专利名称：衍生自人胚胎干细胞的用于脊髓损伤的再髓鞘化和治疗的少突胶质细胞的制作方法
技术领域：
本发明总的涉及胚胎细胞和神经祖细胞的细胞生物学领域。更具体的是，本发明提供了少突胶质细胞及其前体的富集细胞群，适合用于生物学研究、药物筛选和人类治疗。
相关申请本申请要求2002年7月11日提交的美国临时专利申请60/395,382的优先权和2003年4月4日提交的美国实用专利申请10/406,817的优先权。这些优先权申请的全部内容被引入本文作为参考。
背景在中枢神经系统的支持中，少突胶质细胞起着重要的生理作用。用于人类治疗的少突胶质细胞的可用性可促进隔离神经细胞的髓鞘中的受损导致的无能症状康复。
多发性硬化症是一种渐进的并丧失能力的脱髓鞘疾病，与大脑和脊髓神经细胞周围的髓鞘的逐渐破坏相关。这种病的症状程度从麻木、视觉损伤以及认知变化到瘫痪。这种病被确信有免疫学的和遗传方面的因素，出现临床症状的经常在20到40岁间。仅在美国这种病就影响了大约300,000人。目前治疗方案涉及β-干扰素类或皮质甾类。这些药在发病时能缩短症状出现的时间，但是通常不能防止长期的能力丧失。
脊髓的外伤性创伤会导致创伤点附近完整轴索脱髓鞘化，从而破坏了它们的神经传导能力。在美国每年大约有11,000例新的脊髓损伤病例。SCI信息网(SCI Information Network)预测，对于遭受任何级别运动功能不完整的病人，其生存期直接花费的范围从400,000美元到2,200,000美元，不包括工资损失和生活质量的影响。
中枢神经系统细胞上的髓磷脂被少突胶质细胞放在适当的位置，包裹在轴索周围，形成髓鞘。Keirstead和Blakemore阐述了少突胶质细胞及其祖细胞在疾病症状中的作用(Adv.Exp.Med.Biol.468183，1999)。被称为O-2A细胞的少突胶质细胞祖细胞存在于正常成人的CNS中和多发性硬化症病灶中，并参与了再髓鞘化(Scolding等，Brain 1212221，1998；以及Scolding等，Neuroscience891，1999)。充分再髓鞘化的失败可能会发生，因为少突胶质细胞的对称增生会用尽大面积损伤地方的祖细胞储备。
已进行了大量的研究工作，目的是建立能应用于再生医学以恢复神经功能的细胞群(参见Park等，J.Neurotrauma，16675，1999)。Keirstead等(J.Neuroscience 197529，1999)已从出生后的老鼠大脑中分离出CNS前体，该前体在移植后能产生少突胶质细胞和神经膜细胞。Svendsen等(J.Neurosci.Meth.85141，1998)已从发育的人皮质中分离出前体细胞。Mujtaba等(Dev.Biol.214113，1999)报道从胚胎干细胞中分离出神经前体。
PCT出版物WO97/07200(Stanford U.)公布了从成年大鼠大脑中分离出的少突胶质细胞前体的培养物。PCT出版物WO 01/28342(Washington U.)提出了在以预处理的少突胶质细胞培养基中培养神经细胞的某些方法。美国专利5,753,506(Johe，CNS干细胞技术)涉及一种用于维持从神经组织中分离的具备分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞能力的干细胞的培养系统。美国专利6,238,922(StemCells Inc.)提出了神经组织分化变异成具备分化成神经元和神经胶质能力的细胞。美国专利6,235,527(Rao等，U.Utah)涉及从哺乳动物神经管组织分离并基于A2B5细胞表面标记物选择的哺乳动物CNS神经胶质限制性前体细胞群。
美国专利5,968,829(Cytotherapeutics)要求保护含有具备生成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞能力的CNS神经干细胞的培养基。PCT出版物WO97/32608涉及遗传工程改造的初级少突胶质细胞，用于CNS中的移植介导的传递。美国专利5,830,621(Signal Pharmaceuticals)描述了保藏于ATCC的登录号为CRL11881的人少突胶质细胞系。这个细胞株基本上没有GFAP、GalC、O4和A2B5特征性标记物。
不幸的是，至今还不清楚从神组织中分离的祖细胞是否具备足够的复制能力来产生用于人类临床治疗的必要数量的细胞。
一个备选来源是从早期胚胎组织中分离的多能细胞。胚胎干细胞(ES)是25多年以前首先从小鼠胚胎中分离出来的(G.R.Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.787634，1981)。据信胚胎干细胞实际上能产生同一种类任何组织类型的后代。
Fraichard等(J.Cell Sci.1083181，1995)报道在体外小鼠的胚胎干细胞分化成神经胶质细胞和功能性神经元。Mujtaba等(Dev.Biol.214113，1999)报道从小鼠胚胎干细胞中分离到神经前体。Li，Smith等(Cur.Biol.8971，1998)报道通过谱系选择从小鼠胚胎干细胞中产生神经元前体。Brüstle，McKay等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9414809，1997；Science 285754，1999)报道衍生自小鼠胚胎干细胞的神经胶质前体可作为髓鞘移植物的潜在来源。McDonald等(Nat.Med51410，1999；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 976126，2000)报道小鼠胚胎干细胞在培养和脊髓移植后可形成少突胶质细胞和髓鞘。
直到最近才分离出人类胚胎干细胞(Thomson等，Science 282114，1998)。人类胚胎干细胞需要非常不同的条件来保持它们处于未分化状态或引导它们沿着特定的分化途径分化(美国专利6,090,622和6,200,806；PCT出版物WO99/20741和WO01/51616)。由于这个原因，极少知道如何从人类胚胎干细胞中制备相对较同类的分化细胞群。
PCT出版物WO01/88104(Carpenter，Geron Corporation)描述了通过分化人类胚胎干细胞得到的神经祖细胞群。已获得超过90％NCAM阳性、35％β-微管蛋白阳性和75％A2B5阳性的细胞群。Zhang等(Nature Biotech.191129，2001)报道了从人类胚胎干细胞中分化得到的可移植的神经前体。国际专利申请PCT/US02/19477(Carpenter等，Geron Corporation)描述了胚胎干细胞衍生的神经细胞群，其中在已产生的细胞群中，至少10％的MAP-2阳性细胞表达了酪氨酸羟化酶，该酶是多巴胺能神经元的标记物。
