专利名称：一种通过微小rna表达水平评估人同种异体移植物状况的方法
一种通过微小RNA表达水平评估人同种异体移植物状况的方法
本申请要求一项申请号为61/160，188，申请日为2009年3月13日的美国临时专利申请的优先权益，此临时申请的内容在此全文参考并入。
本申请所述的发明在美国国立卫生研究院的资助下完成，基金号为AI51652和 Al72790。美国政府享有本发明的某些权益。
发明背景
在过去短短的五十年中，器官移植已经由一项风险较高的实验性治疗发展成为一种安余的和能够挽救生命的治疗方法。然而，移植接受者需要使用非特异性的、有毒性的多种免疫抑制药物进行长期治疗，而且会因为移植器官存在免疫摊斥反应而一直生活在可能失去其网种异体移植物的阴影之下。
在人体问进行器官移植时产生的急性排斥反应是导致同种异体移植失败的重要风险因素。但是急性排斥反应的结果却很难预测。
目前，预测急性排斥反应能否对抗排斥治疗产生应答的最佳方法是通过芯针进行组织活检，取得同种异体移植物的组织，以观察其组织学特点。但是，进行组织活检的侵入性搡作会导致诸如出血、动静脉瘘、甚至移植物损失等并发症。因此，需要一种非侵入性测定方法，以确定移植器官出现急性排斥反应的患者是否存在丧失移植器官的风险。
发明概述
本发明满足了上述需求，在一个方面，其提供了一种对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的方法。本方法包括测定患者生物样本中非编码标记小RNA的表达量。本方法进一步包括比较患者非编码标记小RNA的表达量与非编码标记小RNA的参考表达量。
在一实施方式中，非编码标记小RNA选自SEQ ID NOs : 1_9，或其变体，其中与所述非编码标记小RNA的参考表达量相比，所述非编码标记小RNA表达量升高至少I倍时，即提示移植器官产生排斥反应的风险增加。
在另一个实施方式中，非编码标记小RNA选自SEQ ID NOs : 10_49，或其变体，其中与所述非编码标记小RNA的参考表达量相比，所述非编码标记小RNA表达量升高小于I倍时，即提示所述移植器官产生排斥反应的风险增加。
在另一个实施方式中，这种方法进一步包括(C)测定生物样本中非编码标记小 RNA的表达量与非编码标记小RNA的参考表达量之间的差异；(d)测定患者的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量；(e)测定患者的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量与内源性非编码参比小RNA的参考表达量之间的差异；(f)比较步骤 (c)中的差异与步骤(e)中的差异；其中步骤(c)中的差异大于步骤(d)中的差异时，进一步提示所述移植器官产生排斥反应的风险增加。
在另一个实施方式中，对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的方法包括(a)测定患者生物样本中非编码标记小RNA的表达量,所述非编码标记小RNA选自 SEQ ID NOs :1-9或其组合；(b)测定患者生物样本中内源性表达的菲编码参比小RNA的表达量；(C)比较步骤(a)的测定结果与步骤(b)的测定结果，以确定第一个比率；(d)测定带有非排斥器官的人体的生物样本中所述非编码标记小RNA的表达量，所述非编码标记小 RNA选自SEQ ID NOs :1_9或其组合；(e)测定带有非排斥器官的人体的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量，且比较步骤(d)的测定结果与步骤(e)的测定结果，以确定第二个比率；其中计算得到第一个比率比第二个比率至少高I倍时，即提示所述移植器官产生排斥反应的风险增加。
在另一个实施方式中，对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的方法包括(a)测定患者生物样本中非编码标记小RNA的表达量,所述非编码标记小RNA选自 SEQ ID NOs 10-49或其组合；(b)测定患者生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量；(c)比较步骤(a)的测定结果与步骤(b)的测定结果，以确定第一个比率；(d)测定带有非排斥器官的人体的生物样本中所述非编码标记小RNA的表达量，所述非编码标记小RNA选自SEQ ID NOs : 10-49或其组合；(e)测定带有非排斥器官的人体的生物样本中内源性表达的非编码参考小RNA的表达量，且比较步骤(d)的测定结果与步骤(e)的测定结果，以确定第二个比率；其中计算得到第一个比率比第二个比率高至少小于I倍时，即提示所述移植器官产生排斥反应的风险增加。
在另一个方面，本发明涉及一种用于对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的试剂盒。这种试剂盒包括至少一种与选自SEQ ID NO :l-49s或其变体的非编码标记小RNA互补的核酸分子，以及一种用于测定生物样本中非编码标记小RNA表达量的方式。
