用于对目标核酸进行条形码化的多引物扩增方法

专利名称：用于对目标核酸进行条形码化的多引物扩增方法
技术领域：
本发明总体上涉及针对特定目标核酸进行检测和/或测序的高通量测定领域。在某些实施方案中，本发明提供了多种扩增方法，其中一个或多个核苷酸标记以及一个条码核苷酸序列被加入到目标核苷酸序列中。
背景技术：
在样品中检出特定核酸序列的能力已经导致诊断和预测医学、环境、食品和农业监测，分子生物学研究，以及多种其他领域中多种新方法。此外，新测序方法提供了多种快速高通量核酸测序的手段。另外的方法，尤其是有助于在样品中横跨宽范围的浓度同时分析多目标和/或分析多样品的方法将是非常有利的。可以使用多种微流体装置在至今未曾想见的规模上实现分析、制备、计量、以及其他操作功能。微流体装置的优点包括保存珍贵试剂以及样品、高密度以及通量的样品分析或合成、肉眼几乎不可见水平的流体精确度和准确度、以及伴随替换在宏观流体尺度上操作的对应设备而来的空间减少。伴随微流体装置的尺寸减小以及密度增加的是复杂性增加以及与日益增加的复杂的装置构造相关的更高的工程和制造成本。近年来，已经协同安排了多种努力来开发和制造微流体系统以实现多种化学和生物化学的分析以及合成。另外，微流体装置具有被适配以与多种自动系统一起使用的可能性，由此提供了进一步降低成本以及减少由于减少人员导致的操作错误的额外的益处。已经提出了多种微流体装置用于多种应用中，包括例如毛细管电泳法、气相层析法、以及细胞分离。然而，由于与迄今已经制造的微流体装置相关的多种复杂因素，这些益处的实现经常被阻碍。例如，许多现有的微流体装置是由基于硅石的基质制造的，这些基质对于机加工而言是困难的并且是复杂的。其结果是，由这类材料制造的许多装置是易碎的。而且，将流体运送通过多个现有微流体装置需要调节复杂的电场从而以控制的方式将流体运送通过该装置。因此，就上述益处而言(这些益处可以用微流体装置来实现但是受到现有装置当前的限制)，仍然对设计用于进行多种化学以及生物化学分析的多种微流体装置存在一种需要。由于它在现代生物化学中的重要性，对于可以用于进行多种核酸扩增反应、同时对于用于其他类型的分析也具有足够的多样性的装置存在一种特殊的需要。
具有进行核酸扩增能力的装置将具有多种应用性。例如，这类装置可以被用作分析工具来确定样品中是否存在感兴趣的具体目标核酸。因此，可以使用这些装置来针对具体病原体的存在(例如，病毒、细菌、或真菌)、以及针对鉴别目的(例如，亲子关系以及法医应用)进行测试。还可以使用这类装置来检测或表征以前与具体的疾病或遗传障碍相关联的多种特定的核酸。当用作分析工具时，还可以使用这些装置来进行基因分型分析以及基因表达分析(例如，差别基因表达研究)。作为替代方案，能够以制备方式使用这些装置来扩增足够的核酸用于进一步分析，例如对扩增的产物进行测序、细胞分型、DNA指纹图谱等。扩增的产物还可以被用于多种基因工程应用中，例如插入一个载体中，然后可以使用该载体来转化细胞以生产所希望的蛋白产物。虽然在微流体设计以及应用中有这些进展，降低微流体芯片的复杂性以及简化它们的操作应该是有用的。另外，对于增加从微流体装置中回收反应产物的能力存在一种需要。因此，在本领域中对于与微流体装置相关的改进的方法以及系统存在一种需要。

发明内容
在某些实施方案中，本发明提供了用于在多个样品中扩增、标记、以及条形码化多个目标核酸的一种方法。该方法必须针对每个目标核酸制备一种扩增混合物。每个扩增混合物包括一个正向引物，该正向引物包括一个目标特异性部分；一个反向引物，该反向引物包括一个目标特异性部分，其中该正向引物额外地包括一个第一核苷酸标记和/或该反向引物额外地包括一个第二核苷酸标记；以及至少一个条形码引物，该条形码引物包括一个条形码核苷酸序列以及一个第一和 /或第二核苷酸标记特异性部分，其中对于该一种或多种正向和/或反向引物而言该条形码引物是过量的。使每个扩增混合物经受扩增作用从而生成多个目标扩增子，其中每个目标扩增子包括一个标记的目标核苷酸序列，其中第一和/或第二核苷酸标记位于目标核苷酸序列侧翼，并且至少一个条形码核苷酸序列位于目标扩增子的5’或3’端上。在具体实施方案中，该正向引物额外地包括一个第一核苷酸标记。如果希望的话， 该反向引物可以额外地包括一个第二核苷酸标记。在标记/条形码化方法的某些实施方案中，在这些扩增混合物中条形码引物的浓度是该一种或多种正向和/或反向引物的浓度的至少4倍。