最近，Billon等(J.Cell Sci.1153657，2002)描述了来自遗传工程改造的小鼠胚胎干细胞的少突胶质细胞发育的同步性。Kuo等(Biol.Reprod.Dec11/02)报道了猴ES衍生的细胞种群，该种群是28％GFAP阳性；Xian等(StemCells 2141，2003)报道了采用谱系特异的转录因子Olig2从小鼠胚胎干细胞中得到少突胶质细胞。
为了在人类健康和疾病的治疗中实现pPS细胞的所有潜力，有必要建立新的方法(paradigms)来产生可用于治疗脱髓鞘病症的富集细胞群。
概要本发明提供了一个系统，该系统能有效生产用于研究或药物组合物制备的神经胶质谱系的灵长类动物细胞。
本发明的分化细胞群是在体外分离或培养的，高度富含神经胶质细胞或能对神经组织髓鞘化的细胞的特征。这些细胞可具备少突胶质细胞的形态特征，表达本文所列出的某些可检测的抗体或可扩增标记物，或者具备进一步分化后形成少突胶质细胞的能力。这些细胞还可具备少突胶质细胞的某些功能特征，例如在协同培养实验中使神经节髓鞘化的能力、在体内恢复脱髓鞘轴突的髓磷脂的能力、或者改善人或非人动物神经功能的能力。一个、二个、三个或更多个这些特征可以任何组合出现。
所述细胞群可以从不同种类的较少分化的干细胞中制得。潜在的原始细胞包括衍生自胚泡的灵长类动物的多能干(pPS)细胞(胚胎干细胞是个例证)或者早期胚胎的生殖组织。因此，这些细胞将具备成为它们来源组织的后代的特征，这一点可以由原始细胞和分化细胞具有同一基因组的结果来证实。
本发明其他方面涉及生产或维持已经描述的分化细胞的方法。这些方法包括在一种或多种生长或分化因子存在时培养多潜在的或多能性的干细胞，如在本发明中随后举例的。
作为一个例子，干细胞可以在含有一种或多种分化因子如三碘甲腺原氨酸(T3)、硒或维甲酸，加入或不加入促分裂原如成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基中培养。分化细胞的初始形成可以在培养悬液中发生，在这少突胶质细胞谱系细胞可以形成相对均一的球形体。其他细胞类型可以通过适当的分离方法去除，例如把培养基铺在能选择性吸附所需细胞类型的表面上。任选地，通过加入促分裂原如FGF或表皮生长因子(通常存在一种或多种分化因子，如细胞初始衍生时用的那些)进行培养，可导致分化细胞在选择前或后进一步增殖。随后，通过培养时不加促分裂原，或加入能增强后期分化的表面如聚-L-赖氨酸，可任选地使这些细胞进一步成熟。
本发明的细胞可应用于许多商业性重要应用。例如，这些细胞适用于基于对神经胶质细胞的影响来筛选化合物，其中化合物的存在与细胞的维持、毒性、进一步分化或者作为神经胶质细胞起作用的能力相关联。这些细胞也适合于引起相邻神经组织的髓鞘化，无论在体外还是在体内。
本发明的细胞也可用于制备人类或动物治疗用的药物组合物。然后可使用这些组合物治疗各种疾病，如与轴突髓鞘化中的缺陷或脊髓受损相关的病症。
本发明更多方面见于如下描述。
附1是通过倒置显微镜(inverted microscope)拍摄的相衬图，显示了在含有碱性FGF和少突胶质细胞分化因子的培养基悬液培养2天后的人类胚胎(ES)干细胞。
图2显示了用维甲酸培养7天后的细胞。可以看到大而清楚的细胞球，代表了培养基中80-90％的细胞。
图3显示了去除维甲酸后的情况，这些细胞维持在低浓度FGF中。
图4显示了去除FGF后出现的变化。大的聚合体分解，整个培养基充满了单个细胞和小的群落。同时，可观察到新的亮黄色球形体(箭头)。
图5显示了在FGF缺乏的情况下，用表皮生长因子培养细胞时亮黄色球形体(箭头)的生长。
图6显示接种在Matrigel上2或3天后，来自球形体的定向为神经胶质的神经前体的移动和分支。
图7显示通过粘附到Matrigel上仅10-20小时来选择少突胶质细胞谱系细胞的结果。丢弃未吸附的细胞，这实质上排除了不具有少突胶质细胞标记物的细胞。然后将吸附的细胞重新悬浮并在含有FGF、EGF和神经胶质前体的培养基中增殖7天。这样有利于生产一种更分散的更适合于治疗给药和其他目的细胞群。这些细胞然后在促分裂原缺乏时，在聚-L-赖氨酸层粘连细胞上成熟。此显微镜图片显示了针对半乳糖脑苷脂(GalC，空心箭头)的染色，细胞核用溶血毒素(hematoxin)复染(实心箭头)。针对GalC染色的细胞百分比在这些条件下至少为～95％。
图8显示了胚胎干细胞衍生的少突胶质细胞的更高放大倍数。这些细胞具有成熟少突胶质细胞的形态特点许多复杂的突起，这些突起看起来是在它们之间使髓磷脂形成网状物。
图9显示了在分化中细胞形态学进展。(A)未分化的hES细胞。(B)在含有维甲酸的培养基悬液中从胚状体中生长的透明球形体。(C)在EGF存在时，含有少突胶质细胞前体细胞的黄色球形体的扩张。(D)通过接种在Matrigel上阳性选择获得的少突胶质细胞谱系细胞。(E，F)在培养中增加少突胶质细胞前体的隆起(prominence)。(G，H)随后的接种导致进一步分化成成熟的少突胶质细胞。
图10显示成熟少突胶质细胞的免疫细胞化学分析。接种一个星期后，这些细胞的早期神经胶质细胞标记物NG2(A)呈阳性。种植八个星期后，这些细胞的GalC(C)、O4(D)和RIP(E)呈阳性。图B显示用所示标记物染色的细胞数目。
图11显示给予大鼠脊髓的少突胶质细胞前体的组织剖面图，用对人核蛋白特异的抗体染色。
图12显示移植九星期后这些细胞已经迁移或增殖到白质中。
图13显示通过测量脊索(cord)横截面积，移植的少突胶质细胞不会使由挫伤性损伤后的第二次放大导致的损伤更坏。
图14显示了hES细胞诱导轴突分支。新的轴突在移植了少突胶质细胞的动物的图片中(上图)显示为BDA染色的暗窄线。在没有处理的动物中没有观察到分支。移植的细胞正诱导再生的可塑性。
图15显示了在受损位置(中心)分支的神经元定量结果(平均值±SEM，每柱3个切片)。治疗过的动物具有明显更高水平的标记轴突，从右侧一直到损伤位置吻端的中心。
图16显示了在移入人类胚胎干细胞来源的少突胶质细胞的动物中大量再髓鞘化的证据。在电子显微照片上部的密集圆圈是正常髓鞘化纤维。在这个部位轴突的其余部分显示了一个髓磷脂薄层。右上图中的轴突显示了大约5或者6个缠绕，以及正在进行再髓鞘化的证据。只有被移植的动物才显示新的髓磷脂，可归于少突胶质细胞的活性。这提供了一个解释在移植动物中行为改善的机制。
图17显示了在未分化的人类胚胎干细胞集落中检测到的标记物(左侧抗体加上DAPI；右侧抗体单独染色)。上图显示的是针对SSEA-4(一种多能细胞的标记物)标记的克隆。下图显示的是围绕在针对中胚层标记物BMP4标记的集落周围的基质细胞。
图18显示了在分化过程中转录因子Pax6的短暂出现。上图显示的是朝向第10天群落中心的染色，在朝向外围的更多分化细胞中已经被往下调。下图显示在分化过程的第35天事实上没有染色。
图19显示了在早期少突胶质细胞谱系细胞中检测到的标记物，出现在分化过程的第10天。上图转录因子Olig1。中图转录因子SOX10。下图少突胶质细胞前体标记物A2B5。