图1.对miRNA表达谱差异进行的无监督聚类分析和主成分分析能够区分人肾脏同种异体移植物的急性排斥反应组织活检样本与正常同种异体移植物组织活检样本。(A) 采用含有365个人成熟miRNA的引物对和TaqMan探针的微流控芯片，测定7份人肾脏同种异体移植物组织活检样本[3份样本显示出急性排斥反应(AR)的组织学特征，4份样本显示出正常同种异体移植物的组织活检结果(N)]中微小RNA(miRNA)的表达类型。在所有样品中，共有174±7个miRNA的表达水平具有显著性(即，Ct < 35)。性别、年龄、种族、移植类型以及从移植到组织活检的时间如下AR1 (男性，黑人，52岁，活体捐赠，161天)，AR2(男性，白人，32岁，活体捐赠，119天)，AR3 (女性，白人，48岁，尸体捐赠，31天)，NI (女性，黑人，40岁，活体捐赠，203天)，N2(男性，印第安人，50岁，活体捐赠，191天)，N3(男性，黑人，31岁，活体捐赠，196天)和N4 (男性，亚裔，51岁，尸体捐赠，88天)。根据表达类型的相似性，用无监督聚类分析对组织活检样本进行分组。组织活检样本表达类型的相关程度以图片顶部的树状图表示。分枝长度表示各样品(上部)或miRNA(左侧)之间的相似程度。两个主要的簇(上部)将AR组织活检样本与正常同种异体移植物组织活检样本精确分离。各列代表肾脏同种异体移植物组织活检样本的表达谱，各行代表miRNA。各格的颜色反映了与在组织活检样本的整体集合中相应miRNA的平均表达水平相比，相应样品中相应 miRNA的表达水平。红色强度增加表示给定样品中特定miRNA的表达量较高，绿色强度增加表示该miRNA的表达量较低。标尺(右下角)表示，给定样品中miRNA的丰度与所有样品中的平均水平之比。(B)根据在所有样本中具有显著性表达的174个小RNA( BP, Ct < 35)，对7个肾脏同种异体移植物组织活检样本进行主成分分析。PCA是一种用于减少多变量系统维度的双线性分解方法，其用于概述多变量数据中的簇。其将若干相关变量转化为被称为主成分(PC)的少数非相关变量。第一个PC用于解释数据中尽可能多的变异性，各后续成分用于解释尽可能多的剩余变异性。PCA显示了明显的聚类性，并且证实可以将AR样本从正常同种异体移植物组织活检样本中分离。通过PCl将样本精确分组，其解释了 miRNA 表达总体变异性的45. 91%，而PC2解释了变异性的21. 48%，且不能根据其诊断将样本分类。
图2. miRNA在急性排斥反应组织活检样本与正常同种异体移植物组织活检样本中的差异性表达，P值< O. 05。采用含有365个人成熟miRNA的引物对和TaqMan探针的徽流控芯片，测定7份人肾脏同种异体移植物组织活检样本[3份样本显示出急性排斥反应(AR)的组织学特征，4份样本显示出正常同种异体移植物组织活检的结果(N)]中微小 RNA(miRNA)的表达类型。各列代表肾脏同种异体移植物组织活检样本的表达谱，各行代表 miRNA。利用ABqPCR软件，鉴别在AR组织活检样本和正常同种异体移植物组织活检样本中差异性表达的miRNA。首先执行Ct过滤程序。当各组中50%以上样品的Ct值> 35时，则认为该实验为未检出。两组均为未检出的实验不包括在分析中。对于其余各实验，通过t 检验确定差异表达的miRNA。miRNA聚类树位于图的左侧。分枝长度表示各miRNA之间的相似程度。红色强度较高则表示表达水平较高。
图3.在人肾脏同种异体移植物的AR组织活检样本和正常同种异体移植物组织活检样本中验证微小RNA的表达差异。用含有9个急性排斥反应组织活检样本和17个正常肾同种异体移植物组织活检样本的独立验证集，测定了移植物内miR-142-5p、-155、-223、_ 10b、-30a_3p和let_7c的表达水平。表达水平的定量采用经改良的TaqMan miRNA实验，该方法可以绝对定量miRNA。使用稳定表达的RNU44小核仁RNA对miRNA的拷贝数进行归一化处理，并以miRNA的拷贝数对RNU44拷贝数的平均比率(土SE)表示。RNU44的拷贝数在 9个急性排斥反应组织活检样本(8. 87X 106±1. 48X IO6个拷贝/ μ g RNA)和17个正常同种异体移植物组织活检样本(8. 72X IO6±8. 42X IO5个拷贝/ μ g RNA,P = O. 92)之间不存在差异。采用t检验计算P值。
图4.人同种异体移植物组织活检样本中的miRNA与mRNA呈正相关。采用TaqMan miRNA实验来定量miRNA在移植物内的水平，采用实时定量PCR实验来定量mRNA在移植物内的水平，显示了 miRNA和mRNA在移植物内的水平之间的关系，还显示了皮尔森相关性系数(R2)和P值。⑶3mRNA的水平与在急性排斥反应组织活检样本中过表达的miRNA的水平被发现有明显的正相关(A)miR-142-5p(R2 = O. 72,P < O. 0001) ； (B)miR-155 (R2 = O. 69， P < O. 0001);或(C)miR-223(R2 = O. 66，P < O. 0001)。还观察到肾小管特异性 NKCC_2mRNA 与在急性排斥反应组织活检样本中低表达的miRNA呈现出相关性(E)miR-30a-3p (R2 = O. 53, P < O. 0001) ； (F)mif-1Ob (R2 = O. 36, P < O. 0001);或(G)let_7c(R2 = O. 13，P = O. 04)。显示了所有33个肾同种异体移植物组织活检样本的测定结果(红色，12个急性排斥反应组织的活检样本；绿色，21个正常同种异体移植物组织活检样本)。阈值循环(Ct)是指在miRNA/mRNA测定中突光信号越过固定阈值时的循环分数。