在这类实施方案多个变体中， 在这些扩增混合物中条形码引物的浓度是该一种或多种正向和/或反向引物的浓度的至少50倍。在条形码化/标记方法的多个具体实施方案中，选择该第一和/或第二核苷酸标记和/或条形码核苷酸序列以便避免实质性地退火到目标核酸上。在多个示意性实施方案中，该条形码核苷酸序列鉴别特定的样品。当在某些实施方案中条形码引物包括一个条形码核苷酸序列以及一个第一核苷酸标记特异性部分时，多个正向引物包括相同的第一核苷酸标记。例如，当在不同样品中多个目标将被扩增时，相应于目标组的正向引物组都可以具有相同的第一核苷酸标记。在条形码化/标记方法的多个具体实施方案中，针对每个目标的正向和反向引物最初是与样品分开结合的，并且每个条形码引物最初是与它的相应的样品结合的。例如， 当在S个样品中T个目标将被扩增时，T和S是大于一的整数，该方法可以额外地包括制备 SXT个扩增混合物，其中将最初结合的正向和反向引物加入到最初结合的样品和条形码引物中。在条形码化/标记方法的某些实施方案中，该扩增作用执行至少3个循环从而引入该第一和第二核苷酸标记以及该条形码核苷酸序列。在这些实施方案的多个变体中，扩增作用被执行5至50个循环。在多个具体实施方案中，扩增作用被执行足够数量的循环从而将目标扩增子拷贝数对这些目标并且对这些样品进行归一化。在条形码化/标记方法的某些实施方案中，当扩增时所生成的至少50%的目标扩增子是以大于50%目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子拷贝平均数而存在的在其他实施方案中，本发明提供了一种方法，在该方法中条形码化任选地被省略并且在扩增之后这些目标核苷酸序列被标记。这种方法必须扩增多个目标核酸(典型地在多个样品中)。针对每个目标核酸制备扩增混合物，其中每个扩增混合物包括一个正向引物，该正向引物包括一个目标特异性序列；以及一个反向引物，该反向引物包括一个目标特异性序列；每个扩增混合物经受一个扩增作用从而生成多个目标核苷酸序列。然后将这些目标核苷酸序列进行标记(例如，通过将核苷酸标记连接到这些目标核苷酸序列的一个或两个末端上)从而生成多个目标扩增子。每个目标扩增子包括第一和/或第二核苷酸标记， 这些标记位于目标核苷酸序列的侧翼。在多个具体实施方案中，至少50%的目标扩增子是以大于50%的目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。在此所述的扩增方法的某些实施方案中，至少70%的目标扩增子是以大于50% 的目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。在多个示意性实施方案中，至少90%的目标扩增子是以大于50%的目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。在多个实施方案中，目标扩增子的平均长度是至少25个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、500个碱基、以及750个碱基。更长的平均长度，例如1千个碱基或更多也是可能的，像，例如当使用长片段PCR进行扩增时。在这类实施方案中，扩增可以产生多个目标扩增子，其中至少70%的目标扩增子是以大于50%的目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。在此所述的方法的一个优点是扩增可以(但不是必需的)在小反应体积中进行。 在多个具体实施方案中，扩增混合物的体积是在约1皮升至约50纳升的范围内。在某些实施方案中，扩增混合物的体积是在约5皮升至约25纳升的范围内。在此所述的这些方法可以任选地包括从这些扩增混合物中回收目标扩增子。在某些实施方案中，以在回收目标扩增子中小于约50%改变的体积和/或拷贝数来回收目标扩增子。这些回收的扩增子可以被用于进一步扩增和/或分析(例如，DNA测序)。在一些实施方案中，可以使用对于该第一和第二核苷酸标记具有特异性的引物使至少一个目标扩增子经受扩增作用从而生成缺少条形码核苷酸序列的一种目标扩增子(如果这是希望的话)°在此处所述的多个方法的具体实施方案中，目标核酸包括基因组DNA。在这些实施方案的多个变体中，基因组DNA可以是旨在用于DNA测序的DNA (例如自动化的DNA测序)。