图20A-20B显示了适合在第35天移植的少突胶质细胞祖细胞(oligoprogenitors)中占优势的标记物。第一和第二行(20A)NG2(硫酸软骨素蛋白聚糖，少突胶质细胞前体的标记物)；第三行(20A)GalC；第四行(20B)O4；第五行(20B)Tuj1(神经元的一种标记物)。事实上所有细胞都携带有少突胶质细胞的标记物，但不是针对神经元细胞、间充质细胞、或未分化的人类胚胎干细胞的标记物(20B，底图)。
图21显示了给予发抖(Shiverer)小鼠少突胶质细胞的结果，这种小鼠在产生髓磷脂碱性蛋白的能力上存在遗传性缺陷。超微结构上，发抖小鼠的轴突缺乏髓磷脂或者被一个或二个不紧凑的髓磷脂缠绕包围着(上图)。移植细胞六个星期后，电子显微镜分析发现多层稠密的髓磷脂，揭示了移植细胞群产生髓鞘的能力(下图)。稠密的髓磷脂由所给予的少突胶质细胞直接产生。
图22显示了一个试验的结果，在该试验中，用冲击器挫伤大鼠的脊髓，然后定量(BBB级)评价随后阶段中的脊髓功能。上图200千达因挫伤；下图250千达因挫伤。(■)受损后1周，ES衍生的少突胶质细胞治疗的动物(n＝5)；(▲)接受同样的损伤但没有给予细胞进行治疗的对照动物(n＝3)。平均值±SEM，用盲法评定。移植了ES衍生的少突胶质细胞的动物表现出更好的地上运动(overground locomotion)，在治疗后持续超过5周。
详细描述本发明通过有效地从多能干细胞中生产少突胶质细胞及其前体解决了生产它们的大细胞群的问题。
这些分化细胞群非常相似。图7显示了一个具有少突胶质细胞形态特征的人细胞的制品例子。这个细胞群已经针对GalC进行染色，这是一种针对少突胶质细胞谱系细胞的标记物。图8是一幅更高放大倍数的视图，显示了能使髓鞘化附近任何神经元平衡的髓磷脂层的生产。这些细胞的功能性质使它们很适合于少突胶质细胞性质的进一步表征，并适合用于人类治疗。
本发明的细胞理想来源是灵长类动物不同种类的多能干(pPS)细胞。根据下面描述的策略，通过在几种合适的培养条件和辅助因子中进行选择，可以使pPS细胞被诱导进入少突胶质细胞路径。已发现，在最优化的条件下，未分化的pPS细胞转换成少突胶质细胞的效率可大25％。
本发明的组合物和方法提供优于先前可获得技术的重要优点。通过从所需同种异型的pPS细胞中分化少突胶质细胞，可产生具有任何组织相容性类型的少突胶质细胞。如果需要，可以任何增强移植的方式在分化前或后遗传修饰这些细胞。因为这些细胞来自天然细胞系而不需要进行组织解剖，因此它们能理想地满足规章批准所提出的质量控制要求。
重要的是，产生于每一个起始干细胞群的细胞的供应几乎是无限制的。如实施例1中所举例的，一旦产生和选择得到少突胶质细胞谱系细胞，可通过在存在生长因子的情况下培养而大量增殖这些细胞。此外，几乎能诱使原始pPS细胞无限增殖，从而为更多分化的细胞提供持续的来源。
下文提供如何制备和使用本发明分化细胞的进一步描述。这些种群非常地一致，并因此适合用于许多商业上地重要应用。
本发明一个方面提供一种分化的细胞群，其中至少大约80％的细胞是灵长类动物多能干(pPS)细胞的后代；能被对NG2蛋白聚糖(或其他少突胶质细胞标记物)特异的的抗体染色；并且呈NeuN(或其他神经元细胞和潜在污染物的标记物)阴性。分化的细胞群可能是适合产生少突胶质细胞谱系细胞的组成系统的一部分。这个系统可能还包含分化细胞从中产生的pPS细胞株(例如人类胚胎干细胞)。任选地，分化细胞群至少80％的细胞也表达A2B5或PDGFRα。至少20％的细胞可显示少突胶质细胞前体的两极形态学特征。
在一些环境下，细胞群植入发抖突变小鼠的脊髓中后，这些分化的细胞群会引起神经元轴突周围致密的髓磷脂的沉积；或者在挫伤性损伤的大鼠的脊髓内或周围植入细胞群后，导致其地上运动改善。或者，可在体外进一步分化本发明的少突胶质细胞前体细胞(例如，在缺乏促分裂原时在聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白上培养3天)。这样可以产生一个更加成熟的细胞群，其中至少10％的细胞具有成熟少突胶质细胞的复杂突起的特征，并且大约80％、90％、95％或更多的细胞具有成熟少突胶质细胞的标记物如GalC。在增殖阶段制备的少突胶质细胞谱系细胞的特征不仅在于它们在祖代阶段表达的标记物，还在于它们产生富集的成熟细胞群的能力或者在体内执行所需功能的能力。
如下面所阐述的，本发明一些分化的细胞群可采用以下方法获得，其中未分化的pPS细胞培养在含有促分裂原和至少二种少突胶质细胞分化因子的培养基中。例如，在碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、三碘甲腺原氨酸(T3)、维甲酸存在时(可能还有硒)，未分化的pPS细胞可以悬液培养，以形成细胞聚集体。
下文将进一步解释和阐述本发明。
定义少突胶质细胞是来源于外胚层的神经细胞，形成中枢神经系统的外膜结构部分(神经胶质)。它们具有不同数量的云幔状或片层状的突起(process)，缠绕在单个轴突周围形成CNS的髓鞘。可由本发明随后所解释的形态学的、表型的或功能的标准加以区别它们。
“神经前体细胞”或“神经上皮干细胞”是指能产生后代的细胞，这些后代不是神经元细胞(如神经元前体或成熟神经元)就是神经胶质细胞。术语“神经胶质细胞”包含成熟的少突胶质细胞、星形胶质细胞和任一这些细胞类型或两种的定向化前体。
“少突胶质细胞前体”是指定向用于产生含有成熟少突胶质细胞和/或更多前体细胞的后代的细胞，优先于神经元或非神经学组织。除非另外说明，它们可能但不一定具备产生其它类型的神经胶质细胞如星形胶质细胞的能力。本发明涉及“少突胶质细胞”或“少突胶质细胞谱系细胞”的描述都是指少突胶质细胞前体细胞和成熟细胞，除非另有说明。
在关于细胞个体发育学的内容中，形容词“分化的”是个相对而言的术语。一个“分化的细胞”是指与与其所比较的细胞相比，沿着发育途径更进一步发育的细胞。这样，多能胚胎干细胞能分化成谱系限制性前体细胞，例如上面列出的不同的前体类型。这些细胞能依次沿着该途径进一步分化成细胞，或者分化成末期分化细胞，例如成熟少突胶质细胞。
“分化剂”本发明中指用于本发明培养系统的用于生产少突胶质细胞谱系(包括前体细胞和末期分化细胞)的分化细胞的化合物一个集合。关于化合物的作用方式是没有限制的。例如，该制剂可以通过诱导或辅助表型中的变化、促进具有特定表型的细胞生长或者延迟其他细胞的生长，或者与其他制剂一起通过不明机制来辅助分化过程。
除非另外规定，本发明涉及“硒”的描述指硒的任何氧化形式，包括亚硒酸盐(SeO32-)、硒酸盐(SeO42-)或者是具有任何平衡离子的溶液中的硒离子(Se2-)。
