专利名称：用于移植的同种异体皮肤的处理方法及由其制备的冷冻保存同种异体皮肤的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于移植的同种异体皮肤的处理方法及由其制备的冷冻保存同种异体皮肤。更详细地，涉及以二甲基亚砜(dimethyl s ulfoxide)、动物细胞培养基及胎牛血清(fetal bovine serum)为基本成分，在其中添加蔗糖(sucrose)，从而制得冷冻保护剂， 然后利用该溶液冷冻处理用于移植的皮肤组织的方法。
背景技术：
皮肤是覆盖整个人体表面的最大器官，其防止体液的流失，以及防止有害物质和微生物由外部进入，抵御来自物理、化学方面的刺激等，执行保护我们身体的功能。对于因严重的烧伤、外伤、上皮癌切除及皮肤疾病等而使皮肤严重受损的患者，应起到阻止受损部位感染及体液损失的保护膜的作用，同时应使患者的伤口部位不留下疤痕，防止在自然愈合过程中可能发生的严重收缩。用于使受损的皮肤组织再生的方法有以下三种移植患者自身皮肤的自体移植(autograft)、移植他人皮肤的同种异体移植(allograft)及移植动物皮肤的异种移植(xenograft)。这些方法中自体移植最为理想，但烧伤部位范围大的情况下，能够确保组织的部位有限，在取皮部位还会留下新的伤口，因此存在困难。同种异体移植与其说起到永久移植的作用，不如说起到有助于伤口周围区域的细胞移动和愈合的作用。特别是在表皮层、真皮层及直至皮下层受损的3度烧伤的情况下，必须要进行皮肤移植治疗。现在主要采用的皮肤移植治疗方法为自体移植方法，由于在摘除了皮肤的健康部位产生新的外伤，因此增加了患者的痛苦，需要很长时间痊愈，并且经济负担也大。此夕卜，如严重的烧伤患者没有足够的身体健康部位的情况下，存在无法采用自体移植方法或需要进行多次移植手术的问题。试图通过采用他人皮肤的同种异体移植或采用猪等其它动物皮肤的异种移植等来解决上述问题，但这样不仅会发生免疫排斥反应，还会带来其它多种副作用。并且，国内外医院实施的烧伤手术最普遍的情况为先将坏死的表皮层和真皮层去除，然后利用捐赠者尸体的皮肤，去除表皮后，利用去除了真皮内细胞的无细胞真皮进行皮肤移植，以消除免疫排斥反应。之后培养的角质细胞在其上完成完整的皮肤。这样完成的皮肤含有基膜层，因此能够像实际皮肤一样起到保护我们身体的作用，防止外界有害物质的进入。但是这种用于移植的皮肤价格非常昂贵，并且大部分为进口产品，存在供需不畅的问题。另外，目前广泛采用的用于处理从捐赠者身上摘取的皮肤的方法为对皮肤用不同浓度的甘油进行处理的甘油保存法，但该方法使细胞失去生命力而使得细胞存活率低，导致治疗时间长
发明内容
本发明要解决的技术问题因此，本发明的目的在于提供一种新的用于移植的同种异体皮肤的处理方法，并以此作为技术课题，该方法在对用于移植的皮肤进行加工时，与现有的甘油保存法相比，能够更加有效地提高细胞的存活率，使生物学性质的变化最小化。解决技术问题的技术手段为了实现上述目的，本发明提供用于移植的同种异体皮肤的处理方法，其包括下列步骤i)混合胎牛血清(fetal bovine serum)、动物细胞培养基及二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide)；ii)在上述溶液中溶解蔗糖(sucrose)，从而制得冷冻保护剂；iii)将上述冷冻保护剂浸透于分离的皮肤中；iv)将浸透了冷冻保护剂的皮肤在程序冷冻仪(controlled rate f reezer)中冷冻。本发明还提供由上述处理方法制得的冷冻保存同种异体皮肤。下面详细说明本发明。本发明的冷冻保护剂中使用的基本成分为二甲基亚砜、动物细胞培养基及胎牛血清。以重量为基准，本发明使用的二甲基亚砜、动物细胞培养基及胎牛血清优选的混合比为 1 3 5 4 6。本发明中，动物细胞培养基的混合比小于3时，会因为必需营养物质的缺乏而产生细胞死亡率增加的问题，如果大于5，冷冻时，由于发生冷害，会存在细胞死亡率增加的问题。本发明中，胎牛血清的混合比小于4时，由于防冷害血浆蛋白的缺乏，会发生冷冻时因冷害引起的问题，如果大于6，会因为血浆成分过多，会产生细胞活性方面的问题。以重量为基准，本发明使用的二甲基亚砜、动物细胞培养基及胎牛血清最优选的混合比为1 4 5。