专利名称：利用蚯蚓的性腺再生能力的转基因蚯蚓的养殖方法，通过该养殖方法养殖的转基因蚯蚓 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用蚯蚓的性腺再生能力的转基因蚯蚓的养殖方法，通过该养殖方法养殖的转基因蚯蚓以及从转基因蚯蚓的体液生产重组蛋白质的方法。
背景技术：
在以往的转基因法(transgenesis)中，大体上存在体细胞转基因和生殖细胞转基因。体细胞转基因是新遗传特性体现在处置动物上，但不传递至下一代的方法，生殖细胞转基因是将新型基因直接嵌入到生殖细胞或者诱导转基因细胞使其转移为生殖细胞来持续表达新遗传特性的方法。作为生殖细胞转基因法可举例原核注射法、病毒载体利用法、胚胎干细胞利用法、 核移植法及试管婴儿法等。上述原核注射法是在受精卵的核中注入新基因而实现植入，来构建转基因体的方法，此时，在被植入的受精卵的细胞分裂时期，向染色体随机嵌入基因来呈现其特性。该方法最简单而且呈现比较高的效率，因此目前在产业上最广泛使用(Gordon Jff, Ruddle FH, 1981. Science 214 :1244246 ；Hammer RE, Pursel VG, Rexroad CE, Jr, Wall RJ, Bolt DJ, Ebert KM, et al. 1985. Nature 315:68083)。但是，与通过新基因的表达来获得新特性，与此相反，因随机的嵌入而难以调节表达率，而且具有无法获得准确的结果的缺点。上述病毒载体利用法与原核注射方法十分类似，但不直接注入新基因，而是利用非毒性处理病毒载体来构建重组基因，并通过强有力的病毒的感染方法来构建转基因体的方法。该方法由于具有十分高的基因注入效率，因而被使用为针对人的基因治疗法，但是由于如同原核注射法那样进行随机嵌入，因而具有难以调节表达的缺点(Jaenisch R,Fan H， Croker B,1975. Proc Natl Acad Sci USA 72 :4008012 ；Robertson Ε,Bradley A,Kuehn Μ, Evans Μ,1986. Nature 323 :44548)。上述胚胎干细胞利用法是将在具有全能性的胚胎干细胞的未分化细胞上采用新基因来转基因的胚胎干细胞移植到新的受精卵时，胚胎发育过程中被移植的胚胎干细胞被分化为生殖细胞，以使转基因动物出生的方法。该方法由于具有能够将新基因注入到个体的特定部位的特征，一般使用于研究用转基因动物的生产。并且，由于通过该方法所生产的转基因动物用于调节特定遗传部位，因而具有在产业上或者医学方面利用的范围十分广泛的优点，与此相反，远比其他方法消耗更多的时间和费用，目前除了啮齿类以外，针对其他动物还未确立构建方法(Martin GR, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78:7634638; Thomas KR,Capecchi MR,1987. Cell 51 :50312 ；Nagano Μ,Brinster CJ,Orwig KE,Ryu BY, Avarbock MR, Brinster RL,2001. Proc Natl Acad Sci USA98 :130903095)。上述核移植法是通过克隆羊多莉名扬四方的方法，而且是去除未受精卵的核之后移植供与细胞的核，由此在代生母(动物)的体内发育为个体的方法。该方法使用于核供与细胞，即从源于受精卵的未分化细胞到体细胞为止几乎不受限制地使用，具有能够暂时复制生产大量转基因动物的优点，与此相反，需要解决具有十分低的生产效率和死产及畸形分娩等问题(Willadsen SM, 1986. Nature 320 635 ；Schnieke AE,Kind AJjRitchie WA, Mycock K, Scott AR, Ritchie Μ, Wilmut I，et al.