计算机程序使用复杂的比较算法来比对两个或更多个序列，其最好地反映出可能导致两个或更多个序列之间的差异的进化事件。因此，这些算法以评分系统运行，所述评分系统奖励同一的或相似的氨基酸的比对而惩罚缺口的插入、缺口延伸和不相似氨基酸的比对。所述比较算法的评分系统包括i)每次插入缺口时指定罚分(缺口罚分)，ii)每次现存的缺口延伸一个额外的位置时指定罚分(延伸罚分)，iii)对于同一的氨基酸的比对指定高分，和iv)对于非同一的氨基酸的比对指定可变的分。大多数比对程序允许修饰缺口惩罚。然而，当使用此类软件进行序列比较时，优选的是使用默认的值。对于非同一的氨基酸的比对给出的得分是根据评分矩阵(也称作取代矩阵)指定的。在所述取代矩阵中提供的得分所反映的事实是进化过程中一个氨基酸被另一个所取代的可能性是变化的并且其取决于将被取代的氨基酸的物理/化学性质。例如，与被疏水性氨基酸所取代相比，极性氨基酸被另一个极性氨基酸所取代的可能性更大。因此，所述评分矩阵对于同一的氨基酸将指定最高的得分，对于非同一但相似的氨基酸将指定更低的得分，而对于非同一且不相似的氨基酸将指定甚至更低的得分。最常用的评分矩阵是PAM矩阵(Dayhoff 等人(1978)，Jones 等人(1992))、BL0SUM 矩阵(Henikoff 和 Henikoff (1992)) 和 Gonnet 矩阵(Gonnet 等人(1992))。 适合于进行此类比对的计算机程序包括但不限于Vector NTI (Invitrogen Corp.)和 ClustalV，Clustalff 以及 ClustalW2 程序(Higgins DG&Sharp PM (1988)，Higgins 等人(1992)，Thompson 等人(1994)，Larkin 等人 Q007))。由 www, expasy. org 的 ExPASy 蛋白质组服务器可获得汇集的不同比对工具。可进行序列比对的软件的另一个实例是 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)，其可由国家生物技术信息中心的网页(目前可在http://www. ncbi. nlm. nih. gov找到)获得，并且被首先描述于Altschul等人 (1990) J. Mol. Biol. 215 ；403-410。一旦软件产生出了比对，就可能计算％相似性和％序列同一性。所述软件通常将其作为序列比较的一部分进行并生成数字的结果。在一个实施方式中，优选使用ClustalW软件来进行序列比对。优选地，对于两两比对，使用下列参数而用ClustalW进行比对
权利要求
1.具有淀粉酶活性的多肽，其包含的氨基酸序列具有a.与SEQID NO :1的氨基酸序列至少78%的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代:235，16，48，97，105，240，248，266，311，347，350，362， 364，369，393，395，396，400，401，403，412 或 409，和 / 或b.与SEQID NO :1的氨基酸序列具有至少65%的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代88或205，和/或c.与SEQID NO :1的氨基酸序列至少78%的序列同一性，并且其中所述多肽包含一个或多个下列氨基酸取代4I/A/V/N/I/H/F，34Q，100Q/K/N/R, 272D，392K/D/E/Y/N/Q/R/T/G 或399C/H,和/或d.与SEQID NO :1的氨基酸序列至少95%的序列同一性，并且其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代44，96，204，354或377，和/或e.与SEQID NO :1的氨基酸序列至少95%的序列同一性，并且其中所述多肽包含下列氨基酸取代392S，参照如SEQ ID NO :1所示的序列的位置编号。
2.根据权利要求1的多肽，其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代 235，88，205，240, 248,沈6，311，377或409和/或一个或多个下列氨基酸取代4I/A/V/N/ I/H/F,34Q,100Q/K/N/R,272D 或 392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。
3.根据权利要求1-2中任一项的多肽，其中所述多肽包含在下列位置的一个或多个氨基酸取代235，88，205，M0，311或409和/或一个或多个下列氨基酸取代42K/N/I/H/F， 272D 或 39I/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。
4.根据权利要求1-3中任一项的多肽，其中所述多肽在至少四个、五个或全部下列位置包含氨基酸取代88，205, 235，M0，311或409和/或具有至少一个或两个下列氨基酸取代4I/N/I/H/F，272D 或 392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。
5.根据权利要求1-4中任一项的多肽，其中所述多肽还包含一个或多个下列氨基酸 33Y,34N,70D,121F,134R,141P,146G,157L,161A,178F,179T,223E/S/K/A,229P,307K,309P 和 334P。
6.根据权利要求1-5中任一项的多肽，其与SEQID NO 1的氨基酸序列具有至少90， 91，92，93，94，95，96，97，98 或 99%的序列同一性。
7.根据权利要求1-6中任一项的多肽，其中所述多肽在位置88包含氨基酸取代。
8.根据权利要求7的多肽，其中所述多肽具有氨基酸88L。
9.根据权利要求1-8中任一项的多肽，其中所述多肽在位置235包含氨基酸取代。
10.根据权利要求9的多肽，其中所述多肽具有氨基酸235R。
11.根据权利要求1-10中任一项的多肽，其中所述多肽还包含一个或多个下列氨基酸 121F,134R,141P,229P 或 307K。
12.根据权利要求1-11中任一项的多肽，其包含选自下列的氨基酸序列SEQID NO 12，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31，SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33 和 SEQ ID NO :34。
13.根据权利要求1-12中任一项的多肽，其具有在C末端融合的连接子。
14.根据权利要求1-13中任一项的多肽，其具有外切淀粉酶活性。
15.根据权利要求1-14中任一项的多肽，其具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性。
16.根据权利要求1-15中任一项的多肽作为食物或饲料添加剂的用途。
17.制作糖浆的方法，包括向颗粒淀粉熔解物中加入根据权利要求1-15中任一项的多肽，以形成糖浆。
全文摘要
本发明涉及多肽，更具体地为淀粉酶多肽和编码它们的核酸，以及它们的用途，例如在食品或饲料产品生产中作为非麦芽生成性外切淀粉酶。
文档编号C12N9/28GK102428176SQ201080021717
公开日2012年4月25日 申请日期2010年5月19日 优先权日2009年5月19日
发明者A·H·凯利特-史密斯, K·M·克劳, R·L·B·詹纳, R·梅吉达尔, R·米科尔森 申请人:丹尼斯科公司