(D)mRNA(18S rRNA，24. 8±1. 3vs. 24. 7±1.1，P = O. 86，t 检验)和(H) miRNA (RNU44 小核仁 RNA，27. 1±0. 7vs. 27.1 ±O. 5，P = O. 97，t 检验)的内源性对照的平均(土SD)CT值在急性排斥反应样本中与在正常肾同种异体移植物样本中相似。
图5.静息或活化的正常人外周血单核细胞中miRNA的水平。外周血单核细胞 (PBMC)取自健康人，将其在不含(空心柱)或含有(实心柱)2 μ g/mL PHA的条件下培养 2处(六，卩和6) (η = 7名受试者)、48h(D) (η = 4名受试者)，或24、48和72小时(B，C，E，H 和I) (η = 2名受试者)，分离RNA进行miRNA定量(A-E)或mRNA定量(F-1)。采用RNU44 小核仁RNA的拷贝数对miRNA的拷贝数进行归一化处理，采用18S rRNA的拷贝数对mRNA的拷贝数进行归一化处理，结果显示为miRNA拷贝数对RNU44拷贝数的比值的平均值(土SE) 或mRNA拷贝数对18S rRNA拷贝数的比值的平均值(土SE)。采用配对t检验计算P值。
图6.静息或活化的正常人肾上皮细胞中miRNA的水平。将原代正常人肾上皮细胞(HREC)与静息PBMC的无细胞上清液(空心柱)或加入2 μ g/mL PHA的活化PBMC的无细胞上清液(实心柱)共同培养24h(A，B)或24和48h(C)。从HREC中分离总RNA，采用改良的TaqMan miRNA实验对急性排斥反应组织活检样本中过表达(A)或低表达(B或C)的 miRNA亚群进行定量。采用RNU44小核仁RNA的拷贝数对miRNA的拷贝数进行归一化处理， 结果显示为miRNA拷贝数对RNU44拷贝数比值的平均值(土SE)。结果来自两次连续实验， 采用来自两个人肾脏的两份独立的HREC原代培养物。采用配对t检验计算P值。
图7.静息或活化的正常人肾上皮细胞中趋化因子mRNA的水平。将原代正常人肾上皮细胞(HREC)与静息PBMC的无细胞上清液(空心柱)或加入2 μ g/mLPHA的活化PBMC 的无细胞上清液(实心柱)共同培养24h。从HREC中分离总RNA，采用实时PCR定量趋化因子单核细胞趋化蛋白-1 (MCPl)、受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)和平扰素诱导蛋白IO(IP-1O)的mRNA绝对水平。采用18S rRNA的拷贝数对mRNA的拷贝数进行归一化处理，结果显示为mRNA拷贝数对18S rRNA拷贝数比值的平均值(土SE)表示。结果来自两次连续实验，采用来自两个人肾脏的两份独立的HREC原代培养物。采用配对t检验计算P值。
图8.人肾脏同种异体移植物组织活检样本中移植物内的mRNA的水平。箱线图显示，在人肾脏同种异体移植物的12个急性排斥反应组织活检样本和21个正常同种异体移植物样本中，IFN-Y (A)和白介素_4⑶的mRNA拷贝数与18S rRNA拷贝数比值 的第10、第 25、第50 (中位数)、第75和第90百分位数值。与正常同种异体移植物组织活检样本相比， 急性排斥反应组织活检样本中IFN-Y的水平升高，但白介素_4的水平未升高。采用实时定量PCR实验来定量mRNA的绝对水平。采用t检验计算P值。
图9.尿细胞中miRNA 155的水平用于诊断急性排斥反应。从肾同种异体移植接受者的尿细胞中分离包含miRNA的总RNA，采用定量实时PCR实验来测定RNU44(管家基因) 和miRNA 155的水平。与来自移植物功能稳定和组织活检结果正常患者的尿液相比(η = 13个样本)，在组织活检样本分类为急性排斥反应患者的尿液中(η = 3个样本)，尿细胞中 miRNA 155的水平显著升高，而RNU 44未出现升高。
对发明内容的详细说明
本发明涉及采用微小RNA对器官排斥反应进行非侵入性测定的方法和组合物。发明人发现，器官衰竭(例如，急性排斥反应)会引起某些标记微小RNA(miRNA)过表达或低表达，等等。
在一个方面，本发明涉及一种对带有移植器官的患者进行器官排斥反应风险评估的方法。
带有移植器官的患者指带有移植的器官并且该器官的排斥反应风险将要被评估的任何人。
如本申请所述，移植器官指任何器官。示例性的器官包括肾脏、心脏、肝脏、肺、肠、 胰腺、胰岛等。
器官排斥反应指因反向免疫应答导致的移植器官的任何衰竭。例如，器官排斥反应包括急性和/或慢性排斥。器官的急性排斥反应事件可能由抗体介导或细胞介导的免疫应答引起。细胞介导的免疫应答反应中涉及的细胞包括，例如，活化的细胞毒性T细胞。如果患者未使用免疫抑制剂，则急性排斥反应事件通常发生在器官移植后的14天以内，更通常的发生在10天以内，特别通常的发生在5天以内。
但是，大部分，如果不是全部，接受移植的患者均使用了免疫抑制剂。这样，急性排斥反应事件通常发生在器官移植后约I年以内，更特别是发生在器官移植后约9个月以内， 尤其特别是发生在约6个月以内，以及最特别是发生在约3个月以内。然而，急性排斥反应可以发生在移植器官的生存期的任何时间。而且，一名患者的移植器官可能会发生不止一次的急性排斥反应事件。
非编码标记小RNA表达量的测定
这种方法包括测定患者的生物样本中非编码标记小RNA的表达量。
如本发明所述，非编码小RNA指不编码蛋白质的核糖核酸序列。例如，非编码小 RNA可能在细胞中发挥调节功能，利用与互补mRNA序列的序列特异性碱基配对从而调节基因表达。