，1997.Science 278 :2130133 ；Cibelli JB, Stice SL, Golueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, et al. , 1998. Science 280 1256258)。上述试管婴儿法是人们都非常熟悉的方法，是让精子和卵子在体外受精之后移植到母体子宫内发育成胎儿的方法。通过应用该过程生产转基因动物，如果执行体外受精之前在精子的头部附着新基因之后与卵子实现受精，则由被注入的新基因来表达特性，使得能够生产转基因动物。该方法在以往的转基因动物生产技法中最简便且不需要昂贵的设备，但是目前为止成功事例不多，并且具有限制性，即仅能进行随机的基因变形(Brackett BG, Baranska W, Sawicki W, Koprowski H,1971. Proc Natl Acad Sci USA 68:35357; Maione B, Lavitrano M, Spadafora C, Kiessling AA,1998. Mol Reprod Dev 50 40609 ； Rieth A, Pothier F, Sirard MA,2000. Molecular Reproduction and Development57 33845 ；Celebi C, Guillaudeux Τ, Auvray P, Val1et-Erdtmann V, Jegou B,2003. Biol Reprod 68 :1477483)。但是，上述提及的所有方法在构建转基因体时需要很多时间和费用，而且需要昂贵的设备和娴熟的研究人力。另一方面，蚯蚓是被称为土龙、地龙或白颈蚯蚓的贫毛纲的环节动物，是身上具有雌性生殖器官和雄性生殖器官的雌雄同体，在各地的肥沃的湿地带的土壤中摄取有机物生活。据报道，这种蚯蚓在全球上分布约为2700多种，在韩国栖息约为60多种。由东医宝鉴或本草纲目等药学史上的巨著所知，蚯蚓含有药用成分，具有溶血及解热等疗效，并对肠内寄生虫的灭杀、解热作用、发狂、黄疸、季节性传染病、咽喉炎等十分有效。并且，已知蚯蚓在部分种类当中具有再生能力。蚯蚓的再生受到出现在不包括重要器官的环带以后的部位， 根据种类呈现多种再生能力。但是，部分研究人员主张在环带之前的器官上也能再生的学说，然而还未公开相关的其生物学机制和方法。并且，目前为止还未开展关于利用蚯蚓的再生能力的转基因技术的研究。因此，目前需要开发出利用蚯蚓的再生能力的转基因方法。
发明内容
技术问题本发明者针对通过弥补以往的转基因技术的缺点而减少时间和费用来简便地构建转基因体的方法进行研究的过程中，确认了切断蚯蚓的包括性腺的前半部之后诱导再生来形成再生母细胞，在再生初期向蚯蚓的再生母细胞部位注入重组基因表达载体来养殖已转基因的蚯蚓，并从已转基因的上述蚯蚓的体液生产重组蛋白质等问题，从而完成了本发明。解决问题的手段本发明的目的在于提供一种利用蚯蚓的性腺再生能力的转基因蚯蚓的养殖方法。并且，本发明的目的在于提供一种通过上述方法来养殖的转基因蚯蚓。
并且，本发明的目的在于提供一种从上述转基因蚯蚓的体液生产重组蛋白质的方法。
图1是表示用光学显微镜来观察切断掘穴环爪蚓(Perionyx excavatus)的包括性腺的前半部之后经过6小时之后生成的再生母细胞(箭头部分)的结果的图。图2是表示用光学显微镜来观察切断掘穴环爪蚓的包括性腺的前半部之后大约经过30天之后在再生部位上再生精巢和卵巢的现象的结果的图。图3是表示本发明的重组基因表达载体(pCMV-hEPO，pCMV-hGH)的引进示意图的图。图4是表示通过已转基因的蚯蚓的基因组(genomic) DNA PCR的hEPO基因的检测的图。