专利名称：一种抗hpv的抗体、其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫治疗领域。更具体而言，本发明涉及一种用于预防或治疗人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染相关疾病(例如宫颈病变，特别是宫颈癌)的抗体。本发明还涉及所述抗体的制备方法和应用。
背景技术：
目前的研究表明，HPV感染与宫颈系统疾病——特别是宫颈癌——的发生有明显的相关性°1995年，国际癌症研究中心(International Agency for Research of Cancer, IARC)公布的研究结果证实，HPV与宫颈癌等宫颈系统疾病均有密切的因果关系在99. 8% 的宫颈癌患者中可检测出HPV感染，而HPV阴性者几乎不会发生宫颈癌；另外，98%以上的宫颈疾病患者中均可检测出HPV。HPV病毒根据Ll基因的序列同源性可分为不同的型和亚型，同源性在90%以上的为一个型，而同源性在90 98%之间的HPV又可划分为不同的亚型。根据HPV的型别或亚型与女性生殖道恶性肿瘤的关系，将HPV分为低危型和高危型。低危型HPV，例如HPV 6、11、 34,40,42等型别多见于良性宫颈病变，如宫颈湿疣及宫颈上皮轻度不典型性增生病变；而宫颈上皮重度不典型增生及宫颈癌中则以HPV 16、18、31、33、35、39、45型感染更为多见， 这些型为高危型HPV。针对不同人群的一系列研究已证实生殖道的HPV 16、18型感染与宫颈上皮重度病变(CIN I/CINII)宫颈癌的发生高度相关，较其他危险因素更密切。据世界卫生组织 (WHO)公布的《世界范围内HPV和宫颈癌2007报告》结果，我国妇女中58. 7%的子宫颈癌与HPV16型直接相关。HPV16E7基因在宫颈癌中持续存在并高表达，在宫颈癌的形成和恶性性状的维持中起重要作用。HPV16E7蛋白共98个氨基酸，其序列如下MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQ LNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP。该蛋白有三个保守区(conserved region, CR) =CRl位于N端，CR2含有LXCXE结构域，CR3含两个锌指样结构域。E7的中心功能就是通过三个保守区域之一与Rb蛋白家族(如PRb、P107、 P130)结合并通过泛素-26S蛋白酶体途径降解Rb家族蛋白。Rb蛋白家族处于细胞周期Gl/ S关卡的中心环节。在去磷酸化状态下Rb蛋白结合转录因子E2f蛋白，阻止E2f蛋白激活众多与DNA复制有关的蛋白因子，从而抑制DNA合成和细胞周期进展，使细胞处于G0/G1期和进行细胞分化。E7蛋白结合并降解Rb蛋白，释放E2f蛋白，从而激活许多相关的DNA合成蛋白因子，加快DNA复制和细胞的分裂增殖，促进细胞的分化。此外，E7蛋白还能结合细胞周期素A、细胞周期素Ε、P48等10多种其他蛋白，提高外源性DNA整合和细胞基因突变性等等，加速细胞的转化。因此，HPV16E7蛋白是宫颈癌肿瘤细胞特异性表达的抗原，是肿瘤细胞区别于正常细胞在胞内表达的抗原靶标。由于是在胞内进行表达的抗原，到细胞表面必须通过抗原提呈的过程。抗原提呈细胞(比如树突状细胞，巨噬细胞)摄取相应抗原，经加工处理后，将抗原降解成8-10个氨基酸的短肽，这些短肽在高尔基体中和MHC-I类分子结合，然后通过胞膜循环展示在细胞表面。这个过程就称为抗原提呈。提呈在细胞表面的MHC-I分子和短肽(称为T细胞表位)，被T细胞识别，从而激活T细胞下游的免疫反应。早期对HPV16 E7 抗原的研究表明HPV16E7有三个高亲和力的T细胞表位，分别是第11-20位氨基酸残基 YMLDLQPETT，第 49-57 位氨基酸残基 RAHYNIVTF (SEQ ID NO :5，下称“49-57 肽”)和第 86-93 位氨基酸残基TLGIVCPI (下称“86-93肽”)。一般，抗原的T细胞表位只有8-10个氨基酸。而单克隆抗体的可变区有三个 CDR(互补决定簇，complementary-determining region)区,大约每个CDR区可识别10个氨基酸左右，单克隆抗体除了亲和结合特定的T细胞表位外，还要识别其它表位，因此，只识别抗原的特定T细胞表位的单克隆抗体难以获得。