在某些实施方案中，正向引物、反向引物、以及条形码引物中的一个或多个可以包括至少一个另外的引物结合位点。例如，如果使用条形码引物，该条形码引物可以包括位于该条形码核苷酸序列的上游的至少一个第一另外的引物结合位点，该条形码核苷酸序列是位于第一核苷酸标记的上游的。在这样一个实施方案中，反向引物可以包括位于第二核苷酸标记的下游的至少一个第二另外引物结合位点。在多个具体实施方案中，当这些目标核苷酸序列将通过自动化的DNA测序进行测序时，该第一和第二另外引物结合位点能够被 DNA测序引物所结合。如果不使用条形码引物，并且在扩增之后将这些目标核苷酸序列进行标记，该第一和第二核苷酸标记可能被DNA测序引物所结合。因此，在此所述的方法可以任选地包括使至少一个目标扩增子经受DNA测序。在某些实施方案中，该方法可以任选地包括对扩增混合物中目标扩增子的数量进行定量。这个步骤可以例如在自动化DNA测序之前实现。在具体实施方案中，定量包括回收目标扩增子以及使它们经受数字扩增。在具体实施方案中数字扩增包括将预扩增的目标扩增子分配到离散的反应混合物中，其中平均而言每个反应混合物包括每个反应混合物不大于一个扩增子；并且使这些反应混合物经受扩增作用。可以通过实时PCR和/或终点PCR进行数字扩增的定量。在此所述的扩增方法可以任选地包括确定每个样品中存在的每种目标核酸的数量。在某些实施方案中，这些方法可以在确定每个样品中目标核酸的拷贝数中得以实现。在多个具体实施方案中，这些方法可以在确定相应于目标核酸的基因座处的基因型中得以实现。在其他多个实施方案中，这些方法可以在确定目标核酸的表达水平中得以实现。在多个具体实施方案中，本发明涉及多种微流体装置。更具体地说，本发明涉及一种微流体装置，该微流体装置提供了反应产物的回收。仅通过举例，该方法和装置已经被用于一种PCR样品制备系统，该系统用于制备文库，该文库用于下一代测序。然而，应当认识到的是本发明具有广泛的多的可应用性范围。根据本发明的一个实施方案，提供了一种微流体装置。该微流体装置包括多个第一输入管线以及多个第二输入管线。该微流体装置还包括多组第一室以及多组第二室。每组第一室都与多个第一输入管线之一流体连通，并且每组第二室都与多个第二输入管线之一流体连通。该微流体装置进一步包括与多个第二输入管线的一个第一部分流体连通的多个第一泵元件，以及与多个第二输入管线的一个第二部分流体连通的多个第二泵元件。根据本发明的另一个实施方案，提供了操作微流体装置的一种方法，该微流体装置具有一个测定室、一个样品室、以及一个收集端口。该方法包括关闭测定室与样品室之间的流体管线，使样品通过样品输入管线流入样品室，并且使测定液通过测定液输入管线流入测定室。该方法还包括开放测定室与样品室之间的流体管线，使样品的至少一部分与测定液的至少一部分相结合从而形成一种混合物，并且使该混合物发生反应从而形成一种反应产物。该方法进一步包括将测定室与样品室之间的流体管线关闭，使收集试剂从收集端
1口流动到样品室中，并且从微流体装置中取出反应产物。根据本发明的一个具体实施方案，提供了制备多种反应产物的一种方法。该方法包括提供M个样品并且提供N个测定液。该方法还包括将M个样品与N个测定液混合从而形成M χ N配对组合。M χ N配对组合的每一个都被包含在一个封闭的体积内。该方法进一步包括从这些M χ N个配对组合中形成M χ N个反应产物，并且对这些M χ N个反应产物进行回收。与传统技术相比较，通过本发明多种益处得以实现。例如，本发明的多个实施方案提供了 M χ N个样品和测定液的混合以及反应，紧接着将反应产物回收到样品乘样品集合中。另外，使用膨胀泵以从微流体装置中基本上去除所有反应产物，这在不同反应产物集合之间提供了均勻性。与常规技术相比较，使用在此所述的系统以及方法降低了制备文库所需要时间以及工作强度。与下文以及附图相结合，本发明的这些以及其他实施方案连同它的多个优点以及特征一起将被更详细地予以说明。


