专利名称：一种用于修复脊髓损伤的人工神经网络样导管的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于修复脊髓损伤的人工神经网络样导管的构建方法，尤其是 一种具有功能的用多孔隙明胶海绵圆柱体支架构建的人工神经网络样导管的方法及其应用。
背景技术：
中枢神经损伤如严重的脊髓创伤主要表现为截瘫和四肢瘫，目前还没有行之有 效的治疗方法。现在认为，不可能依赖受损伤脊髓自身神经元之间在全横断处形成突触 来修复神经传导通路。需要通过移植成体干细胞、诱导性多潜能干细胞和胚胎干细胞等 方式在脊髓损伤处形成新的神经元，由此建立突触联系。为了实现这种实验性治疗目 标，通常需借助组织工程技术构建一种含有干细胞的可降解生物导管，在此基础上构建 成一种具有神经传导功能的人工神经网络样导管，用于桥接脊髓全横断损伤处，起到修 复受损伤的神经通路中继站作用。在脊髓损伤中，生物组织工程材料作为移植细胞或作为具有保护神经元和促进 其轴突再生作用的活性因子的载体，被用于治疗脊髓损伤而逐渐引起人们的关注。组织 工程材料具有天然来源生物材料和可降解高分子合成材料。1.天然来源生物材料包括明 胶，胶原和海藻酸盐等等，它们能在一定程度上促进脊髓结构和功能的恢复。由于天然 材料支架本身结构的无序性和机械性能较差，虽然在体外观察到比较理想的实验结果， 但要移植到体内起导向轴突再生作用会有困难。2.可降解的高分子材料最大的优点是生 物相容性好，降解产物易于被吸收而不产生炎症反应。可降解的高分子材料以多通道生 物多聚体材料-—聚左旋乳酸(poly D，L-Iactic acid, PLLA)和聚乳酸-聚羟基乙酸共聚 物(poly D，L-lactic-co-glycolic acid, PLGA)为代表。但是，这种材料在用于体内神经 损伤修复的实验中，发现当它降解之后会产生酸性物质等。天然生物材料做成的凝胶、明胶海绵和胶原海绵，或者用可降解高分子合成材 料做成的导管，都可用于横断性脊髓损伤修复。凝胶能够在脊髓损伤空洞处起填充作 用，促进轴突再生，减少星形胶质细胞增生形成的疤痕。但是，它不能较好地介导再生 轴突穿越损伤区域，尤其是缺乏机械强度。明胶海绵和胶原海绵具有凝胶的优点，且能 够方便承载活性物质，但其机械强度不高。高分子合成材料导管最大的优势是在于它有 一定的机械强度，能够起到桥接作用，但有些导管在降解之后产生的酸性物质对邻近细 胞有损害作用。用基因修饰细胞移植治疗中枢神经系统(CNS)损伤是目前研究的热点之一， 但所运用的多是神经生长因子(NG F)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养 素-3 (NT-3)等神经营养因子基因。现已证明NGF主要作用于感觉神经元，对运动神经 元作用不明显，而BDNF作用的神经元类型范围较窄小。许多研究认为，NT-3对神经 元的发育、分化以及对受损伤中枢神经元的存活及其轴突再生有重要作用。有研究还证 实，NT-3对脊髓损伤处皮质脊髓束神经纤维的再生有明显的促进作用，这也在我们先前的研究中得到了验证。有研究表明，NT-3介导的ERK信号通路能够导致神经干细胞(NSCs)分化为神 经元，因为应用ERK抑制剂后NSCs源性神经元明显减少。但作者并没有显示这些NSCs 源性神经元之间形成连接，这可能与NSCs没有足够数量的NT-3受体(TrkC)有关。一 般认为，当NT-3与NSCs胞膜上TrkC结合，使其胞质区的酪氨酸被磷酸化，激活ERK 信号通路，导致一系列的蛋白磷酸化，从而使NSCs向神经元分化。因此我们认为，过 表达TrkC的NSCs在NT-3的作用下更多地分化为神经元，并相互间形成突触连接，就有 可能促使NSCs源性神经元存活较长时间。对CNS的损伤或病变部位应用细胞替换，是近年来新发展的一种细胞治疗策 略。研究表明，在发育中或成年的CNS内植入胚胎神经组织，通过其中的神经干细胞或 分裂后的年幼神经元替换病伤死亡的神经元，并重建神经通路及其功能。胚胎或新生动 物的NSCs数量较多，且组织免疫原性较低，用于移植后不易被宿主排斥。我们已经从 新生动物的大脑组织中分离出具有多潜能的NSCs，用胶原网架吸附后移植到全横断或半 横断脊髓的损伤处，观察到它们能在宿主内存活、迁移并可分化为神经元。