具体体现在在使用经典的小鼠体内单抗筛选中，用8-10个氨基酸的短肽单独去免疫动物，很难产生抗体。针对这种情况，筛选T细胞表位抗体目前采用两种方法解决。一种是用体外的噬菌体展示技术进行筛选，用T细胞表位的多肽作为亲和原进行筛选，这种方法技术平台要求高，且抗体的亲和力一般都不如体内筛选出的抗体高。第二种方法是先用其它蛋白和表位多肽形成复合物，以提高其免疫原性，用该复合物免疫小鼠然后进行单克隆抗体筛选和表位鉴定，该法中使用的其他蛋白多为MHC(主要组织相容性复合物)分子或KLH(钥孔虫戚血蓝蛋白)分子。采用MHC分子的方法需要在体外表达MHC分子并通过体外变复性将 MHC分子和抗原肽组成复合物，该方法过程繁琐，且制备出复合物的效率低。采用KLH等大分子偶联同样面临着制备出复合物的效率低的问题。而且，未形成复合物的MHC或KLH分子由于同样具有免疫原性，在免疫到动物体内后会产生很多不需要的干扰性抗体，给随后的目标单克隆抗体筛选和表位鉴定带来很大的干扰。因此，本领域中需要一种特异性针对HPV16E7蛋白的T细胞表位多肽的单克隆抗体及其生产方法。
发明内容
为解决上述技术问题，在本发明的第一方面，提供了一种特异性针对HPV16E7蛋白的49-57肽表位(如SEQ ID N0:5所示)的抗体，所述抗体具有如SEQ ID NOs :6_8所示的重链CDRU CDR2和CDR3区域和SEQ ID NOs :9_11所示的轻链CDRU CDR2和CDR3区域。在一个实施方案中，本发明的抗体具有如SEQ ID NO :1所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO 2所示的轻链可变区序列。本发明还提供了一种制备本发明抗体的方法，其包括将一种双链RNA佐剂和SEQ ID NO 5所示的多肽混合形成复合物；将一种双链RNA佐剂和SEQ ID NO 5所示的多肽混合形成复合物；将所述复合物免疫接种宿主；和从宿主的体液、组织或细胞获得抗体。本发明特别提供了一种制备本发明抗体的方法，其包括将一种双链RNA佐剂和SEQ ID NO 5所示的多肽混合形成复合物；将所述复合物免疫接种宿主；收获宿主脾细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，和
收集融合的细胞所产生的抗体。在本发明制备所述抗体的方法中，采用了双链RNA和表位多肽形成的复合物进行宿主(例如，小鼠)免疫，并继而筛选单克隆抗体。由于双链RNA有别于通常用于和抗原形成复合物的其它蛋白分子(例如MHC和KLH)，本身并不产生干扰性抗体，因此产生的抗体全是针对表位多肽的单一抗体。该法制备抗体简便快速，无特殊的技术平台要求，且筛选出的抗体特异性高。在本发明的另一方面，还提供了本发明的抗体、含该抗体的组合物或试剂盒用于制备预防或治疗HPV16感染疾病，特别是宫颈病变或宫颈癌的药物中的用途。
图1显示了本发明的6C10单克隆抗体的电泳检测结果。图2显示了通过ELISA方法鉴定本发明6C10单克隆抗体亲和力的结果。图3显示了通过T2荷载肽实验进行本发明6C10单克隆抗体的表位鉴定的结果。 图3A和图;3B分别显示E7的49-57肽荷载过的T2细胞流式细胞检测结果和荧光显微镜检测结果；图3C和图3D分别显示E786-93肽荷载过的T2细胞流式细胞检测结果和荧光显微镜检测结果；图3E和图3F分别显示无任何肽荷载过的T2细胞流式细胞检测结果和荧光显微镜检测结果。图4显示了使用本发明的6C10单克隆抗体进行抑制肿瘤研究的成瘤率。图5显示了使用本发明的6C10单克隆抗体进行抑制肿瘤研究的抑瘤率。图6显示了本发明的6C10单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列。图7显示了本发明的6C10单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列。序列说明
SEQIDNO 1为本发明抗体重链可变区氨基酸序列。
SEQIDNO 2为本发明抗体轻链可变区氨基酸序列。
SEQIDNO 3为编码本发明抗体重链可变区的核酸序列。