通过参考下面说明书与说明本发明的某些具体实施方案的附图相结合可以理解本发明。图1以平面图的方式描绘了一个示例性的基质类型微流体装置。图2是允许回收反应产物的载体以及微流体装置的一个简化的透视图。图3是允许回收反应产物的微流体装置的一个简化的示意图。图4是图3中所示微流体装置的几个单元的一个简化的示意图。图5A是允许回收反应产物的微流体装置的一个简化的示意图。图5B是图5A中所示的微流体装置的多个部分的一个简化的示意图。图6是图5A中所示的微流体装置的几个单元的一个简化的示意图。图7是操作允许回收反应产物的微流体装置的方法的一个简化的流程图。图8A-8D是简化的示意图，这些示意图说明了在操作期间流体流动通过允许回收反应物产物的微流体装置的多个单元。图9A-9D是简化的示意图，这些示意图说明了在操作期间流体流动通过允许回收反应物产物的微流体装置。图10说明了在测序之前用于将目标核酸条形码化的一个3引物扩增方法的实施方案。图11显示了实例1中所述的凝胶的一个照片。泳道如下(2)分子标记、(4)用 454尾扩增的样品、(5)用4M尾扩增的样品(NTC)、(7)用A5引物对扩增的样品、⑶用A5 引物对扩增的样品(NTC)、(10)用3个引物扩增的样品、以及(11)用3个引物扩增的样品 (NTC)。图12显示了在实例4中在Access Array IFC(整合流体电路)上针对每个单独样品运行的从4个Agilent IK Biolanalyzer芯片中得到的凝胶视图的电泳图。该图中每个柱都显示在各样品中DNA产物的尺寸分布。所有样品都产生类似的产物分布。图13A-i;3B显示了来自实例4的结果。A)针对这组目标特异性引物所有PCR产物的预测尺寸。B)从Access Array IFC得到的样品集合之一的电泳图。单一产物集合中产物尺寸分布。所有产物都落在(B)中所示的预测尺寸范围内。图14A-14C显示了来自实例4的结果。A)在妨4序列运行上每个条形码计数的序列数。上面水平线表示&的每个条形码的计数平均数。下面水平线表示50%的每个条形码的计数平均数。B)每个扩增子的计数的序列数。图上每个点表示对于Access Array IFC 上单个室的序列在测序仪上测量的次数。三角形的点表示具有大于h平均表示的PCR反应。暗灰色点表示具有小于0. 平均表示的PCR反应。C)扩增子表示的频率分布。深灰色线表示在给定表示中存在的扩增子的数目。浅灰色线表示在给定的覆盖率下可以测量到的读取次数(例如，在20x覆盖率下为98% )。在2倍之内扩增子的百分比为平均95. 8%; 在5倍之内扩增子的百分比为平均99. 7% .。图15A-15B显示了使用具有引物结合位点和核苷酸标记的不同组合的4个外侧引物的多引物反应方案的一个实例。(实例5)。A)两个正向条形码引物(454B-BC-Tag8, 454A-BC-Tag8)和两个反向条形码引物(454A_BC_Tag5，4MB_BC_Tag8)与一个内侧引物对 (Tag8-TSF以及Tag5-TSR)相结合。B)从这个PCR反应形成的两个主要PCR产物。由于 PCR抑制，在每个末端上包含454-ATag8以及454A_Tag5或在每个末端上包含454B_Tag8以及454B-Tag5的PCR产物不产生显著的PCR产物。图16A-16B显示了针对图15B中每个扩增子而言每个引物序列在各自样品中的表示。在样品中将每个扩增子计数的序列数对于每个扩增子计数的平均数进行归一化。在A 和B乳液之间将单独扩增子的归一化的计数汇总，其中(A)是乳液A中Tag5扩增子加上乳液B中Tag 8扩增子，并且(B)是乳液B中Tag5扩增子加上乳液A中Tag 8扩增子。中间暗灰色线代表每个扩增子的平均表示。上面的浅灰色线代表^平均覆盖率。下面浅灰色线代表50%的平均表示。图17显示了来自实例6的结果使用设计用于Illumina GA II测序仪上的4引物策略成功地扩增PCR产物。列于表14中的条形码引物被标记为外侧短片段。图18显示了来自实例8的结果(当这些PCR反应是针对单独的模板特异性引物以及以4引物模式运行时，三个集合的10组PCR引物(A，B，C)的PCR反应)。在该4引物策略中较高分子量产物的存在证明成功的4引物组装。图19显示了来自实例8的结果(在使用内侧和外侧引物的多重4引物PCR中改变内侧和外侧引物的比率影响了产率)。