图5是表示通过已转基因的蚯蚓的基因组(genomic)DNA PCR的hGH基因的检测的图。图6是表示通过免疫印迹方法分析从已转基因的蚯蚓的体液中分离的人重组蛋白质(hEPO)的表达与否的结果的图。图7是表示通过免疫印迹方法分析从已转基因的蚯蚓的体液中分离的人重组蛋白质(hGH)的表达与否的结果的图。图8是表示通过皮下注射及腹腔注射方式将从蚯蚓体液萃取的hEPO注入到小鼠身上之后的血红素含量变化的图。图9是表示通过免疫印迹方法检查口服从蚯蚓体液萃取的hEPO的小鼠的血红素含量变化和hEPO是否存在于血液的结果的图。
具体实施例方式本发明提供一种利用蚯蚓的性腺再生能力的转基因蚯蚓的养殖方法，该养殖方法包括如下步骤步骤(1)，切断蚯蚓的包括性腺的前半部之后诱导再生来形成再生母细胞； 步骤O)，在pCMV EGFP-Cl载体中引进靶基因来制备重组基因表达载体；以及步骤(3)，向在上述步骤(1)中切断之后M小时以内开始再生的蚯蚓的再生母细胞部位注入在上述步骤O)中制备的重组基因表达载体之后进行继代培养，来养殖已转基因的蚯蚓。并且，本发明提供一种通过上述方法来养殖的转基因蚯蚓。并且，本发明提供一种重组蛋白质的生产方法，该生产方法包括如下步骤步骤 (1)，从上述转基因蚯蚓获得蚯蚓体液；步骤( ，向在上述步骤(1)中获得的蚯蚓体液加入裂解缓冲液(lysis buffer)，在搅拌器中进行均质粉碎来获得均质液；步骤(3)，对上述均质液进行离心分离，并通过沉淀获得重组蛋白质；以及步骤G)，对所获得的上述重组蛋白质进行纯化及分离。下面，对本发明进行详细的说明。本发明的利用蚯蚓的性腺再生能力的转基因蚯蚓的养殖方法，其特征在于，切断蚯蚓的包括性腺的前半部之后诱导再生来形成再生母细胞，在再生初期向蚯蚓的再生母细胞部位注入重组基因表达载体来养殖已转基因的蚯蚓。
上述蚯蚓只要前半部包括性腺的蚯蚓即可，所谓的上述前半部是指通常包括环带部位为止的意思。上述蚯蚓均能包括在环节动物门(Annelids)中属于多毛纲 (Polychaeta)和贫毛纲(Oligochaeta)的所有蚯蚓，在本发明中尤其是优选采用掘穴环爪虫引(Perionyx excavatus)或线虫引禾斗的一禾中虫丘虫引(Enchytraeus japonensis)。作为上述靶基因包括生长激素、人促生长激素释放激素、性腺激素、促性激素释放激素、干扰素类、干扰素受体类、集落刺激因子、白细胞介素类、促红细胞生成素、胰岛素、血管紧张素、血小板生成素、瘦素、视黄醇结合因子、脂联素、骨形成生长因子、B细胞因子、T 细胞因子、神经生长因子类、细胞表面抗原、单克隆抗体、源于病毒的疫苗抗原、凝血调节因子、催乳素、肥胖抑制调节因子、超氧化物歧化酶(SOD)以及蛋白水解酶等，但并不局限于此。在本发明中优选采用人促红细胞生成素(human erythropoietin,hEPO)和人生长激素 (hGH)。并且，本发明能够从通过上述方法来转基因的蚯蚓的体液大量生产重组蛋白质。 具体而言，从上述转基因蚯蚓获得蚯蚓体液之后，其中加入裂解缓冲液，在搅拌器进行均质粉碎来获得均质液，然后对上述均质液进行离心分离，通过沉淀获得重组蛋白质，并对所获得的重组蛋白质进行纯化及分离。上述蚯蚓体液能够利用选自以下方法中的一种方法来从蚯蚓中萃取而得。(1) 利用乙醇来进行萃取的方法；( 利用包括冷水及温水的温度调节装置的温度偏差来进行萃取的方法；C3)利用包含食盐的盐来进行萃取的方法；(4)利用体液萃取缓冲液(body fluid extraction buffer)来进行萃取的方法；以及(5)利用电击来进行萃取的方法。上述重组蛋白质通常包含生理活性多肽，能够举例激素、细胞因子、白细胞介素、 白细胞介素结合蛋白质、酶、抗体、生长因子、转化调节因子、血液因子、疫苗、结构蛋白质、 配体蛋白质或受体、细胞表面抗原、受体拮抗剂等多种蛋白质及其衍生物及类似物。