SEQIDNO 4为编码本发明抗体轻链可变区的核酸序列。
SEQIDNO 5为HPV 16E7蛋白的第49-57位氨基酸序列。
SEQIDNOs:6-8为本发明抗体重链的⑶R 1-3的氨基酸序列。
SEQIDNOs9-11为本发明抗体轻链的⑶R 1-3的氨基酸序列。
具体实施例方式虽然所描述的实施方案代表本发明的优选实施方案，但应理解的是，在不背离本发明精神的情况下本领域技术人员可作出任何变换。优选地，本发明的抗体为通过杂交瘤技术制备而得的单克隆抗体。特别优选地，本发明的抗体为由保藏号为CGMCC 4144的6C10杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。本发明在实施方案中提供一种包含本发明的抗体的药物组合物或者试剂盒。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可进一步含有其他治疗剂，其中本发明的抗体可与所述其他治疗剂以各自独立的形式，或者彼此相混合的形式存在，再或者彼此之间可以形成偶联结合。所述治疗剂可以是抗肿瘤或抗病毒活性治疗剂或生物毒素，例如5’ -氟尿嘧啶、氟达拉滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、吉西他滨、卡培他滨、曲沙他滨、拉米夫定、恩曲他滨、扎西他滨、齐多夫定、阿巴卡韦、去羟肌苷、替诺福韦延胡索酸双异丙酰氧基甲酯、司他夫定、 阿巴卡韦、顺钼、异环磷酰胺、卡钼、博莱霉素或泰素等。在一个本发明抗体与其他治疗剂形成偶联物的实施方案中，本发明的抗体可起到将其偶联的治疗剂靶向目的治疗区域的作用。在另一实施方案中，本发明的试剂盒可进一步含有如上所述治疗剂，以及该试剂盒的使用说明。本发明所述“复合物”是通过将一种双链RNA佐剂和SEQ ID NO :5所示的多肽进行混合而形成。优选地，用于形成所述复合物的双链RNA为聚肌胞苷酸(PolylC， Polyinosinic acid-polycy tidy lie acid)或者 PolyICLC0在本发明抗体制备方法的一个实施方案中，将双链RNA与E7 (49-57)肽进行充分混合，其混合比可为1 0. 5到1 4(w/w)之间。在另一个实施方案中，所述宿主为小鼠、大鼠、兔子。在又一个实施方案中，所述骨髓瘤细胞为SP2/0瘤细胞。在本发明抗体制备方法中，所述经融合的细胞克隆优选为经三次以上亚克隆后仍产生所述抗体的单克隆。特别优选地，所述细胞克隆为6C10细胞克隆。本发明的方法可进一步包括将筛选得到的单克隆细胞建立细胞株。该细胞株可稳定传代，并分泌特异性抗体。因此，本发明的方法可包括从细胞株获得持续分泌特异性抗体的细胞单克隆。由上文所述，本发明也提供了一种生产能产生本发明抗体的细胞的方法，特别提供了产生6C10细胞克隆的方法。本发明的制备抗体的方法可进一步包括将收集的抗体进行纯化。本发明还提供了产生一种本发明抗体的细胞，在一个实施方案中，其为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的(CGMCC)、保藏号为CGMCC 4144的6C10细胞。本发明抗体的纯化可通过本领域普通技术人员熟知的常规纯化方法进行，例如通过亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、分子筛色谱法等。本发明的抗体可用于预防或治疗HPV16感染疾病，包括向受试者给予有效量的本发明抗体，特别优选的抗体为保藏号为CGMCC 4144的6C10细胞杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明抗体可用于预防/治疗多种宫颈病变，特别是CIN I或 CIN II，以及宫颈癌变。通过以下实施例详细描述本发明，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。下述实施例仅仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字(如数量、温度等)的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明，温度以。C为单位或者为环境温度，压力接近或等于大气压。应当理解的是，除非另有说明，下述各实施例中所用到的仪器设备均为本领域的常规设备。除非另有说明，所使用的培养基均为市售可得的常规培养基，本领域技术人员均熟知其中的成分及含量。为了简便起见，在本文中有可能使用各种通用的缩写，本领域技术人员完全能够理解其含义。实施例