具体实施例方式在某些实施方案中，本发明提供了多种扩增方法，其中一个或多个核苷酸标记以及一个条码核苷酸序列被加入到目标核苷酸序列中。然后可以将加入的序列用作引物和/ 或探针结合位点。条形码核苷酸序列可以编码信息，例如像样品来源、它附连于其上的相关的目标核酸序列。标记和/或条形码化的目标核苷酸序列可以增加可针对在一个单一测定中一个或多个目标进行分析的样品的数量，同时将测定成本的增加降至最低。这些方法是特别适合用于增加微流体装置上进行测定的效率。在多个具体实施方案中，通过例如针对DNA测序引物添加结合位点，任选地紧接着针对DNA测序进行样品校准，使用这些方法来制备核酸用于DNA测序。在具体的示意性实施方案中，在允许回收反应产物的微流体装置中可以使用这种方法来针对DNA测序引物添加结合位点。在这种类型的示意性装置中，可以使用膨胀泵从微流体装置中基本上去除所有反应产物，这在不同反应产物集合之间提供了均勻性。因此，生成条形码化反应产物的多个集合是可能的，就体积以及拷贝数而言这些产物是均勻的。在不同实施方案中，体积和 /或拷贝数均勻性是这样的使得就体积和/或拷贝数而言，从该装置回收的每个集合的变率是小于约100 %、小于约90 %、小于约80 %、小于约70 %、小于约60 %、小于约50 %、小于约40%、小于约30%、小于约20%、小于约17%、或小于约15%、12%、10%、9%、8%、7%、 6%、5%、4. 5%、4%、3. 5%、3%、2. 5%、2%、1. 5%、1%、或 0. 5%。本领域普通技术人员应当理解到体积和/或拷贝数变率可以落在由这些值中任何一个所限定的任何范围内(例如约2%至约 % )。在一个示意性实施方案中，从微流体装置中回收的体积样品改变不大于约10%。标准的吸量误差是在5%至10%之间的数量级上。因此，在体积方面观察到的变率主要归因于吸量误差。与常规技术相比较，使用在此所述的系统以及方法降低了制备测序文库所需要时间以及工作强度。应当理解的是本发明不限于在此所述的这些具体的方法、实验方案、以及试剂等， 因为熟练的业内人士可以对这些进行改变。还应当理解的是在此使用的术语是仅用于说明具体的示意性实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围。还应当注意的是如在此以及随附的权利要求中所使用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一种”、“一个”、 以及“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个单元”是提及一个或多个单元以及本领域普通技术人员已知的它们的等效物。通过参考在附图中描述和/或说明的并且在下面说明书中详细说明的非限制性实施方案以及实例将更全面地说明本发明的实施方案以及它们的不同特征以及有利的细节。应当注意的是在附图中所述的特征不必按比例绘制，并且当熟练的业内人士可以认可时，一个实施方案的特征可以与其他实施方案一起使用，尽管在此没有清楚地说明。熟知的部件以及加工技术的说明可以省略以便不使本发明的实施方案变得不必要地模糊不清。^X除非另外说明，权利要求以及说明书中所使用的术语是如下面列出定义的。为了清楚的目的这些术语被专门地定义，但是所有这些定义都符合熟练业内人士如何理解这些术语的情况。术语“邻近”，当在此使用用于核酸中指两个核苷酸序列时，可以指核苷酸序列分开0至约20个核苷酸、更具体地说，在约1至约10个核苷酸的范围内，或直接地彼此邻接的序列。术语“核酸”是指核苷酸聚合物，并且除非另外限制，包括天然核苷酸的已知的类似物，这些类似物能够以与天然发生的核苷酸类似方式起作用(例如杂交)。术语核酸包括任何形式的DNA或RNA，包括例如基因组DNA ；互补DNA (cDNA)，互补 DNA是mRNA的一种DNA表示，通常通过信使RNA (mRNA)的逆转录、或者通过扩增而得到；合成方式或通过扩增生产的DNA分子；以及mRNA。术语核酸包括双链或三链核酸，以及单链分子。在双链或三链核酸分子中，核酸链不必共同延伸(即双链核酸不必沿着两个链的整个长度是双链的)。术语核酸还包括它们的任何化学修饰(例如通过甲基化和/或通过加帽)。核酸修饰可以包括加入化学基团，这些化学基团将额外的电荷、可极化性、氢键、静电作用、以及功能性结合到单独的核酸碱基上或结合到核酸上成为一个整体。这类修饰可以包括碱基修饰，例如2’ -位置糖修饰、5-位置嘧啶修饰、8-位置嘌呤修饰、在胞嘧啶环外胺上的修饰、 5-溴-尿嘧啶的取代、主链修饰、稀有碱基配对组合，例如异碱基类异胞苷以及异胍等。