非编码小RNA的长度小于约40个核苷酸，优选地小于约30个核苷酸，例如，长度约为29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个核苷酸。非编码小RNA的长度大于约10个核苷酸，例如，长度为11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。任意最大值均能与任意最小值进行组合，以定义一个范围。
非编码小RNA的例子包括，转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、微小RNA(miRNA)、 小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)和/或信号识别颗粒RNA复合物(SRP)。优选地，非编码小RNA为miRNA。
本发明所述的非编码标记小RNA是指用于评估器官排斥反应风险的非编码小 RNA0非编码标记小RNA的具体例子包括下述核酸分子和/或与下文所列举的序列至少约有 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一'I"生的核酸分子
miR-142-5p CAUAAAGUAGAAAGCACUAC(SEQ ID NO 1)
miR-142-3p UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA(SEQ ID NO 2)
miR-155 UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG(SEQ ID NO :3)
miR-146a UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU(SEQ ID NO :4)
miR-146b UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU(SEQ ID NO :5)
miR-342 UCUCACACAGAAAUCGCACCCGUC(SEQ ID NO :6)
miR-650 AGGAGGCAGCGCUCUCAGGAC(SEQ ID NO :7)
miR-21 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO :8)
miR-425-5p AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA(SEQ ID NO :9)
miR-30c UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC(SEQ ID NO :10)
miR-30a-3p CUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC(SEQ ID NO :11)
miR-lOa UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG(SEQ ID NO :12)
miR-30e-3p CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC (SEQ ID NO :13)
miR-30b UGUAAACAUCCUACACUCAGCU(SEQ ID NO :14)
miR-lOb UACCCUGUAGAACCGAAUUUGU(SEQ ID NO :15)
miR-32 UAUUGCACAUUACUAAGUUGC(SEQ ID NO :16)
miR-9 UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA(SEQ ID NO :17)·
miR-193b AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCUUU(SEQ ID NO :18)
miR-143 UGAGAUGAAGCACUGUAGCUCA(SEQ ID NO :19)
miR-489 AGUGACAUCACAUAUACGGCAGC(SEQ ID NO :20)
miR-27b UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC(SEQ ID NO :21)
miR-126 CAUUAUUACUUUUGGUACGCG(SEQ ID NO :22)
miR-193a AACUGGCCUACAAAGUCCCAG(SEQ ID NO :23)
miR-378 CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU (SEQ ID NO :24)
miR-429 UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU(SEQ ID NO :25)
miR-181c AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU(SEQ ID NO :26)
miR-196b UAGGUAGUUUCCUGUUGUUGG(SEQ ID NO :27)
miR-199a CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC(SEQ ID NO :28)