原型“灵长类动物多能干细胞” (pPS细胞)是指衍生自受精后任何时期的胚前期的、胚胎期的或胎儿期组织的多能细胞，这些细胞具备在适当条件下能够生成几种不同细胞类型〔这些细胞类型是所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物〕的后代的特征(参照公认的标准技术试验)的能力，例如具备在成年SCID小鼠中在8-12周内形成畸胎瘤。包括在pPS细胞的定义内的是各种类型的胚胎细胞，例如人类胚胎干细胞(hES)和人类胚胎的生殖细胞(bEG)。pPS细胞较佳不衍生自恶性来源。需要的是(但不总是必需的)细胞是整倍性的。依赖于pPS细胞的来源和培养方法，从它们有能力发育成人体所有不同的细胞类型这一角度看，它们可能是或可能不是全能的。
当细胞群中大量的干细胞及其衍生物显示出未分化细胞的形态特征，并区别于胚胎或成年来源的分化细胞，pPS细胞被描述成“未分化的”。应理解，细胞群中未分化细胞的集落经常会被相邻的分化的细胞所包围。
术语“饲养细胞”或“饲养者”是指与另一类细胞共同培养的一类细胞，用于提供第二种类型细胞能够生长的环境。如果pPS细胞在分裂后至少生长了一轮，而其中没有加入用于支持该pPS细胞生长的新鲜的饲养细胞，则pPS细胞群可认为是基本上不需要饲养细胞的。
术语“胚状体”是指分化的和未分化的细胞的团聚体，当pPS细胞在单层培养基中过度生长或保持在培养基悬液中时出现。胚状体是不同细胞类型的混合物，通常来自几个胚层，通过形态标准和免疫细胞化学可测的细胞标记物来辨别。
“生长环境”是指感兴趣的细胞能在体外增殖、分化或成熟的环境。环境特征包括进行细胞培养的培养基，可能存在的任何生长因子或分化诱导因子，以及支持结构(例如在固体表面的基质)，如果存在的话。
在对单个细胞或细胞群上的表型标记物的评估中，除非另有说明，如果与同种型对照相比，在免疫细胞化学染色中使用特异性抗体显示出明显较强的染色，则认为细胞对该标记物是“阳性的”。除非另外声明，如果这个标记物不是通过这种免疫细胞化学分析而可检测到的抗体，则这个细胞认为是“阴性的”。
当一种多聚核苷酸通过任何合适的人工操作方式被移入细胞中，或细胞是经遗传得到多聚核苷酸的初始变异细胞的后代，则该细胞可以认为是“遗传变异的”、“转染的”或“遗传转化的”。该多聚核苷酸经常包含编码感兴趣蛋白的转录序列，该序列能使该细胞以可评价的水平表达蛋白。如果变异细胞的后代具有相同的变异，这个遗传变异认为是有“遗传性的”。
一般技术分子遗传和遗传工程的一般方法在“分子克隆实验室手册”(Sambrook等，冷泉港)的当前版本；“哺乳动物细胞基因转移载体”(Miller和Calos编辑)；和“分子生物学当前方案”(F.M.Ausubel等编辑.Wiley & Sons)描述。细胞生物学、蛋白质化学、和抗体技术可以在“蛋白科学中的当前方案”(J.E.Colligan等编辑，Wiley & Sons)、“细胞生物学中的当前方案”(J.S.Bonifacino等，Wiley & Sons)和“免疫学中的当前方案”(J.E.Colligan等编辑，Wiley &Sons)中找到。与本发明相关的试剂、克隆载体、和基因操作试剂盒可从商业供应商那得到，例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTech以及Sigma-Aldrich公司。
细胞培养方法通常在“动物细胞培养基本技术手册”目前版本(R.I.Freshney编辑，Wiley & Sons)；“细胞培养一般技术”(M.A.Harrison和I.F.Rae，剑桥大学出版)；和“胚胎干细胞方法和操作规定”(K.Turksen编辑，Humana出版)中有描述。组织培养基供应和试剂可从商业供应商那得到，例如Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma Chemical Co.、以及ICNBiomedicals。
本发明相关的特定参考书包括“神经科学原理”，第4版，Kandel等编辑，McGraw-Hill 2000；“CNS再生基础科学和临床发展”，M.H.Tuszynski和J.H.Kordower编辑，Academic Press，1999；“神经元细胞和分子生物学”，第3版，I.B.Levitan和L.K.Kaczmarek，牛津大学出版，2001；“神经胶质细胞它们在行为中的作用”，P.R.Laming等编辑，剑桥大学出版，1998；“在健康和疾病中神经胶质细胞功能作用”，Matsas和Tsacopoulos编辑，Plenum Pub公司，1999；“神经胶质细胞发育”，Jessen和Richardson编辑，牛津大学出版，2001；以及“Man of Steel”，Adrian Havill，1996。
干细胞来源本发明可以用各种类型的干细胞实施。特别适用于本发明的是灵长类动物多能干细胞(pPS)，衍生自妊娠后形成的组织，如胚泡，或在妊娠中的任何阶段得到的胎儿或胚胎组织。非限制性例子是初期培养物或已建立的胚胎干细胞或胚胎生殖细胞系，如下所述。本发明的技术也可以直接用初生(primary)胚胎或胎儿组织来实现，在未首先建立未分化细胞株的情况下，从原始初生的胚胎细胞中可直接衍生得到神经细胞。
在实施例部分提供的例子是继采用人类胚胎干细胞所做的工作后而进行的。然而，除了另外说明的地方，本发明可以用任何脊椎动物种类的干细胞进行操作，包括人类的、非人灵长类动物和其他非人哺乳动物的多能干细胞。胚胎干细胞可从灵长类动物组织中分离出胚胎干细胞(美国专利5,843,780；Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927844，1995)。可采用Thomson等(美国专利6,200,806；Sience 2821145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38133 ff.，1998)以及Reubinoff等(Nature Biotech 18399，2000)所述的技术从人卵裂球中制备人类胚胎干(hES)细胞。与hES细胞相当的细胞类型包括它们的多能衍生物，如原始外胚层样(EPL)细胞，如在WO01/51610中所述(Bresagen)。
在一个方法中，通过短暂暴露在链霉蛋白酶(Sigma)中，可从发育的胚泡中取出透明带。内细胞团可以通过免疫切除方法分离，在这方法中，胚泡暴露于1∶50稀释的兔抗人脾细胞抗血清稀释液中30分钟，然后在DMEM中清洗三次共5分钟，然后放在1∶5稀释的豚鼠补体(Gibco)稀释液中3分钟(Solter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 725099，1975)。在DMEM中进一步洗两次后，用移液管轻轻地从完整的内细胞团(ICM)上去除裂解的滋养外胚层细胞，并把ICM接种在mEF饲养细胞层上。