更具体地说，在某些实施方案中，核酸可以包括多聚脱氧核糖核苷酸类(包含 2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸类(包含D-核糖)、以及任何其他类型的核酸，该核酸是嘌呤或嘧啶碱的一个N-或C-糖苷、以及其他包含非核苷酸主链的聚合物，例如，聚酰胺(例如，核酸肽类(PNA))以及聚吗啉代(可从俄勒冈州科瓦利斯市的Anti-Virals公司以Neugene名称商购)聚合物、以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，其条件是这些聚合物包含处于一种构型的核碱基，该构型允许碱基配对以及碱基堆集，例如在DNA以及 RNA中发现的一样。术语核酸还包括锁核酸类(LNA)，在美国专利号6，794，499,6, 670，461、 6，262, 490、以及6，770，748中对这些锁核酸进行了说明，就它们的LNA的披露而言，这些专利通过引用以其全部内容结合在此。可以从完全化学合成方法(例如固相介导的化学合成)，从生物来源(例如通过从产生核酸的任何物种中分离)，或从涉及通过分子生物学工具(例如DNA复制、PCR扩增、逆转录)处理核酸的方法，或从这些方法的一种组合中得到一种或多种核酸。在此使用术语“目标核酸”是指在本发明的方法中有待检测的特定核酸。如在此使用的术语“目标核苷酸序列”是指一种分子，该分子包括一种目标核酸的核苷酸序列，像，例如，通过扩增目标核酸而得到的扩增产物或当将RNA目标核酸逆转录时所生成的cDNA。如在此使用的术语“互补”是指在两个核苷酸之间精确配对的能力。S卩，如果在一个给定位置上一个核酸的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸形成氢键，则这两个核酸被认为在该位置上是彼此互补的。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中仅一些核苷酸进行结合，或当单链分子之间存在完全互补性时，它可以是完全的。核酸链之间互补性的程度对于核酸分子之间杂交的效率以及强度具有显著影响。“特异性杂交”是指在定义的严格条件下一个核酸结合到一个目标核苷酸序列上， 不实质性地结合到杂交混合物中存在的其他核苷酸序列上。本领域普通技术人员应当知道放松杂交条件的严格性将允许容忍序列错配。在多个具体实施方案中，在严格杂交条件下进行杂交。术语“严格杂交条件”总体上是指在定义的离子强度和PH下对于特定序列而言温度在低于解链温度(Tm)从约 5°C至约20°C或25°C的范围内。如在此使用的，Tm是一个集合的双链核酸分子被半解离成单链的温度。用于计算核酸的Tm的方法在本领域中是熟知的(参见，例如，Berger and Kimmel(1987)METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 152 =GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, San Diego =Academic Press, Inc.禾口 Sambrook et al. (1989)MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL,2ND ED.，VOLS. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory), 两者都通过引用结合在此)。如标准参考文献所指出的，当核酸处于IM NaCl的水溶液中时，可以通过下面等式计算Tm值的简单估计Tm = 81.5+0.41(% G+C)(参见，例如，Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(1985))。杂交体的解链温度(以及因此用于严格杂交的条件)被多种因素影响，例如引物或探针的长度以及性质(DNA、RNA、碱基组成)以及目标核酸的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定的等)，以及盐和其他组分的浓度(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在与否)。这些因素的影响是熟知的并且在本领域中在标准参考文献中进行了讨论。适合用于实现大多数序列的特异性杂交的示例性的严格条件是在PH7至少约60°C的温度以及约0. 2摩尔的盐浓度。