miR-660 UACCCAUUGCAUAUCGGAGUUG(SEQ ID NO :29)
miR-203 GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG(SEQ ID NO :30)
miR-204 UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU(SEQ ID NO :31)
miR-30e-5p UGUAAACAUCCUUGACUGGA(SEQ ID NO :32)
miR-30a-5p UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG(SEQ ID NO :33)
miR-30d UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG(SEQ ID NO :34)
miR-125b UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA(SEQ ID NO :35)
miR-130a CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU(SEQ ID NO :36)
miR-126 UCGUACCGUGAGUAAUAAUGC(SEQ ID NO :37)
miR-195 UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC(SEQ ID NO :38)
miR-26a UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGC(SEQ ID NO :39)
miR-26b UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGUU(SEQ ID NO :40)
miR-497 CAGCAGCACACUGUGGUUUGU(SEQ ID NO :41)
miR-152 UCAGUGCAUGACAGAACUUGGG(SEQ ID NO :42)
miR-141 UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG(SEQ ID NO :43)
miR-296 AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU(SEQ ID NO :44)
miR-365 UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU(SEQ ID NO :45)
miR-99a AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG(SEQ ID NO :46)
miR-100 AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG(SEQ ID NO :47)
miR-186 CAAAGAAUUCUCCUUUUGGGCUU(SEQ ID NO :48)
let-7a UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(SEQ ID NO :49)
miR-223 UGUCAGUUUGUCAAAUACCCC(SEQ ID NO :50)
let-7e UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU(SEQ ID NO :51)
miR-125a UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUG(SEQ ID NO :52)
miR-200a UAACACUGUCUGGUAACGAUGU(SEQ ID NO :53)
确定序列同一性的方法为本领域的公知常识。与本申请所列的非编码小RNA的核酸序列具有的核苷酸序列同一性百分比定义为，将候选序列与特定非编码小RNA序列进行序列比对，必要时引入空缺，以达到最大的序列同一性，此时候选序列中与特定非编码小 RNA序列中相同的核酸所占的百分比，任何保守性取代都不计入序列同一性。
可以通过本领域技术人员公知的多种途径进行序列比对，以确定核酸序列同一性的百分比，例如，采用公众能够获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定比对时采用的适宜参数，包括在被比对序列全长范围内为实现最大比对所需的任何算法。
然而，在本申请中，采用序列比较计算机程序NCB1-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 (1997))确定核酸序列同一性百分比(％ )。可以从美国国家生物技术信息中心的网站上下载NCB1-BLAST2序列比较程序，另外还可以从美国国立卫生研究院(Bethesda，Md)获得此程序。NCB1-BLAST2中采用了多个检索参数，所有这些检索参数均设定为默认值，包括，例如，暴露=是，链=全部，预期事件=10，最低复杂性长度=15/5，多途径e值=O. 01，多途径常数=25，最终有间隔的序列比对减少=25。
本发明所述的方法可以包括测定一种非编码小RNA的表达量，或者上述非编码小 RNA的某一组合的表达量。