实施例1 :E7蛋白49-57肽的免疫复合物的制备和免疫接种HPV16病毒E7蛋白的49_57肽，氨基酸序列RAHYNIVTF ；分子量1119Da，理论等电点9. 04。该肽由吉尔生化公司合成，纯度大于95%。以合成的双链RNA——PolyIC为佐剂，其购自Sigma公司(目录号P9582)。称取PolyIC佐剂干粉和E7 (49-57)肽干粉，按质量比5 2混合，加入纯水溶解， 充分混勻，形成肉眼可见的白色颗粒状复合物，在溶解的5-10分钟之内，将该复合物通过腹部皮下免疫BALB/c小鼠，每只小鼠免疫100 μ g PolyIC+40 μ g 49-57肽混合物。在初次免疫后的第14天和第观天，以同样的免疫剂量再加强免疫两次。在初次免疫后第35天左右，采集小鼠血清即可检测到有相应的E7蛋白的相关抗体产生(检测方法如以下实施例2 所述)。实施例2 血清抗体滴度的检测对于按实施例1所述进行过免疫的小鼠，在初次免疫后第35天时从尾静脉采取少量血清，用直接酶联免疫分析法(ELISA)检测血清抗体滴度。ELISA检测血清抗体滴度步骤如下1.先用HPV16E7蛋白(该蛋白的制备方法为合成全长HPV 16E7基因，然后在 pET32a载体和BL21 (DE3)宿主中表达出带Trx标签的E7融合蛋白，再用肠激酶将Trx标签切除掉即可获得HPV16E7蛋白)，以每孔1 μ g的量包被96孔板。包被板在4°C孵育16小时，用洗涤缓冲液(含0. 05%Tween-20的PBS溶液)洗涤各孔6次，每孔加入封闭液(含 5%脱脂奶粉的PBS溶液)100 μ 1封闭2小时。2.每孔加入100μ 1用PBS溶液稀释50倍的血清样品，37°C反应一小时。然后用洗涤缓冲液洗涤各孔3次，每次5分钟。3.每孔加入100 μ 1的辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG抗体(购自Calbiochem 公司，编号401215)，37°C孵育0. 5小时。然后用洗涤缓冲液洗涤各孔6次，以去除未结合的酶标抗体。4.每孔加入100 μ 1 TMB显色液，室温进行显色反应20分钟。5.每孔加入50 μ 1的终止液(2Μ硫酸溶液)终止显色反应。5分钟后用酶标仪测定450nm波长处的光吸收，并记录结果。通过光吸收值判定血清的抗体存在情况。共测定了四只按照实施例1所述方法进行免疫的小鼠和一只未经免疫的阴性对照小鼠的血清，四只被免疫小鼠血清OD读数分别为0. 323，1. 805,0. 347,0. 709，而阴性血清读数0. 055。由此推断通过PolyIC和抗原肽的复合物免疫小鼠能激活小鼠的免疫系统， 并产生相应的E7蛋白的特异性抗体。实施例3 杂交瘤单克隆抗体的筛选1.细胞融合选择血清滴度最高的一只小鼠，腹腔注射200 μ g PolyIC+80 μ g49_57肽的混合物进行加强免疫，加强免疫后第四天取脾脏进行细胞融合。具体步骤如下小鼠摘眼球取血， 将血液收集至1.5ml离心管中，直至小鼠死亡。收集的血液分离血清，-20°C保存。阳性克隆在检测时用做阳性对照。采集完血液的小鼠进行无菌采脾脏。在200目钢筛网中研磨脾脏，收集脾细胞。将收集到的脾细胞用IOml RM1640基础培养基重悬，脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)按照10 1到1 1的比例混合，混勻，IOOOrpm离心10分钟。弃去上清，1分钟内加入37°C预热的PEG 15001ml，37°C水浴1分钟，在5分钟内缓慢加入20ml RM1640基础培养基(Gibico公司)，混勻，960rpm离心10分钟。弃去上清，加入120ml含HAT的RM1640 培养基，混勻，接种到6块96孔板中，每孔200μ 1，在37°C、5% CO2条件下培养。5至7天后，待孔中有清晰的克隆可见，每个克隆的细胞数达到IO3以上，将孔中的培养基吸出，加入新鲜的含HT的RM1640培养基，每孔200 μ 1，在37°C、5% CO2条件下继续培养。