9到15天后，要么通过暴露在含有1mM EDTA的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液中，通过暴露在分散酶或胰岛素中，或通过微量移液管机械性分离，使衍生自内细胞团的生成物分解成多个块状物，然后重新接种在新鲜培养基的mEF细胞上。用微量移液管单个挑选出具有未分化形态学的生长集落，将其机械性分解成小块，并重新接种。ES样形态学特征为致密的集落，具有明显高的核质比和显著的核仁。然后每1-2周进行短暂的胰蛋白酶消化、暴露于Dulbecco’s PBS(包含2mM EDTA)、暴露在IV型胶原酶(～200U/mL；Gibco)、或通过微量移液管选择单个克隆而对生成的ES细胞进行常规的分离。约50到100个细胞的块状物大小是最理想的。
胚胎生殖细胞从原生殖细胞中制备人类胚胎生殖细胞(hEG)，可参考Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513726，1998和美国专利6,090,622。
简要地说，用等渗缓冲液清洗～8-11周后取出的生殖嵴，然后放在0.1mL、0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA钠溶液中(BRL)并切成＜1mm3的大块。分解后，这些细胞在～3.5mL EG生长培养基(包含D-葡萄糖，NaHCO3；15％ES合格的胎牛血清；2mM谷氨酰胺；1mM丙酮酸钠；1000-200U/mL人类重组白血病抑制因子；1-2ng/ml人类重组bFGF；以及10μM毛喉素(在10％DMSO中)的DMEM)中37℃培养1小时或过夜。
然后这些细胞在1-3mL EG生长培养基中重新悬浮，并接种到饲养细胞层上(例如，STO细胞，ATCC No.CRL 1503，用5000 rad γ-射线灭活)。7-10天后进行第一次传代，然后在每天更换培养基下培养，一直到观察到与EG细胞一致的细胞形态学，通常，7-30天或1-4次传代后。
其他干细胞本发明的实施也不要求分解人胚胎或胚泡以获得作为生产少突胶质细胞的起始原料的pPS或胚胎干细胞。hES细胞可以从公共保藏单位中已建立的细胞系中得到(例如，WiCell研究机构，Madison WI U.S.A.，或者美国典型培养物保藏中性，Manassas VA，U.S.A.)。美国专利出版物2003-0113910 A1报道不需要利用胚胎或胎儿组织能得到多能干细胞。采用诱导多能表型的因子将脐带血或其他祖细胞改变成(reprogram)pPS细胞也是可能的(Chambers等，Cell113643，2003；Mitsui等，Cell 113631，2003)。在适当的条件下，任何满足pPS或hES细胞定义的细胞都可用于本发明少突胶质细胞谱系细胞的衍生。
本发明提供的一些技术也能用于维持或促进更多指定细胞类型的分化，例如外胚层细胞，和来自胎儿或成年组织的神经细胞或神经前体。得到这样的细胞的方法已有记载，例如，美国专利5,852,832；5,654,183；5849553和5,968,829；以及PCT出版物WO98/50526和WO99/01159。
未分化状态pPS细胞的增殖采用促进增殖而不促进分化的培养条件，pPS细胞在培养基中可以持续增殖。含血清的ES培养基的例子由80％DMEM(例如Knockout DMEM，Gibco)，20％确定成分的胎牛血清(FBS，Hyclone)或血清替代物(WO98/30679)，1％非必需氨基酸，1mM L-谷氨酰胺，和0.1mM β-巯基乙醇制得。仅在使用前，加入人bFGF至4ng/ml(WO99/20741，Geron Corp.)。
只有在抑制分化的环境下培养，pPS细胞才能在未分化状态下增殖。传统上，pPS细胞是被培养在衍生自小鼠的胚胎或胎儿组织的饲养细胞层上。培养板上每孔接种375,000个辐照的mEF，辐照培养板以抑制增生但允许支持pPS细胞的因子合成，并且在接种后使用5小时到4天(美国专利6,200,806)。最近已开发人饲养细胞，用于支持人胚胎干细胞的增殖而不引起分化(WO 01/51616；USSN 09/888309；Geron Corp.)。通过分化hES细胞、选择具有所需活性的细胞、然后通过转染它们表达端粒酶反转录酶而无限增殖而获得这些细胞。
即使没有饲养细胞也能将pPS细胞维持在一种未分化状态。无饲养细胞培养的环境包括合适的培养基，特别是细胞外的基质如Matrigel或层粘连蛋白。以＞15000个细胞每平方厘米接种pPS细胞(最佳的是90,000cm-2到170,000cm-2)。无饲养细胞培养是由含有能支持细胞增殖而不分化的因子的营养培养基支持的。可通过使该培养基与分泌该因子的细胞如被照射的(～4,000rad)初生小鼠胚胎成纤维细胞、端粒化的小鼠成纤维细胞、或者衍生自pPS细胞的人饲养细胞一起培育而引入所述因子。可通过将饲养细胞以～5-6×104/cm2的密度接种在无血清、补充了20％血清替代品和4-8ng/mL bFGF的培养基(如KODMEM)中而调理该培养基。进一步用bFGF补充调理了(conditioned)1-2天的培养基，并用该培养基来支持pPS细胞培养1-2天。无饲养细胞培养方法的特点在国际专利出版物WO 99/20741和WO 01/51616；以及Xu等，Nat.Biotechnol.19971，2001中有进一步的讨论。
在显微镜下，ES细胞看起来具有高核/质比，显著的核仁，以及具有难以辨别的细胞连接的致密集落。灵长类ES细胞通常表达阶段特异性的胚胎抗原(SSEA)3和4、用抗体可检测的标记物Tra-1-60和Tra-1-81(Thomson等，Science2821145，1998)、以及端粒酶活性。pPS细胞在体外的分化导致了SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81表达的消失，并提高了SSEA-1的表达，这也在未分化的hEG细胞中发现。
从干细胞中生成少突胶质细胞本发明中的少突胶质细胞谱系细胞是通过在能富集和扩增具有所需表型的细胞的特定生长环境中培养干细胞而得到的。这个生长环境可以特异地指引分化成少突胶质细胞谱系，促进所需细胞的生长，抑制其他细胞类型的生长，或者表现出这些活性的任一组合。
这一部分向读者阐述一些得到本发明的少突胶质细胞所采用的方法。除了另外要求的地方，所提供的关于突起的潜在机理的解释仅仅作为帮助进一步研究的指导性假设，使用者不用必须理解这个假设，也不需要为了用于实践而使本发明符合这个假设。现在申请人已证明少突胶质细胞能从多能干细胞中制备，可对这些方案进行调整，也可采用其它的方法获得本文所述的新颖产物。
从pPS细胞获得少突胶质细胞的步骤包括a)获得确定产生少突胶质细胞的细胞群；b)少突胶质细胞谱系细胞的扩增；以及c)这些细胞进一步成熟为后期少突胶质细胞。
指引干细胞分化为少突胶质细胞谱系生成少突胶质细胞的过程通常包括二个方面引起起源(originating)干细胞群分化，以及使少突胶质细胞谱系细胞成为优势细胞类型。这些事件可相继发生或同时发生。