非编码小RNA通常来自于患者的生物样本。如本发明所述，生物样本指取自患者的任何样本。生物样本的例子包括血液、尿液、各器官的组织样本和/或移植器官的组织样本。优选尿液样本。
非编码标记小RNA的参考表达量
本方法进一步包括将患者生物样本中测得的非编码标记小RNA的表达量与非编码标记小RNA的参考表达量进行比较。
在一个实施方式中，非编码标记小RNA的参考表达量可以通过测定在带有非排斥器官的人体中该非编码小RNA的表达量来获得。例如，带有非排斥器官的人体包括健康人。 优选地，健康人是指，与带有移植器官并且该器官的衰竭风险将要被评估的患者具有相似年龄、性别、种族、移植器官供体来源、Banff组织学分级接近和/或接受相同的初始抗排斥反应治疗的人。
带有非排斥器官的人体的另外一个例子是，带有功能良好(例如，稳定)的移植器官的人。功能良好(例如，稳定)的移植器官可以被定义为未出现器官衰竭(例如，排斥反应)的移植器官。优选地，功能良好的移植器官是指，未出现移植体机能异常或无形态学证据表明在移植体区域出现移植体损伤的移植器官。例如，功能稳定的肾脏移植体可以被定义为，在收集用于测定非编码小RNA的生物样本前7天和后7天这期间，其血清肌酸酐浓度的变化量不超过约O. 2mg每分升。优选地，带有功能良好(例如，稳定)移植器官的人是指，与带有移植器官并且该器官的衰竭风险将要被评估的患者具有相似年龄、性别、种族、移植器官供体来源、Banff组织学分级接近和/或接受相同的初始抗排斥反应治疗的人。
在另外一个实施方式中，参考量可以通过测定来自患者的另外一份生物样本中所述非编码小RNA的表达量来获得。例如，另外一份生物样本可以在所述患者进行器官移植前取得和/或取自所述患者的另外一个非排斥器官。
在又一个实施方式中，非编码小RNA的参考表达量是指本领域公认的非编码小 RNA的表达量。
与测得的非编码标记小RNA表达量进行比较
本方法包括将测得的非编码小RNA的表达量与该非编码小RNA的参考表达量进行比较。非编码标记小RNA可以是，例如，选自SEQ ID NOs : 1_53或其变体的非编码小RNA。 优选地，非编码标记小RNA选自SEQ ID NOs1:49，或其变体。
在一个更为优选的实施方式中，非编码标记小RNA是选自SEQ ID NOs :1_9或其变体的序列。例如，非编码标记小RNA包括选自miR-142-5p ；miR-142-3p ；miR-155 ；miR-223 ； miR-146a ；miR-146b ；miR-342 ；miR-650 ；miR-21 和 / 或 miR-425_5p 的非编码小 RNA,或其组合，其中与非编码标记小RNA的参考表达量相比，非编码标记小RNA的表达量升高至少I 倍时，即提示移植器官产生排斥反应的风险增加。在一个最优选实施方式中，非编码标记小 RNA 为 miR-142-5p ;miR-142_3p 和 / 或 miR-155。
表达量升高至少I倍可以是指，与非编码标记小RNA的参考表达量的升高量相比， 表达量升高至 少为约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 倍或以上。优选地，升高量为倍数值。用于定量表达量升高的示例方法是本领域的公知常识，参见下文中的一般方法章节。
在不同患者和不同类型的器官移植中，器官排斥反应的风险增加情况不同。一般情况下，与不存在器官排斥反应风险的人相比，增加的风险为至少约25%、至少约50%、至少约75%或至少约90%。
相反的，在一个实施方式中，选自SEQ ID NOs :1_9的序列或其变体的非编码标记小RNA的表达量比该非编码标记小RNA的参考表达量升高约小于I倍时，即提示移植器官产生排斥反应的风险降低。在不同患者和不同类型的器官移植中，器官排斥反应的风险降低情况不同。一般情况下，与不存在器官排斥反应风险的人相比，降低的风险为至少约 25%、至少约50%、至少约75%或至少约90%。
在另外一个优选的实施方式中，非标记编码标记小RNA选自SEQ ID NOs 10-49 中的序列或其变体。例如，非编码标记小RNA包括选自miR-30c ；miR-30a-3p ；miR-10a ； miR-30e_3p ;miR_30b ;miR_10b ;miR_32 ;miR_9 ;miR_193b ;miR_143 ;miR_489 ;miR_27b ； miR-126 ;miR_378 ;miR_429 ;miR_181c ;miR_196b ;miR_199a ;miR_660 ;miR_203 ;miR_204 ； miR-30e_5p ;miR-30a_5p ;miR_30d ;miR_125b ;miR_130a ;miR_126 ;miR_195 ;miR_26a ； miR-26b ；miR-497 ；miR-152 ；miR-141 ；miR-296 ；miR-365 ；miR-99a ；miR-100 ；miR-186 ；和 /或let_7a的非编码小RNA，其中与非编码标记小RNA的参考表达量相比，所述非编码标记小RNA的表达量升高小于I倍时，即提示移植器官产生排斥反应的风险增加。
表达量升高小于I倍可以是指，与非编码标记小RNA参考表达量的升高量相比，表达量升高至多为约O. 9、0. 8、0. 7、0. 6、0. 5、0. 4、0. 3、0. 2或O.1倍或以下。优选地，升高量为倍数值。用于定量表达量升高的示例方法是本领域的公知常识，参见下文中的一般方法早下。