但在这种条 件下，移植的NSCs分化为神经胶质细胞的占多数，仅少数分化为神经元。因此，我们 还将NSCs与雪旺细胞一起移植，发现分化成神经元的数量增多，有些神经元还长出较长 的神经突起，甚至有些属于胆碱能神经元，提示雪旺细胞可促进NSCs分化为神经元，这 可能与雪旺细胞分泌的神经营养因子有关。但自体NSCs的取材较为困难，不便于临床 应用。因此，人们试图找到一种来源更方便的自体成体干细胞进行体内移植。经研究发现，骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，MSCs) 来源丰富、取材简便、易分离和易纯化培养，给予一定的条件可在体外迅速扩增，具有 多向分化潜能。将其移植到体内能分化为神经元、少突胶质细胞、成软骨细胞、脂肪细 胞、成肌细胞、肝细胞和心肌细胞等。用于自体移植可克服伦理和免疫排斥等问题，因 而被用于多种疾病的细胞治疗和基因治疗的载体。尤其是近年一些学者发现MSCs可在 体外、体内分化为神经元等，并具有相应的功能，有利于神经损伤的修复。张永福等应 用MSCs移植治疗了 87例脊髓损伤病人，术后显示有明显的临床疗效(实用诊断与治疗 杂志，2004，18(4) 260)。因此，MSCs已成为神经损伤细胞治疗的重要的细胞来源。 我们已从大鼠骨髓获取MSCs，并在体外应用维甲酸(retinoic acid，RA)诱导MSCs表达 TrkC之后，再移植到脊髓损伤处。2个月后MSCs在脊髓损伤处能存活、分化和迁移； 应用NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs移植能在脊髓损伤处更好地分化为神经元。如 果将这种能分化为骨髓源性神经元的MSCs种植在可降解的组织工程材料内，它们就有 可能在脊髓移植处更好地形成神经网络。在上述研究基础上，本项发明专利拟从大鼠骨髓获取MSCs，将NT-3受体 (TrkC)基因转染到MSCs;从大鼠坐骨神经获取雪旺细胞，将NT-3基因转染到雪旺细 胞，用多孔隙明胶海绵圆柱体支架吸咐这两种基因修饰细胞。在体外培养条件下让NT-3 基因修饰雪旺细胞分泌更多的NT-3，更好地促进TrkC基因修饰MSCs分化为具有形成突 触潜能的骨髓源性神经元数量增多，这些分化的骨髓源性神经元之间建立突触联系，形 成一种具有功能的人工神经网络导管支架，为临床治疗急性脊髓损伤患者研制出一种具 有自主知识产权的组织工程支架材料。
发明内容
目前，在国内、外尚未见有文献资料报道用多孔隙明胶海绵圆柱体支架构建的 人工神经网络样导管的方法，尤其是一种具有功能的用多孔隙明胶海绵圆柱体支架构建 的人工神经网络样导管的方法及其应用。本发明的目的是想克服现有临床上治疗脊髓损 伤所用的方法上的不足，应用我们自行构建的具有功能的人工神经网络样导管移植治疗 脊髓创伤性疾病，更好地促进受损伤脊髓神经通路及其功能的修复。本发明的基本方案包括以多孔隙明胶海绵为主体，外面应用PLGA薄膜包裹，形成一种形貌像圆柱体 的支架材料。在此基础上种植NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因修饰骨髓间充质干细 胞(MSCs)，构建成具有功能的人工神经网络样导管。应用时，将其移植到横断性脊髓损 伤处。本发明的优点显著。本研究选择一种含有NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因 修饰MSCs的人工神经网络样导管来促进受损伤的脊髓神经通路修复，对危害人民健康 较大的创伤性中枢神经疾病如脊髓损伤等进行治疗性基础研究，这将有力地推动整个创 伤性中枢神经疾病治疗研究领域的发展。这对延长人类寿命，提高伤病者生存质量，减 轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展都具有重要意义。本发明将使我国的创伤性 中枢神经疾病防治水平居于国际领先水平。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明所用的主要仪器、可降解的生物材料支架、实验 细胞、实验动物和试剂作详尽的描述1.主要仪器超净工作台(苏州净化设备有限公司)、普通离心机(日本久保田制作所)、低 温高速离心机(美国Eppendorf公司)、5% CO2培养箱(美国Queue公司)、倒置荧光 显微镜(德国Leica公司)、显微手术显微镜(镇江光学仪器厂)、恒冷箱切片机(英国 Shandon公司)、倒置相差显微镜(日本Olympus公司)、Philips CM 10透射电镜(荷兰 Eindhoven公司)和HEKAEPC-10膜片钳放大器(德国HEKA公司)。2.可降解的生物材料支架按申请人另一项发明专利(申请号2009100401769)所描述的方法，制备明胶