具体而言，包含生长激素、人促生长激素释放激素、性腺激素、促性激素释放激素、干扰素类、干扰素受体类、集落刺激因子、白细胞介素类、促红细胞生成素、胰岛素、血管紧张素、血小板生成素、瘦素、视黄醇结合因子、脂联素、骨形成生长因子、B细胞因子、T细胞因子、神经生长因子类、细胞表面抗原、单克隆抗体、源于病毒的疫苗抗原、凝血调节因子、催乳素、肥胖抑制调节因子、超氧化物歧化酶(SOD)以及蛋白水解酶等，但并不局限于此。在本发明中优选采用人促红细胞生成素(hEPO)和人生长激素(hGH)。本发明的利用蚯蚓的性腺再生能力的转基因蚯蚓的养殖方法，通过用于弥补以往转基因技术的缺点的形态的新型生命工程技法，并利用具有高注入有效性和如胚胎干细胞等全能性的再生母细胞，能够在转基因体的所有部位嵌入重组基因，由此能够通过转基因体的体液来生产重组蛋白质，由于向性腺直接投入靶基因，因而无需代生母(动物)，由于利用能够进行生殖的转基因体，因而能够持续生产多个转基因体，远比以往的转基因技术更加简便，而且不需要昂贵的设备及娴熟的技术。用于实施发明的实施方式下面，将要公开优选的实施例，便于理解本发明。然而，以下实施例只是为了更加容易地理解本发明而提供的，本发明的内容并不局限于实施例。实施例1 诱导掘穴环爪蚓的性腺的再生为了诱导掘穴环爪蚓(Perionyx excavatus)的包括性腺的前半部的再生，切断了掘穴环爪蚓的包括性腺的环带部位后面的第5 15节处中的头部分。在铺开用水润湿的纸巾而维持70%的湿度的戴盖的试验仪器上放置被切断的蚯蚓，在调节为23士2°C的恒温槽中饲养。为了确认是否从蚯蚓的切断部位生成再生母细胞，按照各个不同再生时期制备冰冻切片组织，用光学显微镜来观察。并且，通过光学显微镜观察到了前半部完全再生的蚯蚓通过生殖活动生产卵巢(包括3-4个受精卵的囊)。在图1中表示了用光学显微镜观察切断掘穴环爪蚓的包括性腺的前半部之后经过6小时后生成的再生母细胞(箭头部分)的结果，在图2中表示了用光学显微镜观察切断掘穴环爪蚓的包括性腺的前半部之后在再生部位再生精巢和卵巢的结果。如图1所示，掘穴环爪蚓的再生母细胞(箭头部分)，在切断头部分之后6小时以内开始形成，12 18小时以内活跃分裂。并且，如图2所示，确认了掘穴环爪蚓的再生母细胞切断头部分之后大约经过30 天之后，蚯蚓的被切断的前半部完全再生，在再生部位形成新的精巢和卵巢。实施例2 靶基因的克隆以及重组基因表达载体的制备为了确保以往在 NCBI (National Center of Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)中告知的人促红细胞生成素(hEPO)和人生长激素(hGH)的基因， 基于以往碱基序列分别设计了靶基因特异性正义引物和反义引物(ΕΡ0 :5' -NNN CTC GAG ATG GGG GTG CAC GAA TGT CCT GCC TGG CTG-3‘ ，5' -NNN GTC GAC TCT GTC CCC TGT CCT GCA GGC CTC CCC TGT-3‘ ；GH 5' -NNN GCT AGC ATG GCT ACA GGC TCC CGG ACG TCC-3‘，5' -NNN GTC GAC CTA GAA GCC ACA GCT GCC CTC CAC-3‘；包含限制酶部位)。 将利用市场售卖的人体细胞mRNA(美国英杰生命技术有限公司)来制作的cDNA作为模板执行PCR(条件94°C，5分钟；35电路的94°C，30秒；60°C，30秒；72°C，1分钟)，通过1 %琼脂糖凝胶电泳确认了 PCR的生成物。利用HiYield 凝胶/聚合酶链式反应脱氧核糖核酸抽提试剂盒(HiYield gel/PCR DNA Extraction Kit)(实质性基因组学Real Genomics) 对PCR生成物进行纯化，将已纯化的PCR生成物的全长cDNA嵌入到pGEM T-伊西克隆载体 (pGEM T-easy cloning vector)(普洛麦格生物技术有限公司Promega)。