相反的，在一个实施方式中，选自SEQ ID NOs 10-49中的序列或其变体的非编码标记小RNA表达量比该非编码标记小RNA的参考表达量升高至少约I倍或以上时，即提示移植器官产生排斥反应的风险降低。在不同患者和不同类型的器官移植中，器官排斥反应的风险降低情况不同。一般情况下，与不存在器官排斥反应风险的人相比，降低的风险为至少约25%、至少约50%、至少约75%或至少约90%。
采用内源性表达的非编码参比小RNA进一步提示器官排斥反应的风险增加
测定和比较内源性表达的非编码参比小RNA的量
在又一个实施方式中，评估器官排斥反应风险的方法进一步包括测定患者的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量。除此之外，这种方法包括测定生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的参考量。
如上文所述，参考量可以通过测定在带有非排斥器官的人体中，或者在来自该患者的另外一份生物样本中，该内源性表达的非编码参比小RNA的表达量来获得。在另外一个实施方式中，参考量是指，该内源性表达的非编码参比小RNA在本领域公认的表达量。
内源性表达的非编码参比小RNA是指一种内源性表达的非编码小RNA(例如，在患者、细胞和/或组织中表达)，且其在生物样本中的表达相对恒定和丰富。
选择和验证内源性表达的非编码参比小RNA的方法是本领域的公知常识。参见， 例如，美图应用生物系统公 司的TaqMan 微小RNA的测定实验。优选地，内源性表达的非编码参比小RNA是稳定的，其大小与待测非编码小RNA接近(例如，SEQ ID NOs :1_53)，且适用于测定表达的方式。
内源性表达的非编码参比小RNA的例子包括，RNU24、RNU66、RNU19、RNU38B、 RNU49、Z30、RNU6B、RNU4 8、RNU43和/或RNU44。优选地，内源性表达的非编码参比小RNA 为内源性的小核仁RNA RNU44。
测定标记RNA与参比RNA的表达差异
在一个优选实施方式中,本方法进一步包括测定生物样本中非编码标记小RNA表达量与非编码标记小RNA参考表达量之间的差异。例如，本方法能够包括测定患者生物样本中非编码标记小RNA的表达量与非编码标记小RNA参考表达量之间的差异。
如上文所述，参考量可以通过测定在带有非排斥器官的人体中，或者在来自该患者的另外一份生物样本中，该内源性表达的非编码参比小RNA的表达量来获得。在另外一个实施方式中，参考量是指，该内源性表达的非编码参比小RNA在本领域公认的表达量。
实施方式进一步包括测定生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量与该内源性表达的非编码参比小RNA的参考表达量之间的差异。或者例如，本方法包括测定患者生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量与该内源性非编码参比小RNA 参考表达量之间的差异。
如上文所述，参考量可以通过测定在带有非排斥器官的人体中，或者在来自该患者的另外一份生物样本中，该内源性表达的非编码参比小RNA的表达量来获得。在另外一个实施方式中，参考量是指，该内源性表达的非编码参比小RNA在本领域公认的表达量。
本实施方式进一步包括，比较(i)患者样本中非编码标记小RNA表达量与参考量之间的差异，和(ii)患者样本中内源性表达的非编码参比小RNA表达量与参考量之间的差异。当(i)中的差异(即，患者样本中非编码标记小RNA表达量与参考量之间)高于(ii) 中的差异(即，患者样本中内源性表达的非编码参比小RNA表达量与参考量之间)时，比较结果进一步提示移植器官出现排斥反应的风险升高。
优选地，当⑴中差异比(ii)中差异高至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20倍或以上时，提示移植器官出现排斥反应的风险升高。
在另外一个优选实施方式中，当⑴中差异比(ii)中差异高小于I倍时，例如，最多约O. 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2或O.1倍或以下，提示移植器官出现排斥反应的风险升闻。
相应地，本实施方式对应一个实施例，据此本领域技术人员可以测定和/或确定患者中非编码小RNA表达量的增加与参考量相比是否具有统计学意义。
归一化
在一个优选实施方式中，本发明包 括对非编码标记小RNA的表达量进行归一化处理。本方法包括依照如上所述的方法测定患者生物样本中非编码标记小RNA的表达量。本方法进一步包括测定患者生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量。除此之外，本方法包括比较患者菲编码标记小RNA的测定结果与患者内源性表达的非编码参比小 RNA的测定结果，以确定第一个比率。
本方法进一步包括测定带有非排斥器官的人体的生物样本中非编码标记小RNA 的表达量。本方法进一步包括测定带有非排斥器官的人体的生物样本中内源性表达的非编码参比小RNA的表达量。除此之外，本方法包括比较带有非排斥器官的人体的非编码标记小RNA的测定结果与带有非排斥器官的人体的非编码参比小RNA的测定结果，以确定第二个比率。