海绵圆柱体支架。3.实验细胞、病毒载体和实验动物骨髓间充质干细胞(自行分离培养获取)、雪旺细胞(自行分离培养获取)、 人神经营养素-3基因(人NT-3基因)重组腺病毒表达载体(Ad-NT_3)(中山大学黄 文林、王俊梅申请的发明专利200610034981.7)、人神经营养素_3受体基因(人TrkC 基因)重组腺病毒表达载体(Ad-TrkC)(中山大学曾园山、王俊梅获授权的发明专利 ZL200510033569.9)、绿色荧光蛋白基因重组腺病毒表达载体(Ad-GFP)(北京宝赛生物 技术有限公司)和新生和幼年SD大鼠(由中山大学实验动物中心提供)。4.主要试剂
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DMEM-LG (Gibico)、优级胎牛血清(TBD)、多聚赖氨酸(Sigma)、D-Hank' s 平衡液(自配)、胰蛋白酶(Sigma)、EDTA (Sangon)、0.01mol/l PBS (中杉金桥)、 Hoechst33342 (Sigma)、山羊血清(中杉金桥)、Cy3标记羊抗小鼠IgG和Cy3标记 羊抗兔 IgG (JacksonImmunoResearch)、巢蛋白(Nestin)多克隆抗体(Sigma)、神经丝 (NF)多克隆抗体(Sigma)、微管相关蛋白2 (Map2)单克隆抗体(Sigma)、突触后致 密物95(PSD95)单克隆抗体(Sigma)、突触素(Synaptophysin)多克隆抗体(Sigma)、 生长相关蛋白_43(GAP-43)多克隆抗体(R&D)、胆碱乙酰转移酶(Chat)多克隆抗体 (Chemicon)、谷氨酰胺(Glutamine)多克隆抗体(Boster)、Y-氨基丁酸(GABA)多克 隆抗体(Boster)、β -III微管蛋白(β -III tubulin)多克隆抗体(Millipore)、HRP标记的 β -肌动蛋白(β -actin)单克隆抗体(康成)、RIPA细胞裂解液(含PMSF)(申能博采)、 PVDF膜(Millipore)、ECL发光底物检测试剂盒(康成)、Epon_812 (Ted Pella)、X感光 胶片(Kodak)和 1640 培养基(Gibico)。本发明详细的具体操作技术说明如下1.多孔隙明胶海绵PLGA圆柱体支架的构建按本发明专利申请人的另一项发明专利说明书(申请号2009100401769)上描 述的方法构建多孔隙明胶海绵PLGA圆柱体支架。即所述的多孔隙明胶海绵PLGA圆 柱体支架可分为两部分第一部分外壳薄壁是环绕圆柱体的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物 (poly D，L-lactic-co-glycolic acid, PLGA)，其由可降解的高分子材料PLGA(聚乳酸与 聚羟基乙酸比值为50 50，分子量为100000)构成。0.02毫米厚PLGA薄膜购自山东 济南岱罡生物技术公司，材料的构建方法如下取一定量的PLGA溶解于二氯甲烷中， 配成5%溶液，待PLGA完全溶解后，浇注与已调水平的聚四氟模具中，室温(控制温度 在20°C)，挥发24小时，第二天小心揭下薄膜，反置于模具中24小时，剪裁到适宜大小 后干燥保存。将薄膜包绕在直径为3毫米的不锈钢圆柱磨具上一圈，边缘用丙酮粘贴， 形成直径为3毫米的圆筒状PLGA外壳。使用时将PLGA外壳剪成2毫米长度，酒精浸 泡15分钟，随后用无菌D-Hank，s清洗三次，每次10分钟。第二部分是位于圆柱体中央的无菌明胶海绵购自金陵药业公司，在超净工作台 中将其剪成直径3mm，厚度2mm大小(约l.Omg)，其形貌呈圆柱体，其中的孔隙直径约 200 600 μ m。将明胶海绵用尖嘴镊小心塞入消毒好PLGA外壳中。材料无菌干燥保 存待用。2.