本发明的动物细胞培养基可以使用本领域公知的任意的培养基。本发明中可以使用的动物细胞培养基例如有MEM、DMEM、RPMI 1640、IMDM、特定角化细胞-无血清培养基(Defined Keratinocyte-SFM)(不含 ΒΡΕ)、角化细胞(Keratinocyte)-SFN (含 ΒΡΕ)、 敲除(KnockOut)D-MEM、AmnioMAX-II完全培养基、AmnioMAX-ClOO完全培养基等，但并不限于这些。本发明的冷冻保护剂是在上述混合有基本成分的溶液中溶解蔗糖(sucrose)而制得的。在本发明的冷冻保护剂中加入蔗糖，保护其免受冷冻细胞膜和细胞膜蛋白质时出现的冰晶的影响并使其稳定的作用。因此，根据本发明的处理方法制得的冷冻保存同种异体皮肤的细胞存活率能够得以提高，采用蔗糖、胎牛血清及二甲基亚砜的理想混合比，能够使细胞存活率得到更大的提高。本发明中的蔗糖优选为在上述混合有基本成分的溶液中以最终浓度为25 40重量％进行溶解。如果本发明的冷冻保护剂中的蔗糖浓度小于25重量％，会降低提高细胞存活率所需的细胞膜和膜蛋白质的保护及稳定等作用，如果大于40 重量％，会由于高浓度的糖(sugar)成分，诱发细胞死亡率的增加。本发明的冷冻保护剂最优选为使蔗糖在上述混合有基本成分的溶液中以最终浓度为30重量％进行溶解。本发明中，在皮肤组织中浸透冷冻保护剂可以使用本领域公知的多种方法，优选在低温反应器中，使冷冻保护剂浸透皮肤。浸透所需的时间根据皮肤组织的大小等有所不同，例如在4°C的低温反应器中，可以浸透约6 M小时。本发明中浸透了冷冻保护剂的皮肤可以使用程序冷冻仪(control led rate
4freezer)进行冷冻。冷冻时使用程序冷冻仪能够以期望的速度冷冻皮肤。本发明中使用程序冷冻仪冷冻皮肤的速度优选为-0. I0C /min至-7V /min，最优选为_1°C /min。本发明进行冷冻时，由于浸透了冷冻保护剂的皮肤的温度和程序冷冻仪腔室(chamber)的温度不能够相同，因此在冷冻时，由于从发生潜在熔化热的区域急速冷冻至没有水分子运动的-80°C 温度，其速度每分钟超过10°C，因此若不能够调节潜在熔化热，则会发生冰晶现象，使组织破坏。发明的效果根据本发明的处理方法制备的冷冻保存同种异体皮肤的细胞存活率高，细胞的生物学性质的变化也小，从而有助于移植部位快速生成肉芽组织，可以提高无细胞真皮的移植率并缩短治疗周期。
图1为示出使用TUNEL分析法对甘油保存皮肤(GPA)及冷冻保存皮肤(CPA)进行细胞死亡率分析的图表。图2为将甘油保存皮肤进行H&E染色后，用光学显微镜放大200倍后拍摄的照片， 图3为将冷冻保存皮肤进行H&E染色后，用光学显微镜放大200倍后拍摄的照片。图4为将甘油保存皮肤进行TUNEL染色后，用荧光显微镜放大100倍后拍摄的照片，图5为将冷冻保存皮肤进行TUNEL染色后，用荧光显微镜放大100倍后拍摄的照片。图6为示出使用TUNEL分析法，对细胞死亡率随蔗糖浓度差异的变化进行分析的图表。
具体实施例方式下面通过实施例进一步详细说明本发明。但这些实施例仅是为了帮助理解本发明而进行的例示，并不能限制本发明的范围。由于捐赠者(尸体)的人体皮肤组织的应用受到限制，因此使用了接近人体皮肤的猪皮，根据下述实施例及比较例的方法分别制备了 10份冷冻保存皮肤及甘油保存皮肤。实施例使用猪皮按照下述步骤准备冷冻保存皮肤。(1)用生理盐水洗净猪皮。(2)将猪皮分别切成5 X IOcm2的大小。(3)以1 4 5的重量比混合二甲基亚砜(Sigma，美国)、DMEM(GIBC0，美国)及胎牛血清(GIBC0，美国)。(4)加入蔗糖溶解，使(3)的溶液中蔗糖的最终浓度为30重量％，从而制得冷冻保护剂。(5)在(4)的冷冻保护剂中加入O)的猪皮。(6)准备 4°C 的低温反应器(P-039，KoaTech)。(7)在4°C的低温反应器中放入(5)的猪皮，然后浸透冷冻保护剂12小时。(8)将浸透好的猪皮和50ml的冷害保护剂放入聚酰胺袋(低温包装袋 (CryoBag)，奥利金(Origen)，美国)中。