使用术语“寡核苷酸”是指一种核酸，该核酸是相对短的，总体上短于200个核苷酸、更特别地短于100个核苷酸、最特别地短于50个核苷酸。典型地，寡核苷酸是单链DNA 分子。术语“引物”是指一种寡核苷酸，在适宜的条件下(即在四种不同核苷三磷酸以及一种聚合反应试剂(例如，DNA或RNA聚合酶或逆转录酶)的存在下)在适宜的缓冲液中并且在适宜的温度下该寡核苷酸能够与一种核酸杂交(也称为“退火”)并且用作核苷酸 (RNA或DNA)聚合反应的起始位点。引物的适当的长度取决于引物的预期用途，但是典型地引物是至少7个核苷酸长度，更典型地范围从10个核苷酸至30个核苷酸，或甚至更典型地从15个核苷酸至30个核苷酸长度。其他引物可以是稍微更长的，例如30至50个核苷酸长度。在此上下文中，“引物长度”是指杂交到互补的“目标”序列上并且引发核苷酸合成的寡核苷酸或核酸的部分。短引物分子总体上需要更冷的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合体。引物不必反映模板的确切序列但是必须是足够互补的以与模板杂交。术语“引物位点”或“引物结合位点”是指引物杂交到其上的目标核酸的片段。如果引物、或它的一部分杂交到核酸中的一个核苷酸序列上，引物被说成退火到另一个核酸上。引物杂交到特定核苷酸序列上的陈述不旨在暗示该引物完全地或唯一地杂交到该核苷酸序列上。例如，在某些实施方案中，在此使用的扩增引物被说成“退火到核苷酸标记上”。这种说明包括完全退火到核苷酸标记上的引物以及部分地退火到核苷酸标记上以及部分地退火到邻近核苷酸序列(例如一个目标核苷酸序列)上的引物。这类杂交引物可以增加扩增反应的特异性。如在此使用的，选择引物“以便避免实质性地退火到目标核酸上”是指选择引物这样使得在扩增之后检出的大多数扩增子在下面意义上是“全长的”，即它们是从在目标核酸的每个末端上在预期的位点处启动而得到的，与从目标核酸内启动而得到的扩增子相反 (它们生成比预期更短的扩增子)。在不同实施方案中，选择引物从而至少阳％、至少60%、 至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97 %、至少98 %、或至少99 %是全长的。术语“引物对”是指一组引物，这组引物包括与有待扩增的DNA序列的5’末端的互补序列杂交的一个5’ “上游引物”或“正向引物”，以及与有待扩增的序列的3’末端杂交的一个3’ “下游引物”或“反向引物”。如本领域普通技术人员应当了解的，在具体实施方案中术语“上游”和“下游”或“正向”和“反向”不旨在进行限制，而是提供示意性的方向。“探针”是能够通过一种或多种类型的化学键(通常通过互补碱基配对，经常通过氢键形成)结合到互补序列的目标核酸上的一种核酸，因此形成一种双链结构。探针结合或杂交到“探针结合位点”上。探针可以用可检出的标记物进行标记以允许容易地检出探针，特别是一旦探针杂交到它的互补目标物上时。然而，作为替代方案，探针可以是未标记的，但可以是通过与直接地或间接地标记的配体特异性结合而可以检出的。在尺寸方面探针可以显著地改变。总体上，探针是至少7至15个核苷酸长度。其他的探针是至少20、30、或40个核苷酸长度。而其他探针是稍微更长的，为至少50、60、70、80、或90个核苷酸长度。 而其他探针仍然是更长的，并且是至少100、150、200或更多的核苷酸长度。探针还可以是任何长度，该长度在由上述值中任何一项所限定的任何范围内(例如，15至20个核苷酸长度)。引物或探针可以是与目标核酸序列完全互补的或可以是小于完全互补的。在某些实施方案中，在至少7个核苷酸的序列上，更典型地在10至30个核苷酸范围内的序列上，并且通常在至少14-25个核苷酸的序列上，该引物与目标核酸序列的互补序列具有至少65% —致性，并且更经常地具有至少75%—致性、至少85%—致性、至少90%—致性、或至少95 %、96 %、97 %、98 %、或99 % —致性。应当理解的是总体上令人希望的是某些碱基 (例如引物的3’碱基)是与目标核酸序列的相应的碱基完全互补的。在严格杂交条件下引物和探针典型地退火到目标序列上。在此使用术语“核苷酸标记”是指一种预定的核苷酸序列，该序列被加入到目标核苷酸序列中。该核苷酸标记可以编码关于该目标核苷酸序列的一项信息，例如目标核苷酸序列的身份或该目标核苷酸序列从中得到的样品的身份。