当计算得到的第一个比率比第二个比率至少高I倍时，计算结果提示带有移植器官的患者中所述移植器官出现排斥反应的风险升高。计算得到的第一个比率比第二个比率至少高 I 倍可以是指，高至少约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20倍或以上。
当计算得到的第一个比率比第二个比率高小于I倍时，计算结果提示带有移植器官的患者中所述移植器官出现排斥反应的风险升高。计算得到的第一个比率比第二个比率高小于I倍可以是指，高至多约O. 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2或O.1倍或以下。
相应地，在本实施方式中，所述非编码标记小RNA的变化倍数或等同参数采用内源性表达的非编码参比小RNA进行归一化处理。
血清肌酸酐和附加实施方式
在一个实施方式中，当移植器官为肾脏时，用于评估患者器官排斥反应风险的方法可以进一步包括确定患者体内血清肌酸酐蛋白的含量。血清肌酸酐含量可以用本领域公知的任意方法进行测定，如美国专利公开文本US20080131441中所述的方法，其在此参考并入。
在本实施方式中，将患者血清肌酸酐的检测结果与健康人或有功能良好(例如，稳定)移植体的人体的血清肌酸酐对照检测结果进行比较，参见U.S.专利公开文本 US20080131441，其在此参考并入。例如，在健康人或有功能良好移植体的人体中，血清肌酸酐的正常水平一般约为O. 8-1. 6毫克/分升。所述人可以是患者或患者以外的人。
没有必要在每次使用本方法时均测定对照样本中的肌酸酐水平。例如，可以将患者的血清肌酸酐水平与此前获得的一个或多个对照样本的检测结果进行比较，或者与实施本方法的内科医师或临床医师认可的水平进行比较，或由医疗委员会和/或执业医师判定。
在另外一个实施方式中，这种方法进一步包括告知患者其出现器官排斥反应的风险是否降低或增加。患者出现移植器官排斥反应的风险的信息是有用的。据此就能为患者开具处方和/或给予治疗，以避免排斥反应的发生和/或移植器官的损失。
在另外一个实施方式中，治疗包括给予患者有效剂量的药物组合物，以预防排斥反应的发生和/或移植器官的损失。此类药物组合物为本领域的公知常识，包括例如激素冲击疗法、抗体等。
例如，激素冲击疗法可以包括给药高剂量的皮质激素(例如，IOOmg以上)3至6 天。抗体疗法的例子包括给药多克隆抗体Thymoglobin或单克隆抗体0KT37至14天。
治疗方法的另外一个例子为血浆置换。血浆置换是将血液中的液体部分(即，血浆)与血细胞相分离的过程。通常，采用细胞分离器除去血浆。一般会将细胞回输至接受治疗的人体内，而弃去包含抗体的血浆。
本发明所述的各种方法和实施方式均可单独使用，或与其他方法的一种或多种或全部联合使用。
一般方法
患者或健康人的生物样本可以通过本领域公知的任意方法获得。除上文所述的例子以外， 生物样本的例子进一步包括移植组织的组织活检样本、血液、尿液、胆汁、支气管肺泡灌洗液和心包液。适宜的方法包括，例如，通过静脉穿刺获得血液样本、收集尿样以及经皮芯针抽吸组织活检。
本领域公知的任意方法均可以用于确定非编码小RNA的量。通常，从生物样本中分离总RNA。可以通过本领域公知的任意方法从样本中分离RNA。例如，商品化的试剂盒， 如购自 Molecular Research Center, Inc. (Cincinnati, OH)的 TRI Reagent ,或 Ambion 的mirVana miRNA分离试剂盒均可用于分离RNA。可以采用NanoDropND-1OOO型分光光度计测定RNA的收率和纯度。
可以采用本领域公知的任意方法对生物样本总mRNA中的非编码小RNA进行定量。 例如，涉及逆转录总RNA的动态定量PCR(例如，采用Taqman阵列人微小RNA芯片vl. O适用的Taqman Multiplex RT)以及聚合酶链式反应(PCR)。可以采用Applied BioSystems 7900HT型温度循环仪或其同类产品完成定量PCR，检测过程中使用生产厂商推荐的循环条件。简言之，采用特异性的非编码小RNA引物对总RNA样本进行逆转录获得cDNA，引物可通过TaqMan微小RNA检测(Applied Biosystems)获得，试剂来自TaqMan微小RNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)。
一般情况下，可以采用本领域公知的方法对分离得到的非编码小RNA进行扩增。 使用例如PCR或RT-PCR的方法的扩增系统为本领域公知。扩增技术的一般性概述，参见， 例如，Dieffenbach et al. , PCR Primer A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1995)。例如,可以采用动态定量PCR确定非编码小RNA的量。优选地，采用TaqMan微小RNA实验(Applied Biosystems)获得的cDNA样本来扩增PCR产物。
用于测定非编码小RNA表达量的另一种方法包括，使用分子信标以及其他可用于，例如多重PCR，的标记探针。在多重PCR检测中，PCR混合物含有指向非编码小RNA PCR 产物的引物和探针。通常，在实验中使用单个荧光染料。通过检测分子信标或探针确定非编码小RNA的量。分子信标的描述请见,例如，Tyagi和Kramer (Nature Biotechnology 14, 303-308，1996)以及Andrus和Nichols在U. S.专利申请
发明者M·苏桑瑟冉 申请人:康奈尔大学