(9)准备程序冷冻仪(14S-A，SY实验室，美国)。(10)将(8)的聚酰胺袋放入程序冷冻仪中，以-1°C /min的速度冷冻至_150°C。(11)冷冻结束后，直至分析实验前，将聚酰胺袋冷冻保存于绝热包装(Dry shipper)中。比较例使用猪皮按照下述步骤依次用50%的甘油及85%的甘油进行处理，从而准备甘油保存皮肤。(1)用生理盐水洗净猪皮。(2)将猪皮分别切成5 X IOcm2的大小。(3)将猪皮浸泡于用蒸馏水稀释的50%的甘油中72小时。(4)将(3)的皮肤在85%的甘油中浸泡72小时。实验例1利用TUNEL (脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling))
比较例准备的猪皮进行了分析。TUNEL分析是使用原位细胞凋亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit)，荧光素(Fluorescein) (Roche，德国)，并按照制造者的指示实施的。对细胞的死亡率进行分析的结果(结果为10个试样的平均值)如图1所示。用显微镜(奥林巴斯(Olympus)B)(51)拍摄了实施例及比较例的皮肤，示于图2、图 3、图4及图5。由图1的结果可以看出，与比较例相比，实施例的细胞死亡率要低4 5倍程度。此外，由图2、图3、图4及图5的显微镜照片可知，实施例中的细胞死亡显然低于比较例。S卩、本发明的处理方法与现有的甘油保存处理方法相比，显示出了高的细胞存活率，因此根据本发明的处理方法制备的用于移植的皮肤有助于移植部位快速生成肉芽组织，能够提高无细胞真皮的移植率并缩短治疗周期。实验例2为了观察本发明中细胞死亡率随蔗糖浓度差异的变化，除了将蔗糖浓度分别调至 5、10、15、20、25、30、35及40重量％来制备并使用冷冻保护剂以外，其余同上述实施例的方法来准备冷冻保存皮肤，然后利用TUNEL分析法进行分析。TUNEL分析是使用原位细胞凋亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit)，荧光素(Fluorescein) (Roche, 德国)，并按照制造者的指示实施的。荧光标记使用了 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚， 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)。对细胞的死亡率进行分析的结果如下表1所示，作为图表如图6所示。表 权利要求
1.用于移植的同种异体皮肤的处理方法，其包括下列步骤i)混合二甲基亚砜、动物细胞培养基及胎牛血清； )在上述溶液中溶解蔗糖，从而制得冷冻保护剂；iii)将上述冷冻保护剂浸透于分离的皮肤中；iv)将浸透了冷冻保护剂的皮肤在程序冷冻仪中冷冻。
2.根据权利要求1所述的用于移植的同种异体皮肤的处理方法，其特征在于，使蔗糖在上述步骤i)的溶液中以最终浓度为25 40重量％进行溶解。
3.根据权利要求2所述的用于移植的同种异体皮肤的处理方法，其特征在于，蔗糖的最终浓度为30重量％。
4.根据权利要求1所述的用于移植的同种异体皮肤的处理方法，其特征在于，以重量为基准，二甲基亚砜、动物细胞培养基及胎牛血清的混合比为1 3 5 4 6。
5.根据权利要求1所述的用于移植的同种异体皮肤的处理方法，其特征在于，动物细胞培养基选自 MEM、DMEM、RPMI 1640 及 IMDM。
6.根据权利要求1所述的用于移植的同种异体皮肤的处理方法，其特征在于，将冷冻保护剂浸透于分离的皮肤是在4°C的低温反应器中，浸透6 M小时。
7.根据权利要求1所述的用于移植的同种异体皮肤的处理方法，其特征在于，浸透了冷冻保护剂的皮肤在程序冷冻仪中，以-1°C /min的速度进行冷冻。
8.由权利要求1至7中任一项所述的方法处理得到的冷冻保存同种异体皮肤。
全文摘要
本发明涉及用于移植的同种异体皮肤的处理方法及由其制备的冷冻保存同种异体皮肤。更详细地，涉及以二甲基亚砜、动物细胞培养基及胎牛血清为基本成分，在其中添加蔗糖，从而制得冷冻保护剂，然后利用该溶液冷冻处理用于移植的皮肤组织的方法。
文档编号A01N1/02GK102480935SQ201080033190
公开日2012年5月30日 申请日期2010年6月11日 优先权日2009年7月22日
发明者崔源益, 田旭, 郑载得 申请人:Cg生物技术有限公司