分化过程可通过引起pPS细胞形成胚状体或团聚体来诱导例如，通过供体pPS细胞培养物的过渡生长，或通过在具有低粘附性质底部的培养容器中悬浮培养pPS细胞，这种低粘附性质允许胚状体形成。在一个典型的方法中，收获汇合的hES细胞单层培养物后接种在非粘附细胞培养板上，保持细胞悬浮，并用营养培养基提供定期的饲养。
作为选择或另外地，通过与防止细胞保持未分化表型的某些因子一起培养可启动分化过程。初期的分化因子并不需要限制分化成少突胶质细胞谱系，但是在分化群中的细胞类型的范围内应包括少突胶质细胞或它们的前体。这种类型的典型生长因子是结合类维生素A受体的配体，或者是能活化细胞外信号激酶(ERK)途径的配体。当分化过程进行时，培养基中包含有促分裂原如成纤维细胞生长因子(或在下一个部分列出的那些)，以促进增殖。
在一些时期，可将该培养物更特异地引向少突胶质细胞谱系。这可通过在培养基中包含一个更特异地促进少突胶质细胞生长的因子来完成。典型的少突胶质细胞分化因子是结合细胞表面或细胞核中的甲状腺激素受体的配体和抗体，浓度大约在40ng/mL的T3(3，5，3’-三碘-L-甲状腺原氨酸)和T4(L-甲状腺素)是这样的例子。据信甲状腺激素能增加维甲酸受体的表达，并且能促进分化成少突胶质细胞谱系细胞。
另一种少突胶质细胞的分化因子是硒，一种被认为在分化成少突胶质细胞中参与髓磷脂基因上调的抗氧化剂。其他候选的分化因子是另外的抗氧化剂如维生素E，以及提高硒是其辅助因子的酶的活性的因子，例如硫氧还蛋白还原酶和碘化甲状腺素脱碘酶(iodothyronine deiodinase)家族。当硒在培养基中含有相对高浓度，至少20ng/mL或100ng/mL，并以亚硒酸盐离子(SeO32-)形式存在时，硒尤其有效。其他候选分化因子或辅助因子包括骨形成蛋白(BMP)，和sonic hedge hog(SHH)，以及白血病抑制因子(LIF)。还考虑的是神经组织产生的少突胶质细胞分化因子的组合，它们产生于与含有选择的分离神经组织或细胞系的共培养，胚胎的CD-1小鼠大脑以及从组织或细胞系中得到的包含因子的提取物是这样的例子。
已发现，通过把所有这些技术结合起来，少突胶质细胞能以惊人有效的方式产生在促分裂原、常规分化因子如维甲酸、和特定分化因子如甲状腺激素和亚硒酸钠的存在下形成胚状体而启动分化。在实施例部分提供的非限制性例子包括了这些因子和其他标准培养组分，例如养分补充剂，生长因子如胰岛素，以及抗生素。在分化起始时包含有合适的分化因子组合，培养会快速地产生更定向于少突胶质细胞谱系的细胞。
增殖少突胶质细胞谱系细胞作为将细胞用于所需目的之前的一个任选步骤，本发明的使用者可能想通过在培养中进一步增殖来增加少突胶质细胞谱系细胞的数目。
这可以通过在营养介质中存在一种或多种促分裂原时培养细胞来完成。例子是成纤维细胞生长因子家族成员，例如FGF-2(碱性FGF)，以及FGF-4。同样可以举例的是表皮生长因子(EGF)，功能性同系物，以及其他结合EGF受体的因子。其他候选的生长因子是衍生自血小板的生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)，以及提高环AMP水平的因子，如毛喉素。
当存在这样的促分裂原时，分化因子引发剂如维甲酸能被取消。因为促分裂原导致细胞非特异地生长，继续使培养基中包含少突胶质细胞特异的分化因子常会有利于保持少突胶质细胞谱系细胞的优先生长。调节培养基中促分裂原的平衡也能有助于少突胶质细胞的优先生长。例如，EGF可维持外胚层细胞但不是成纤维细胞，当FGF不再存在时，外胚层细胞可能会死亡。一旦严格依赖FGF的细胞被除去，则可将FGF加回培养基中以加速所需细胞类型的生长。
作为细胞制备中的另一可选步骤，本发明的使用者可能会希望把少突胶质细胞谱系细胞从培养基中可能存在的其他细胞类型中分离出来。可考虑采用多种分离方法，例如介导粘附或针对细胞表面标记物进行挑选的抗体或外源凝集素。用于阳性和阴性选择的合适的表型标记物在下面列出。还考虑的是利用启动子-报告子(promoter-reporter)质粒筛选少突胶质细胞谱系细胞，该质粒利用组织特异性启动子来构建，例如UDP-半乳糖神经酰胺半乳糖基转移酶(CGT)、2’，3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶(CNP)、NG2蛋白聚糖、NCAM、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、或各种髓磷脂相关的蛋白的启动子，连接于报道子基因，如碱性磷酸酶、绿荧光蛋白、或荧光素酶。
已发现，通过把细胞吸附在合适的底物上，能以更简单的方式从在存在少突胶质细胞分化因子条件下繁殖的其它细胞中分离出少突胶质细胞谱系细胞。少突胶质细胞携带有细胞特异性的碳水化合物和细胞表面受体，并将优先吸附到共轭配体上。具体而言，可以通过吸附于特定基底膜成分来分离少突胶质细胞，所述成分如层粘连蛋白、明胶、或Matrigel，后者是一种商业上能得到的来自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的胞外基质制品，它在室温中胶化成一种再生(reconstituted)的基底膜(实施例1)。一旦少突胶质细胞已吸附在基质上(几小时到几天)，其他细胞类型能被洗去，吸附的细胞可通过如短暂的胰岛素消化回收。除了富集所需的细胞类型外，这个操作方法具有打碎大细胞块的优点，使得进一步的操作省力。
分离操作程序的有效性能通过测量针对下面所列标志的富集来评定。一旦少突胶质细胞通过这种方式被纯化，它们能如已经叙述的那样在存在促分裂原时进一步增殖，如下面部分所描述的那样成熟，或者以适用于最终用途的方式配制。
进一步成熟当需要时，本发明的细胞在复制期后能够进一步分化成有功能的表型。这样做以表征祖细胞的潜力，或者得到用于治疗或药物筛选目的的末期细胞。
通过以抑制前体表型进一步增殖的方式改变生长条件而实现成熟。例如，细胞可以接种在如能促进成熟表型出现的聚-L-赖氨酸的底物上。作为选择或另外地，一种或多种用于增殖细胞的生长因子被取消。可将促进成熟的因子包含在成熟培养基中，例如睫状神经营养因子(CNTF)，和CNTF受体的其它激动剂。一旦细胞达到所要求的的成熟度，它们可以从培养基中收获(例如使用胰蛋白酶或胶原蛋白)并被配制，以用于分析或最终用途。
分化细胞特征可根据许多表型标准表征细胞。这些标准包括但不局限于显微镜观察到的形态特征、表达细胞标记物的检测或定量、体外可测量的功能性标准，以及灌注给宿主动物后的行为。