吸出的培养基上清用如上所述的ELISA法检测是否有特异性抗体产生。挑取ELISA检测呈阳性的克隆继续随后的亚克隆筛选。2.亚克隆筛选饲养细胞的制备在采用有限稀释法进行亚克隆时需要有饲养层细胞的存在。提前一天制备饲养层细胞。取1只雌性8周龄以上昆明鼠收集腹腔巨噬细胞，并且接种于96 孔板中。有限稀释法筛选亚克隆将上述选定的克隆用移液枪吹打制成细胞悬液，使用血球记数板记数。根据记数结果吸出含100个细胞的悬液加入20ml含10%胎牛血清的 RM1640培养基中，接种至1块96孔板中，200 μ 1/孔，置于37°C、5 % CO2条件下培养，7至 10天后，待96孔板中的克隆长至整孔的六分之一到三分之一时，取细胞上清进行特异性抗体的检测，再挑选OD值较高、生长良好的克隆，进行亚克隆筛选。若一个单克隆连续三次亚克隆，得到的所有克隆均为阳性时，可认定该单克隆细胞能够稳定分泌特异性抗体，将该细胞建株，扩大培养、冻存建立细胞种子库。按照上述标准挑取出编号为6C10的克隆，建立细胞种子库。收集细胞培养上清液约800ml，以ftOtein A介质纯化抗体，得到6C10单克隆抗体，用作进一步的鉴定。上述建立的6C10杂交瘤细胞株已于2010年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC 4144。实施例4 :6C10单克隆抗体的电泳检测对纯化后的6C10单克隆抗体进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示，在二硫苏糖醇还原电泳图谱中，可见该单抗的约52KD的重链条带和25KD的轻链条带。实施例5 :6C10单克隆抗体亲和力的鉴定以E7全长蛋白、Trx_E7(E7的第30_67位氨基酸残基组成的多肽)和BSA (牛血清蛋白)分别作为包被抗原，6C10单抗作为检测抗体，进行ELISA检测。结果示于图2。从图2的ELISA结果可以看出，含有E749-57肽的蛋白，例如E7全长蛋白和 Trx-E7 (30-67)蛋白可以和6C10单抗有很强的结合，ELISA实验中OD值大于1. 5。不含有 E749-57肽的蛋白，比如BSA蛋白，和6C10单抗几乎没有结合，ELISA实验中OD值小于0. 2。实施例6 :6C10单克隆抗体表位的鉴定使用T2荷载肽实验进行本发明的单克隆抗体的表位鉴定。T2细胞(购自美国 ATCC库，保藏号CRL-1992)是一种内源性TAP缺陷、表面空载HLA-A2分子的细胞。外源加入的抗原肽能加载到T2细胞表面的HLA-A2分子上。将T2细胞在培养基中用终浓度20 μ g/ml的E749-57肽或E786-93肽或不加任何肽，孵育4小时。洗涤一次后，用染色缓冲液(PBS+0. 5% BSA+2mM EDTA)重悬后加入100 μ 1 纯化的6C10单抗，37°C孵育30分钟。洗涤一次后，用染色缓冲液(PBS+0. 5%BSA+2mM EDTA)重悬，然后加入2μ 1 FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(购自BD公司，目录号349031)，室温避光保存20分钟后用流式细胞仪和荧光显微镜检测细胞绿色荧光情况。结果如图3所示。图3Α和图;3Β分别显示Ε749-57肽荷载过的Τ2细胞流式细胞检测结果和荧光显微镜检测结果；图3C和图3D分别显示Ε786-93肽荷载过的Τ2细胞流式细胞检测结果和荧光显微镜检测结果；图3Ε和图3F分别显示无任何肽荷载过的Τ2细胞流式细胞检测结果和荧光显微镜检测结果。从图3所示的结果可以看出，本发明的6C10单抗可以特异性识别位于Τ2细胞表面荷载的Ε749-57肽。由此证实了 6C10单抗的表位特异性。实施例7 单克隆抗体可变区(CDR)测序和序列分析取IX IO7个6C10杂交瘤细胞，采用PureLink总RNA纯化试剂盒Qnvitrogen公司)，按试剂盒说明书操作抽提RNA。将约3 μ g抽提出的总RNA用于进行一步法RT-PCR(使用Qiagen公司的OneSt印RT-PCR试剂盒)。
根据抗体可变区基因FRl区和FR4区保守区序列设计合成轻重链引物，重链引物
VH 正向引物5，-GA GGTGCA GCTGCA GGA GTC-3，；