大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定10天SD大鼠窒息处死，经碘酒、酒精消毒后，无菌条件下快速取出两侧股骨， 放置D-Hanks’平衡液中，清除股骨周围的软组织，剪去股骨两端，用含10%胎牛血清 (FBS)的L-DMEM培养液的2ml注射器反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬浮液，并用吸 管轻轻吹打混合成单细胞悬液，接种至一个预先铺被有多聚赖氨酸的50ml的玻璃培养瓶 中，于37°C，5% CO2中培养。第3天半量换液，以后每隔2 3天全量换液。大约 7 10天细胞长至接近融合时(70% 80%)，用0.25%胰酶+0.02% EDTA消化2min， 按1 3接种传代(P1R)后继续培养。当细胞再长至接近融合时，同样按照上述方法 1 2进行传代。骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，MSCs)的鉴定采用
6成脂成骨诱导检测MSCs的多能分化潜能，P3 P5代MSCs经成脂诱导液(1 μ mol/L 的地塞米松，0.5mmol/L的1_甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)，10 μ g/ml的牛胰岛素， 100mmol/L的indomethacin，10 % FBS的H-DMEM)诱导14天后行加入油红O染色，光
学显微镜下观察。成骨细胞诱导液(含10_7mol/L地塞米松，lOmmol/L β -甘油磷酸钠， 50 μ g/ml Vitamin C),诱导分化的第21天进行茜素红S法染色，显微镜下观察结果。3.大鼠坐骨神经中的雪旺细胞的体外分离培养及鉴定选用新生大鼠，分离坐骨神经，经胰蛋白酶和胶原酶消化后制成分离细胞悬 液，在基础培养基和胎牛血清的混合培养液条件下于37°C，CO2培养箱中进行培养，加 入阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长。将原代培养贴壁细胞用胰蛋白酶等混合液消化分离， 进行传代培养。从第2代细胞培养中取部分细胞进行S-IOO免疫细胞化学鉴定。4.两种基因修饰细胞的制备4.1MSCS和雪旺细胞的腺病毒载体感染率的测定用不同感染复数(multiplicity of infection，MOI)的Ad_GFP (报告基因重组腺病
毒载体)在无血清培养液中分别感染MSCs和雪旺细胞3小时，弃病毒残液，加入正常培 养液继续培养12 24小时，然后用光镜观察阳性染色细胞的百分比(感染率)，确定一 个感染率在80%以上的病毒剂量。4.2TrkC基因修饰MSCs的制备用一定剂量(按测定感染率的)Ad-TrkC在无血清培养液中感染MSCs 3小时， 弃病毒残液，加入正常培养液继续培养24小时。取少量细胞用免疫荧光细胞化学染色 鉴定TrkC基因修饰MSCs的比例，并检测其生物活性，结果见于发明人发表的论文 ZhangYQ, Zeng X, HeLM, DingY, LiYan, Zeng YS.NT-3 gene modified Schwann cells promote TrkC gene modified mesenchymal stem cells to differentiate into neuron-like cells in vitro.Anat Scie Inter, 2010，85(2) 61-67。4.3NT-3基因修饰雪旺细胞的制备方法基本同上，但改用ELISA方法测定NT-3基因修饰雪旺细胞培养液上清中 NT-3的含量，并检测其生物活性，结果见于发明人发表的论文ZhangYQ，Zeng X, He LM, Ding Y, Li Yan, Zeng YS.NT-3 gene modified Schwann cells promote TrkC gene modified mesenchymal stem cells to differentiate into neuron-like cells in vitro.Anat Scie Inter, 2010， 85(2) 61-67。5.将上述两种基因修饰细胞一起种植在明胶海绵圆柱体支架内进行体外培养将明胶海绵圆柱体支架固定在培养皿内，按1 1的比例将NT-3基因修饰雪旺 细胞及TrkC基因修饰MSCs悬液种植在支架内，加入常规培养液，于37°C、5%032培