将嵌入靶基因的载体转基因为大肠杆菌感受态细胞(E. coli DH5 α )之后，在5ml的LB培养基中培养16 小时已形成的白色群体。从利用质粒抽取试剂盒(Plasmid spin kit)(杰美基因医药科技有限公司=Genmed)来培养的细胞萃取质粒，并利用限制酶EcoRI来切断被分离的质粒。切断后执行琼脂糖凝胶电泳来确认hEPO和hGH基因的嵌入，确认嵌入状态的载体利用Sp6反向引物和T7正向引物来最终决定了碱基序列。为了采用靶基因而表达，需要利用“黄瓜花叶病毒启动子”基因表达系统(‘CMV promotor ‘ gene expression system)，因此选定 pCMV EGFP-Cl 载体(克隆技术 Clontech)来制备重组基因。首先，用限制酶NheI和BamHI来切断而去除载体中所包含的绿色荧光蛋白质(EGFP)标记基因。并且，用如同上述的限制酶来切断靶基因中所包含的克隆体，由此分辨萃取靶基因。混合上述载体和靶基因之后，在4°C下，用T4DNA连接酶(Iigase) 来制备16小时重组基因(pCMV-hEP0，pCMV-hGH)。将其重新转基因到大肠杆菌宿主来大量增幅，并对该重组基因进行纯化，从而用作转基因载体。在图3中表示上述制备的重组基因表达载体(pCMV-hEPO，pCMV-hGH)的引进示意图。
实施例3 确认已转基因的蚯蚓(Pex-hEPO，Pex-hGH)的养殖及表达切断掘穴环爪蚓的包括性腺的前半部之后，在M小时以内向开始再生的蚯蚓的再生母细胞部位，以0. 3 0. 5 μ g/ μ e的浓度注入在上述实施例2中制备的重组基因表达载体(pCMV-hEPO，pCMV-hGH)，在初期再生期间，利用两周的时间持续供给充分的水分的同时进行继代培养。为了重新给完成一定程度初期再生的蚯蚓供应饲料，将其放入于通过规定方法造成的土壤之后，在湿度及温度分别自动调节为湿度70%及温度23士2°C的恒温槽中饲养。将上述已转基因的蚯蚓分别命名为Pex-hEPO和Pex-hGH。3-1.在已转基因的蚯蚓的基因组DNA (genomic DNA)中检测靶基因为了确认靶基因是否成功嵌入到已转基因的蚯蚓的基因组DNA，执行如下实验。将结束再生的转基因蚯蚓在铺开湿的纸巾的试验箱中放两天，空出蚯蚓的内脏之后，重新切断再生的前半部，按照El Adlouni等(1995，Mole and Cell Biochem 142 19-23)的方法萃取了蚯蚓的基因组DNA(genomic DNA)。将萃取的基因组DNA(genomic DNA) 作为模板对其执行PCR(条件94°C，5分钟；35电路的94°C，30秒；60°C，30秒；72°C，1分钟)，利用琼脂糖凝胶电泳来确认作为PCR的生成物的hEPO和hGH基因的嵌入。在图4及图5中分别表示通过已转基因的蚯蚓的基因组DNA(genomic DNA)PCR的 hEPO和hGH基因的检测。如图4及图5所示，已确认作为PCR生成物的hEPO基因在582bp中出现，hGH基因在654bp中出现。3-2.从嵌入到已转基因的蚯蚓的靶基因检验人重组蛋白质(hEP0，hGH)的表达为了确认是否从嵌入到已转基因的蚯蚓的靶基因表达人重组蛋白质(hEP0，hGH)， 执行了免疫印迹(immimoblotting)分析。使用100%乙醇(美国默克集团Merck)从已转基因的蚯蚓萃取蚯蚓的体液，在萃取液中加入裂解缓冲液(lysis buffer)，在搅拌器中以 300 500rpm的速度进行均质粉碎。以13000rpm的速度对均质液进行10分钟离心分离，并通过丙酮沉淀法获得水溶性蛋白质。