VH 反向引物5’ -TGAGGA GACGGTGACCG TGGTCCCTTGGCCC-3，；
如下轻链引物如下VL 正向引物5，-GACA TTGTGA TGACCCA GTCT-3，；VL 反向引物5，-CCGTTTTA TTTCCA GCTTGGTCCC-3，。将重链和轻链的PCR扩增产物分别连接进pMDIS-T载体(Takara公司)，挑选出阳性克隆后送至上海生工公司进行DNA测序。测序结果显示，所获得的轻/重链可变区基因含有4个框架区和3个抗原互补决定区。该单抗的重链可变区序列如SEQ ID N0:1所示。6C10单抗VH基因全长348bp，编码116个氨基酸。氨基酸序列分析结果显示，VH 含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR)(其分别具有如下SEQ ID NOs 6-8所示序列)，在第22位和第95位为半胱氨酸，是与抗体二硫键形成有关的两种特征性
氨基酸。SEQ ID NO 6 Asn Tyr Gly Met SerSEQ ID NO 7 Thr lie Asn SerAsn Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Gln GlySEQ ID NO 8 Glu Tyr Gly Lys Ala Phe Ala Tyr该单抗的轻链可变区序列如SEQ ID NO 2所示。6C10单抗VL基因全长324bp，编码108个氨基酸。氨基酸序列分析结果显示，VL 含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR)(其分别具有如下SEQ ID NOs 9-11所示序列)，在第92位为半胱氨酸，该轻链为异常转录产物，进行了提前终止。SEQ ID NO 9 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
SEQ ID NO: 10:Leu Val Ser Asn Leu Glu SerSEQ ID NO :11:Gln His lie Arg Glu Leu Thr实施例8 :6C10单克隆抗体的抑制肿瘤生成或生长的效果研究采用经典的鼠源TC-I细胞(购自美国ATCC库，保藏编号CRL-2785)接种建立E7 蛋白表达的宫颈癌肿瘤模型。表达E7抗原的TC-I细胞于来源于C57BL/6小鼠的肺原代细胞，通过导入HPV16的E7基因和被激活的人C-Ha-ras基因，该原代细胞株被转化并获得无限繁殖能力。对该肿瘤模型小鼠注射6C10单抗和各种对照蛋白，观察肿瘤生长情况。收集体外培养生长良好的TC-I细胞，PBS洗3次，调整细胞密度，给予C57BL/6 小鼠左侧腋皮下注射，每只接种0.2ml细胞悬液，约为IX IO5细胞。接种后将小鼠随机分成4组，每组8只，按以下四种方式进行给药。阴性对照PBS给药组腹皮下分别于接种后 2天、16天给药两次；阳性对照VRlll疫苗给药组腹皮下分别于接种后2天、16天给药两次；6C10单抗给药组颈背皮下分别于接种后0天、7天、14天、21天给药四次；16X1同型对照单抗给药组颈背皮下分别于接种后0天、7天、14天、21天给药四次。其中，阳性对照 VRlll疫苗为基于HPV16E7蛋白的治疗性疫苗，在小鼠肿瘤动物模型中有很好的抑制肿瘤生长效果。该疫苗的制备和表征可参见国际申请W02008/1M867A1，该申请的全部内容通过援引的方式纳入本文。同型对照16X1单抗为特异性针对HPV16病毒的外壳蛋白Ll的抗体，与HPV16E7蛋白无任何亲和反应。16X1单抗通过以HPV 16L1的病毒样颗粒作为抗原免疫BALB/c小鼠，然后采用传统的杂交瘤技术筛选得到。每天观察动物肿瘤生长情况，记录接种后不同时间出现肿瘤的动物数(长短直径均>=3mm才计算为肿瘤阳性)，计算成瘤率，即出现肿瘤动物数与每组实际动物数之比。 在肿瘤可触及后，每周2次用游标卡尺测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积，即肿瘤体积=(长径X短径2)/2，抑瘤率计算公式抑瘤率=100% -给药组肿瘤平均大小/PBS对照组肿瘤平均大小。观察到60天时，杀死全部小鼠。接种肿瘤细胞后M天的成瘤率如图4所示，60天内的抑瘤率的结果如图5所示。从图4和图5可以看出，6C10单抗和VRlll疫苗在抑制肿瘤生成和抑制肿瘤生长的效果显著(P <0.001)区别于PBS对照组和同型16X1单抗组。说明6C10单抗给药后有抑制肿瘤生成和抑制肿瘤生长的效果。