在某些实施方案中，这类信息可以被编码到一个或多个核苷酸标记中，例如两个核苷酸标记的一个组合，在目标核苷酸序列的两个末端之一上的一个可以编码目标核苷酸序列的身份。如在此使用的术语“条形码引物”是指包括一种特异性条形码核苷酸序列的引物， 该核苷酸序列编码了关于当条形码引物被用于扩增反应时所生成的扩增子的信息。例如， 可以使用不同的条形码引物以从大量不同样品的每一个中扩增一个或多个目标序列，这样使得条形码核苷酸序列指示得到的扩增子的样品来源。如在此使用的，术语“编码反应”是指其中至少一种核苷酸标记被加入到目标核苷酸序列中的一种反应。例如可以通过一种“编码PCR”(其中至少一个引物包括一个目标特异性部分以及位于该目标特异性部分的5’末端上的一个核苷酸标记、以及一个第二引物， 该第二引物仅包括一个目标特异性部分或一个目标特异性部分和位于该目标特异性部分的5’末端上的一个核苷酸标记)加入核苷酸标记。关于可用于编码PCR的PCR方案的示意性实例，参见未决的WO申请US03/37808以及美国专利号6，605，451。还可以通过一种 “编码连接”反应(该反应可以包括一个连接反应，其中至少一个引物包括一个目标特异性部分以及位于该目标特异性部分的5’末端上的一个核苷酸标记，以及一个第二引物，该第二引物仅包括一个目标特异性部分或一个目标特异性部分和位于该目标特异性部分的5’ 末端上的一个核苷酸标记)来加入核苷酸标记。示意性的编码连接反应被描述于例如美国专利申请号2005/(^60640中，该专利通过引用以其全部内容结合在此(并且特别地是针对连接反应)。如在此所使用的一个“编码反应”生成了一个“标记的目标核苷酸序列”，该核苷酸序列包括连接到一个目标核苷酸序列上的一个核苷酸标记。如在此使用的，参考引物的一部分，术语“目标特异性”核苷酸序列是指在适当的退火条件下能够特异性退火到一个目标核酸或一个目标核苷酸序列上的序列。如在此使用的，参考引物的一部分，术语“核苷酸标记特异性核苷酸序列，，是指在适当的退火条件下能够特异性地退火到一个核苷酸标记上的序列。根据本发明传授的内容所述的扩增包括使至少一种目标核酸的至少一部分再生的任何手段，典型地是以模板依赖性方式，包括但不限于，用于线性或指数扩增核酸序列的广泛的技术。用于完成扩增步骤的示意性手段包括连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(LDR)、连接紧接着Q-复制酶扩增、PCR、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超支化链置换扩增、多重置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、两步多重扩增、滚环扩增 (RCA)、等，包括它们的多种形式以及组合，例如但不限于OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/ PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(也称为组合链反应-CCI )，等。除了其他来源之外,这类技术的说明可以在下面各项中找到Ausbel et al. ；PCR Primer =A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed.，Cold Spring Harbor Press (1995) ；The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience(2002) ；Msuih et al. , J. Clin. Micro. 34 :501-07(1996) ；The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley, ed. , Humana Press,Totowa, N. J. (2002)； Abramson et al.，Curr Opin Biotechnol. 1993Feb. ；4(1) :41_7，美国专利号 6，027，998 ; 美国专利号 6,605,451，Barany et al.，PCT
发明者安德鲁·梅, 梅甘·安德森, 王军, 菲奥娜·卡佩尔, 陈佩林 申请人:弗卢伊蒂格姆公司