用puredown 免疫共沉淀试剂盒(puredowWrotein A/G agarose kit)(美国萬造生技股份有限公司GenD印ot)来对获得的蛋白质进行纯化，并通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离蛋白质，使用微型凝胶转移试剂盒(Mini-gel transfer kit)(伯乐生命医学产品有限公司=Bio-Rad)，在70V下利用1小时的时间将经过电泳的凝胶传递至聚偏氟乙烯膜(PVDF membrane)。用1 X TBST淘洗传递分辨的蛋白质的膜(membrane)之后，在以1 2000比率稀释标记蛋白质和第一抗体的封阻溶液 (blocking solution)中浸渍1小时并进行搅拌。重新用TBST隔着每15分钟清洗4次， 然后使上述膜与以1 5000比率稀释标记蛋白质和第二抗体的封阻溶液充分反应，并用 TBST隔着每15分钟清洗4次。为了观察是否存在标记蛋白质，用增强化学发光法(ECL: enhanced chemiluminescence)进行染色，混合同量的增强化学发光试剂盒(ECL kit)(坤肯生物化工有限公司Santa Cruz)的溶液A (Solution Α)(包含鲁米诺(Luminol)和增强剂(enhancer))和溶液 B(Solution B)(包含过氧化氢(Hydrogen peroxide))之后，均勻摇荡1分钟之后，加入与膜(membrane)混合的ECL溶液而均勻搅拌1分钟，通过凝胶成像分析系统(Gel Document System)(伯乐生命医学产品有限公司=Bio-Rad)进行拍摄来检测标记蛋白质的反应。在图6及图7中分别表示通过免疫印迹分析从已转基因的蚯蚓的体液分离的人重组蛋白质(hEP0，hGH)的表达与否的结果。如图6及图7所示，从已转基因的蚯蚓的体液分离的人重组蛋白质(hEPO)在大约为39KDa中表达，人重组蛋白质(hGH)在大约为37KDa中表达。实施例4 检验已表达的重组蛋白质(EPO)的生物活性为了测定已表达的重组蛋白质的生理活性，将从蚯蚓体液萃取的hEPO投入到小鼠体内之后，测定了其活性。具体而言，对萃取的蚯蚓体液进行冷冻干燥之后，重新在生理盐水中溶解，使得干燥粉末的浓度达到50 %，通过口服、腹腔注射及皮下注射的方法，将其注入到小鼠体内。注入后，通过测定从小鼠的眼睛采取的血液的红细胞比容(hematocrit) 来确认基于EPO的血红素含量的变化。并且，通过如同上述实施例3-2的免疫印迹方法来确认hEPO是否存在于从口服的小鼠身上萃取的血液。在图8中表示通过皮下注射方法及腹腔注射方法来注入从蚯蚓体液萃取的hEPO 的小鼠的血红素含量变化，在图9中表示通过免疫印迹来检测口服从蚯蚓体液萃取的hEPO 的小鼠的血红素含量变化和hEPO是否存在于血液的结果。如图8所示，通过皮下注射方法及腹腔注射方法来注入从蚯蚓体液萃取的hEPO的小鼠的血红素含量分别表示为59. 7%和67. 0%，未经hEPO处理的小鼠的血红素含量表示为 52. 8%。并且，如图9所示，口服从蚯蚓体液萃取的hEPO的小鼠的血红素含量，口服当天为 55.8%, 口服第二天为58. 3%，第七天为56.6%，由此确认人重组蛋白质(hEPO)已被表达。 并且，未经hEPO处理的小鼠的血红素含量为55. 55. 5%，即几乎没有任何变化。产业上的可利用性本发明的利用蚯蚓的性腺再生能力的转基因蚯蚓的养殖方法，通过用于弥补以往转基因技术的缺点的形态的新型生命工程技法，并利用具有高注入有效性和如胚胎干细胞等全能性的再生母细胞，能够在转基因体的所有部位嵌入重组基因，由此能够通过转基因体的体液来生产重组蛋白质，由于向性腺直接投入靶基因，因而无需代生母(动物)，由于利用能够进行生殖的转基因体，因而能够持续生产多个转基因体，远比以往的转基因技术更加简便，而且不需要昂贵的设备及娴熟的技术。