权利要求
1.一种特异性针对人乳头状瘤病毒HPV16的如SEQ ID :5所示抗原表位的抗体，所述抗体具有如SEQ ID NOs 6-8所示的重链CDRl、CDR2和CDR3区域和SEQ ID NOs :9_11所示的轻链⑶R1、⑶R2和⑶R3区域。
2.一种特异性针对人乳头状瘤病毒HPV16的如SEQ ID :5所示抗原表位的抗体，所述抗体具有如SEQ ID NO :1所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO :2所示的轻链可变区序列。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体是由宿主脾细胞与骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。
4.如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体为保藏号为CGMCC4144的 6C10细胞产生的单克隆抗体。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-4任一项的抗体。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含另一种抗病毒或抗肿瘤药物。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述另一种抗病毒或抗肿瘤药物与所述抗体偶联。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-4任一项的抗体。
9.一种产生如权利要求1-4任一项所述的抗体的细胞，其特征在于，所述细胞为保藏号为CGMCC 4144的6C10细胞。
10.一种制备权利要求1-4任一项的抗体的方法，其特征在于，所述方法包括将一种双链RNA佐剂和SEQ ID NO 5所示的多肽混合形成复合物；将所述复合物免疫接种宿主；和从宿主的体液、组织或细胞获得抗体。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括将一种双链RNA佐剂和SEQ ID NO :5所示的多肽混合形成复合物；将所述复合物免疫接种宿主；收获宿主脾细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，和收集融合的细胞所产生的抗体。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述融合细胞为经三次以上亚克隆后仍产生所述抗体的细胞。
13.如权利要求10-12任一项所述的方法，其特征在于，所述宿主为小鼠、兔或大鼠。
14.如权利要求10-13任一项所述的方法，其特征在于，所述骨髓瘤细胞为SP2/0瘤细胞。
15.如权利要求10-14任一项所述的方法，其特征在于，所述佐剂与所述多肽混合的重量比为1 0. 5至Ij 1 4。
16.如权利要求10-15任一项所述的方法，其特征在于，所述双链RNA为PolyIC或 PolyICLCo
17.如权利要求10-16任一项所述的方法，其特征在于，所述融合细胞为6C10细胞。
18.如权利要求1-4任一项所述的抗体、如权利要求5-7任一项的药物组合物，或者如权利要求8的试剂盒用于制备预防或治疗HPV16感染疾病、宫颈病变或宫颈癌的药物的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用于治疗人乳头瘤病毒感染相关疾病——特别是宫颈癌——的抗体，及其制备方法和应用。
文档编号A61P15/00GK102443060SQ20101050594
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者丛薇, 刘瑞锋, 张高峡, 田平生, 雷建强 申请人:上海泽润生物科技有限公司