表型标记物可根据是否表达少突胶质细胞表型标记物特征表征本发明的分化细胞。针对少突胶质细胞的可能依赖于细胞群成熟而存在的经典免疫细胞化学标记物为下列各项●NG2，硫酸软骨素蛋白聚糖，由巨噬细胞和少突胶质细胞祖细胞表达●半乳糖脑苷脂(GalC)，针对指定少突胶质细胞的标记物●髓磷脂碱性蛋白(MBP)，成熟髓磷脂和生产髓磷脂细胞的标记物由少突胶质细胞谱系细胞表达的其它有用标记物包括如下●PDGFRα，PDGF的膜受体，由少突胶质细胞祖细胞(oligoprogenitors)、少突胶质细胞和其他细胞类型表达●TRα1，甲状腺激素的细胞核受体，由少突胶质细胞祖细胞(oligoprogenitors)、少突胶质细胞、神经元和其他细胞类型表达●髓磷脂蛋白脂质蛋白，髓磷脂的一种成分，在少突胶质细胞和神经胶质前体上表达●O4抗体定义的表位，少突胶质细胞、星形胶质细胞以及它们前体的标记物●波形蛋白，成纤维细胞类型的丝状蛋白，标记星形胶质细胞前体(在少突胶质细胞上经常为阴性)
●胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)，星形胶质细胞的标记物(在少突胶质细胞上阴性)●A2B5，II型星形胶质细胞、神经胶质祖细胞、少突胶质细胞祖细胞和胰腺的β细胞上表达的表位●RIP抗体识别的表位，能染色少突胶质细胞和它们的突起，并与脊髓和小脑中髓鞘化轴突相一致在向少突胶质细胞分化的路径中在不同时间表达的转录因子包括如下●Olig1，一种螺旋-环-螺旋(HLH)家族的转录因子，由少突胶质细胞祖细胞(oligoprogenitors)、运动神经元祖细胞和肾脏细胞表达●Olig2，HLH家族的转录因子，由少突胶质细胞祖细胞(oligoprogenitors)、运动神经元祖细胞(progenitors)和松果腺表达●Sox10，Sox家族转录因子，由少突胶质细胞祖细胞(oligoprogenitors)、少突胶质细胞，神经膜细胞，神经嵴(neural rest)、耳蜗、前列腺和黑素细胞表达●Nkx2.2，Hox家族转录因子，由少突胶质细胞祖细胞(oligoprogenitors)、少突胶质细胞、神经元祖细胞、胰腺α和β细胞表达●Pax6，HLH家族转录因子，由少突胶质细胞祖细胞(oligoprogenitors)、神经元祖细胞、胰腺α和β细胞、晶状体视网膜、垂体、肝脏和脾表达其他细胞类型的有用标记物包括如下●神经元核抗原(NeuN)，神经元成熟的标记物(一般在少突胶质细胞谱系细胞中阴性)●III级β-微管蛋白(TuJ1)，另一种神经元细胞标记物●微管相关蛋白2(MAP-2)，CNS细胞的标志(可能是阳性的)● SSEA-4、Oct-4和端粒酶反转录酶(TERT)，未分化pPS细胞的标记物(在少突胶质细胞和它们的前体上阴性)组织特异性标记物可以用任何合适的免疫学技术来检测——例如针对细胞表面标记物的流式免疫细胞化学，或者针对细胞内或细胞表面标记物的免疫组织化学(例如，固定细胞或组织切面的免疫组织化学)。一种针对流式细胞术分析的详细方法见于Gallacher等，Blood 961740，2000。如果在免疫细胞化学或流式细胞仪试验中，任选地在固定细胞后，以及任选地使用标记的二级抗体或其它用于放大标记的偶联物，显著可检测量的抗体与抗原结合，则细胞表面抗原的表达被定义为阳性。
组织特异性基因产物的表达也可以通过Northern印迹分析、斑点杂交分析或者通过在标准扩增方法中采用序列特异性引物进行反转录酶起始的多聚酶链反应(RT-PCR)而在mRNA水平上检测到。更多细节参阅美国专利No.5,843,780。特定标记物的序列信息可从公共数据库如GenBank中得到。例如，髓磷脂半乳糖脂生物合成酶UDP-半乳糖神经酰胺半乳糖基转移酶(CGT，GenBank登录号No.AH006651)是一种在GalC合成中催化最后一步的酶。
为了促进在研究或治疗中的应用，把细胞群中具有少突胶质细胞和它们前体特征的细胞比例最大化常常是有益的。如以下实施例部分所描述的，有可能获得几乎具有从大约至少20％，到大约超过60％、80％、90％、95％或甚至98％的少突胶质细胞前体或成熟细胞(或两者混合物)的细胞群，这些细胞的任何表型标记物特征中的一个、二个、三个或更多个被确定为阳性(如上所述)。
对于涉及神经功能重组的治疗应用，经常需要使细胞器形成其它细胞类型的能力最小化——尤其是未分化的pPS细胞和非外胚层谱系的细胞。取决于实际的应用，把神经元谱系细胞和它们的指定前体，星形胶质细胞谱系细胞和它们的指定前体，以及神经胶质细胞或所有神经细胞类型的普通前体的比例最小化也是有利的。在某些实施方式中，本发明的少突胶质细胞群受这些其它细胞类型的污染少于～1％、0.2％、或0.05％。
熟练的技术人员早已知晓作为少突胶质细胞谱系细胞特点的形态特征。少突胶质细胞有时会出现双极形状，从身体中央向相反的极延伸出两个突起。它们可能也会具有相对扁平细胞的形状，携带有少突胶质细胞许多相同的标记物和其他特征。通过相对缓慢的生长速度和对细胞外基质和可溶解的因子的依赖性，它们能与其他细胞(如成纤维细胞)区分出来。双极形的细胞和扁平的细胞可相互转换，依赖于促进扁平细胞占优的生长因子(例如EGF，bFGF)的存在或缺乏。本发明的前体细胞群可包含至少约20％、40％、60％、80％或更多的两极形的或扁平的细胞表型。
在分化成更成熟的少突胶质细胞后，突起的数目和复杂性通常会增加。突起之间会出现髓磷脂网状物，后者缠绕在单根轴突周围，形成促进神经沿着该轴突传递的髓鞘。
基因型特征当衍生自分离的pPS细胞或已建立的pPS细胞株时，本发明的少突胶质细胞可被表征为作为起源细胞或细胞系的后代。因此，少突胶质细胞会具有与衍生它们的细胞相同的基因组。这意味着除任何核型变化之外，在pPS细胞和少突胶质细胞之间染色体DNA会有超过90％是相同的。经重组方法引入一个转基因或剔除一个内源性基因的少突胶质细胞仍然被认为具有和衍生它们的细胞系一样的基因组，因为所有非操作的遗传成分都被保留着。
可通过标准的遗传指纹法技术鉴别少突胶质细胞和pPS细胞具有相同的基因组。具有相同的基因组也可推测少突胶质细胞是否通过正常的有丝分裂从未分化细胞系获得。
在某些工业应用中，这一特征是本发明少突胶质细胞有价值的特征。特别地，原始pPS细胞的可获得性进一步提供遗传学匹配的少突胶质细胞，因为可促成pPS细胞增殖、再分裂和分化成更多所需要的少突胶质细胞。此外，pPS细胞能分化成其他治疗上重要的谱系。例如，它们可以分化成能帮助将所需的受体耐性呈递给具有匹配的少突胶质细胞的植入物(engraftment)的免疫耐受细胞群(国际申请PCT/US01/43434，Geron Corp.)。
通过在分化前或后使细胞增殖，本申请所述的技术允许产生具有相同基因组的大细胞群的少突胶质细胞谱系细胞。具有108、1010、或1012个细胞的细胞群理论上是可能的。这样大的细胞群通常被分装入适合进一步培养、药物筛选或治疗给药的独立容器中。
本发明某些实施方式包括原始细胞(例如未分化的pPS细胞系或中间的细胞群)与具有神经胶质细胞或少突胶质细胞特征的分化细胞的结合。这两个细胞群可以放在同一容器中，在同一设备的独立容器中，或两个不同地方。未分化的和分化的细胞可以同时存在或在不同时间存在，例如当未分化细胞的培养物被诱导使它或它的全部分化成少突胶质细胞谱系细胞时，如已叙述的。