权利要求
1.一种利用蚯蚓的性腺再生能力的转基因蚯蚓的养殖方法，其特征在于，包括如下步骤步骤(1)，切断蚯蚓的包括性腺的前半部之后诱导再生来形成再生母细胞； 步骤O)，在pCMV EGFP-Cl载体中引进靶基因来制备重组基因表达载体；以及步骤(3)，向在上述步骤(1)中切断之后M小时以内开始再生的蚯蚓的再生母细胞部位注入在上述步骤O)中制备的重组基因表达载体之后进行继代培养，来养殖已转基因的蚯蚓。
2.根据权利要求1所述的转基因蚯蚓的养殖方法，其特征在于，上述蚯蚓是前半部包括性腺的蚯蚓。
3.根据权利要求2所述的转基因蚯蚓的养殖方法，其特征在于，上述蚯蚓是属于环节动物门多毛纲或环节动物门贫毛纲的蚯蚓。
4.根据权利要求3所述的转基因蚯蚓的养殖方法，其特征在于，上述蚯蚓是掘穴环爪蚓或线蚓科的一种蚯蚓。
5.根据权利要求1所述的转基因蚯蚓的养殖方法，其特征在于，上述靶基因选自包含生长激素、人促生长激素释放激素、性腺激素、促性激素释放激素、干扰素类、干扰素受体类、集落刺激因子、白细胞介素类、促红细胞生成素、胰岛素、血管紧张素、血小板生成素、瘦素、视黄醇结合因子、脂联素、骨形成生长因子、B细胞因子、T细胞因子、神经生长因子类、 细胞表面抗原、单克隆抗体、源于病毒的疫苗抗原、凝血调节因子、催乳素、肥胖抑制调节因子、超氧化物歧化酶以及蛋白水解酶的组中的一种以上。
6.一种转基因蚯蚓，其特征在于，通过根据权利要求1至5中的任一项所述的方法来养殖。
7.根据权利要求6所述的转基因蚯蚓，其特征在于，上述转基因蚯蚓为Pex-hEPO或 Pex-hGH。
8.—种重组蛋白质的生产方法，其特征在于，包括如下步骤 步骤(1)，从权利要求6的转基因蚯蚓获得蚯蚓体液；步骤O)，向在上述步骤(1)中获得的蚯蚓体液加入裂解缓冲液，在搅拌器中进行均质粉碎来获得均质液；步骤(3)，对上述均质液进行离心分离，并通过沉淀获得重组蛋白质；以及步骤G)，对所获得的上述重组蛋白质进行纯化及分离。
9.根据权利要求8所述的重组蛋白质的生产方法，其特征在于，在上述步骤(1)中，蚯蚓体液利用选自如下方法中的一种方法来从蚯蚓萃取而得，利用乙醇来进行萃取的方法；利用包括冷水及温水的温度调节装置的温度偏差来进行萃取的方法； 利用包含食盐的盐来进行萃取的方法； 利用体液萃取缓冲液来进行萃取的方法；以及利用电击来进行萃取的方法。
10.根据权利要求8所述的重组蛋白质的生产方法，其特征在于，上述重组蛋白质是选自包含生长激素、人促生长激素释放激素、性腺激素、促性激素释放激素、干扰素类、干扰素受体类、集落刺激因子、白细胞介素类、促红细胞生成素、胰岛素、血管紧张素、血小板生成素、瘦素、视黄醇结合因子、脂联素、骨形成生长因子、B细胞因子、T细胞因子、神经生长因子类、细胞表面抗原、单克隆抗体、源于病毒的疫苗抗原、凝血调节因子、催乳素、肥胖抑制调节因子、超氧化物歧化酶以及蛋白水解酶的组中的一种以上。
全文摘要
本发明涉及利用蚯蚓的性腺再生能力的转基因蚯蚓的养殖方法、通过该养殖方法养殖的转基因蚯蚓以及从转基因蚯蚓的体液生产重组蛋白质的方法。本发明的转基因蚯蚓的养殖方法，通过用于弥补以往转基因技术的缺点的形态的新型生命工程技法，并利用具有高注入有效性和如胚胎干细胞等全能性的再生母细胞，能够在转基因体的所有部位嵌入重组基因，由此能够通过转基因体的体液来生产重组蛋白质，由于向性腺直接投入靶基因，因而无需代生母(动物)，由于利用能够进行生殖的转基因体，因而能够持续生产多个转基因体，远比以往的转基因技术更加简便，而且不需要昂贵的设备及娴熟的技术。
文档编号A01K67/00GK102482678SQ201080032694
公开日2012年5月30日 申请日期2010年10月15日 优先权日2009年10月22日
发明者卓银植, 安治炫, 金海京 申请人:Eco基因工艺株式会社