养箱中培养。6.在体外用免疫荧光细胞化学和电镜等技术观察明胶海绵圆柱体支架内TrkC基 因修饰MSCs分化为具有形成突触潜能的MSCs源性神经元及其之间建立突触联系过程， 以及合成神经递质情况取出培养14天含有两种基因修饰细胞的明胶海绵圆柱体支架，应用免疫荧光细 胞化学染色和Western blot等技术，检测已分化的神经元样细胞的β -III tubulin、PSD95 和Map2等蛋白表达。另取标本做常规透射电镜观察；用戊二醛固定标本，做超薄切片，在电镜下观察已分化的MSCs之间形成突触的情况。7.在体外用电生理技术检测明胶海绵圆柱体支架内MSCs源性神经元的电活动特 性利用膜片钳全细胞记录模式检测明胶海绵圆柱体支架内自发性MSCs源性神经 元突触后电位。8.统计学分析相关数据用均数士标准差(Jtis)表示，运用独立样本t检验(Independent samples t test)分析。P < 0.05表示差异有显著性意义。实验结果显示l.MSCs和雪旺细胞的腺病毒感染率测定结果用荧光显微镜观察不同MOI感染的情况下，Ad-GFP-MSCs和Ad-GFP-雪旺细
胞表达绿色荧光蛋白的情况。在荧光显微镜下，绿色荧光蛋白的细胞显影呈绿色。流式 细胞仪检测的结果显示，绿色荧光细胞占全部细胞的百分比如下表1，随着MOI的逐渐 增高，这两种细胞的感染率都逐渐增高。当MOI为80时，MSCs的感染率为78.5% ； 当MOI为10时，雪旺细胞的感染率为88.1%，说明Ad-GFP在NSCs和雪旺细胞中获得 了高效表达。表1各种感染复数的骨髓间充质干细胞(MSCs)和雪旺细胞(SCs)的感染率(％)
细胞MOI (pfu/cells)1050100150200300MSCs35.32±4.6341.64 士 8.5261.53±7.7672.05士4.9871.80±9.3273.63±1.56SCs45.99±8.7663.74士7.3489.67±2.5196.64±2.6595.32±3.3293.39±4.252.明胶海绵圆柱体支架内Ad-TrkC-MSCs分化的检测Ad-TrkC-MSCs与Ad_NT_3-雪旺细胞共培养14天后，支架材料内 Ad-TrkC-MSCs可分化为神经元样细胞，表现为Nestin (图IA —所示，阳性率为 30.32士 12.50%)、β-III tubulin (图 IB—所示，阳性率为 73.69士 19.72% )、NF (图 IC 一 所示，阳性率为83.85 士 9.27% )和Map2 (图ID —所示，阳性率为85.57 士 7.74% )阳性染色。3.检测明胶海绵圆柱体支架内Ad-TrkC-MSCs分化的神经元样细胞突触形成潜 能Ad-TrkC-MSCs与Ad_NT_3-雪旺细胞共培养14天后，支架材料内 Ad-TrkC-MSCs能分化为具有突触潜能的神经元样细胞，其突触后膜标记物PSD95 (图 2A—所示)的阳性率为75.59士6.62%。此外，突触前膜的标记物Synaptophosin为阳性染 色(图2B —所示)、神经突起生长锥的标记物GAP-43也为阳性染色(图2C —所示)。4.检测明胶海绵圆柱体支架内Ad-TrkC-MSCs分化的神经元样细胞表达β "III tubulin、MAP2 禾口 PSD95Ad-TrkC-MSCs与Ad_NT_3-雪旺细胞共培养14天后，Western Blot检测结果 证实，Ad-TrkC-MSCs分化的神经元样细胞均有β -III tubulin (图3A)、Map2 (图3B)和PSD95 表达(图 3C)。5.明胶海绵圆柱体支架内Ad-TrkC-MSCs分化的神经元样细胞间形成的突触样
结构Ad-TrkC-MSCs与Ad-NT-3-雪旺细胞共培养14天后，透射电镜结果显示，支 架材料内的Ad-TrkC-MSCs能够分化为具有突触样结构的神经元样细胞。电镜下，可见 突触样结构为不对称性突触的特征，突触前膜内有少量中等电子密度的小泡，大小约为 30 50nm ；突触间隙约为50 80nm，突触后膜增厚(图4)。6.检测明胶海绵圆柱体支架内Ad-TrkC-MSCs源性神经元的神经递质合成Ad-TrkC-MSCs与Ad_NT_3-雪旺细胞共培养14天后，我们检测了 Ad-TrkC-MSCs源性神经元的胆碱乙酰基转移酶Chat(图5A—所示)、Y-氨基丁酸 GABA (图5B —所示)和谷氨酰胺Glutamine (图5C —所示)，发现这3种神经递质均有 阳性表达；其中Chat阳性率最高，为70.93士5.14%。7.检测明胶海绵圆柱体支架内Ad-TrkC-MSCs源性神经元的电活动特性Ad-TrkC-MSCs与Ad_NT-3_雪旺细胞共培养14天后，我们应用全细胞膜片钳 技术检测了 Ad-TrkC-MSCs源性神经元的电活动特性，观察到Ad_TrkC_MSCs源性神经 元的膜静息电位为自发性突触后电流(图6)，证实Ad-TrkC-MSCs源性神经元已经具有 神经元电活动功能。
图1 免疫荧光细胞化学染色检测明胶海绵圆柱体支架内Ad-TrkC-MSCs分 化。A.巢蛋白(Nestin) ； B. β-III 微管蛋白(β-III tubulin) ； C.神经丝(NF) ； D.微管 相关蛋白2(Map2)。A、B、C和D中标尺=40 μ m。图2:免疫荧光细胞化学染色检测明胶海绵圆柱体支架内Ad-TrkC-MSCs 分化的神经元样细胞突触形成潜能。A.突触后致密物95(PSD95) ； B.突触素 (Synaptophysin) ； C.生长相关蛋白 _4；3 (GAP-43)。A、B 和 C 中标尺=40 μ m。图3 Western blot法检测明胶海绵圆柱体支架内Ad_TrkC_MSCs分化的神经元 样细胞表达 β -IIItubulin> Map2 和 PSD95。Α. β -III tubulin ； B.Map2 ； C.PSD95。A、 B和C中内参为β -肌动蛋白(β -actin)。图4 透射电镜检测明胶海绵圆柱体支架内Ad-TrkC-MSCs分化的神经元样细 胞间形成的突触样结构。图5:免疫荧光细胞化学染色检测明胶海绵圆柱体支架内Ad-TrkC-MSCs源 性神经元的神经递质合成。A.胆碱乙酰基转移酶(Chat) ； B.谷氨酰胺(Glutamine)； C. Y -氨基丁酸(GABA)。A、B和C中标尺为40 μ m。图6 全细胞膜片钳检测明胶海绵圆柱体支架内Ad-TrkC-MSCs源性神经元的 电活动特性。A.玻璃微吸管与明胶海绵圆柱体支架内Ad-TrkC-MSCs源性神经元形成巨 阻封接。B.膜片钳记录到Ad-TrkC-MSCs源性神经元产生的自发性突触后电流。
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权利要求
1.一种用于修复神经损伤的人工神经网络样导管支架，尤其是一种用于修复横断性 脊髓损伤的具有功能的人工神经网络样导管支架材料，其形貌特征是圆柱体支架表面 包裹着由聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly D，L-lactic-co-glycolic acid, PLGA)薄膜构 成的薄壁，圆柱体中央填充着多孔隙明胶海绵；通过明胶海绵吸附种植的基因修饰的干 细胞及其分化细胞和雪旺细胞，建造成有利于受损伤神经再生及其功能修复的具有功能 的人工神经网络样导管；
2.根据权利要求1所述的修复神经损伤的具有功能的人工神经网络样导管，其特征 是所吸附种植的细胞为基因修饰的成体干细胞及其分化细胞和雪旺细胞。
全文摘要
本发明涉及一种用于修复脊髓损伤的人工神经网络样导管的构建方法，尤其是一种用多孔隙明胶海绵圆柱体支架构建的具有功能的人工神经网络样导管的方法及其应用。应用时将这种具有功能的人工神经网络样导管移植到全横断或半横断脊髓的损伤处，可更好地促进受损伤中枢神经再生和功能修复。本发明在生物组织工程水平上加强对脊髓创伤后保护受损伤神经元、促进神经网络的重建、提高伤病者生存质量、减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展具有重要意义。
文档编号A61F2/04GK102008360SQ20101050613
公开日2011年4月13日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者曾园山, 曾湘 申请人:中山大学, 广州中大中山医科技开发有限公司