功能特点为了质控目的，通常需要按照功能标准表征本发明的分化细胞特点。不同功能可能具有相对不同的兴趣，这依赖于所要的最终用途。例如，可针对于它们在组织培养中再髓鞘化神经组织的能力、在体内修复诱导了脱髓鞘化的位置的能力，或它们在受损对象中恢复神经功能的能力来评估细胞。许多实验模型的存在是为了测定这些特征，包括下面非限制性例子。
1.在协同培养中体外髓鞘化从2-3月龄大鼠收获腰椎和颈DRG神经元制得成年背侧根神经节(DRG)培养物。将这些细胞捣碎，离心，并在DMEM F12培养基中以每毫升～100,000活神经元的浓度再悬浮，然后接种到包涂有层粘连蛋白的盘中4个星期。加入～2.5×104少突胶质细胞谱系细胞、并每天给料(feeding)培养额外4周，从而进行体外髓鞘化。Target和Blakemore(Eye 8(part2)238，1994)阐述了采用人少突胶质细胞对啮齿动物轴突进行的髓鞘化。
为了检测少突胶质细胞形成髓磷脂的能力，协同培养物用4％多聚甲醛过夜固定并对GalC染色。选择邻近神经节的可见区域，并针对每个区域内髓磷脂片断的数目记分。分化能力是通过对低密度培养物的标记物如巢蛋白(nestin)、β-微管蛋白III、GFAP、CNP、GalC、Ki-67抗原、NeuN、或神经丝70染色而测定的。
培养中DRG髓鞘化的证据通常与少突胶质细胞的生物学功效相关联。采用合适的动物模型可进一步获得细胞在体内存活并增强髓鞘化或轴突再生长的能力。另一方面，协同培养中的髓鞘化将依赖于培养的条件，并且阴性结果不能排除在体内的功效。可通过调节培养条件而改善体内试验的预期价值例如加入据认为能增强髓鞘化的因子，如IGF，或神经营养蛋白样NT-3。
2.慢性脱髓鞘模型慢性脱髓鞘的区域可以在成年大鼠背柱中被诱导(Keirstead等，J Neurosci.197529，1999)。在采用铅屏蔽下，脊髓在2cm的距离(集中在T9上)处暴露于40G的X辐射下，这样会把缺口引入被暴露的细胞DNA中，导致正在分裂的细胞死亡。此后，2天后在T9直接的溴化乙锭脊髓内注射。溴化乙锭是一种DNA嵌入螯合剂(interchelating)，能杀死暴露于其中的细胞，提供慢性脱髓鞘的非细胞区域和背柱面积的～60％无活性少突胶质细胞和星形胶质细胞。
三天后，将少突胶质细胞谱系细胞移植到这些动物脱髓鞘的位置中。任选地，这些细胞可以用48h前加入到培养基中的溴脱氧尿苷(BrdU)预标记。起初，以～30个前体的群落制备细胞，浓缩到每微升～60,000个细胞的密度。使用一个～80um外径的牵引式玻璃微移液管在10分钟内将一微升细胞给予到受损位置。大约2～4周后，准备好组织样本，以用于树脂或恒冷箱切片成1mm横块。
来自冠状正面的部分用甲苯胺蓝染色，并对普通病理学、再髓鞘化证据和细胞形态学进行分析。因为被诱导区域是非细胞性的，移植后出现的细胞是衍生自所给予的细胞。恒冷箱切片可针对相关细胞类型的标记物进行染色，例如GFAP(星形胶质细胞)、CNP(少突胶质细胞)、RIP(少突胶质细胞)，或NeuN(神经元)。超薄部分也能用电子显微镜分析髓磷脂薄层数量和细胞超微结构。贯穿脱髓鞘过程的移植细胞的重新分配，以及向成熟髓鞘化细胞的分化能被检测到。大约25％、50％或75％脱髓鞘轴突的再髓鞘化百分率是生物功效提高的证据。
也可在先天性髓鞘化异常(dysmyelination)的模型中测试少突胶质细胞谱系细胞的治疗能力。涉及髓磷脂碱性蛋白突变或缺陷的已建立模型包括发抖突变小鼠(Roach等，Cell42149，1985)和Long Evans shaker大鼠(Kwiecien等，J.Neurocytol.27581，1989；Delaney等，Lab.Anim.Sci.45547，1995)。可通过脑内室(intracerebroventricular)或池移植(Mitome等，Brain 1342147，2001)、或者通过直接给予到脊髓中(Liu，McDonald等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA976126，2000)测试重新构建。在涉及MBP突变或缺陷的模型中形成的致密髓磷脂直接归于所给予的细胞，因为这些动物通常不具备正确的髓鞘化能力，结果遭受神经学缺陷所困。
3.脊髓损伤模型针对SCI的模型包括挫伤性损伤和背对切(dorsalhemisection)。对于挫伤性损伤，采用适当的脊柱挫伤性损伤设备，将脊柱路线(course)被移位～0.9mm(中等损伤)超过23msec。对于对切损伤，采用定向控制器用尖头解剖刀片将脊髓的背侧一半切掉。两个操作之后都进行适当的术后护理。
为了促进植入细胞的移动和去除髓磷脂相关的生长抑制物，任选地将脊髓脱髓鞘(Keirstead等，Exp Neurol.151303，1998)。在轴突损伤部位尾部和脊椎管的中央产生2mm的孔。向暴露的脊髓注入约4微升的用33％豚鼠补体(Herlan SeraLab)磷酸盐缓冲液以1∶2稀释的多克隆抗-GalC抗体(Chemicon)。
在损伤后～24小时，通过牵引式玻璃微移液管向这些动物植入少突胶质细胞谱系细胞。或者，通过停止治疗1-3个月来建立慢性损伤模型。用细胞治疗后，可使用录像磁带记录功能反应，并定期监测临床改善证据。例如，可使用BBB等级(BBB scale)定量测定地上运动，该BBB等级是一个基于关节运动、体重支持、四肢协调的其它特征的21-点等级(实施例2)。
对于组织学检查，可对动物预注射示踪剂，如生物素标记的霍乱毒素β-亚单位(CTB，4ul0.1％双侧进入坐骨神经)，或者生物素化葡聚糖胺(BDA，10ul10％，进入感觉运动皮层)。大约2周后，制备脱髓鞘模型的组织切片，用于定位移植细胞的位置并作为再髓鞘化的证据，通过形态学标准能将它们与正常髓鞘化或部分脱髓鞘区别。还分析切片中标记有注入的示踪剂的轴突，以获得特征性神经突生长锥的证据。可通过对神经元标记物如RT97抗原(神经丝的一种标记物)、血清素(5HT)、去甲肾上腺素(NE)和降钙素基因相关肽(CGRP)进行染色而评估轴突再生的免疫细胞化学证据。
少突胶质细胞的遗传修饰本发明某些少突胶质细胞前体细胞群具有真实的增殖能力。如果需要，通过增加内源性基因的转录或导入转基因而增加细胞中端粒酶反转录酶(TERT)的水平，从而可进一步增强这种复制能力。特别适合的是人端粒酶(hTERT)的催化组件，提供于国际专利申请WO 98/14592。Bodnar等(Science 279349，1998和Jiang等，Nat.Genet.21111，1999)描述了在人细胞中端粒酶的转染和表达。
可提高未分化pPS细胞中端粒酶(telomerase)的表达，然后这些细胞能分化成本发明所述的少突胶质细胞。或者，这些pPS细胞能分化成少突胶质细胞前体，然后转染以提高TERT的表达。可根据标准方法，通过RT-PCR、端粒酶活性(TRAP试验)、针对TERT的免疫细胞化学染色或复制能力评估遗传改变的细胞在某些应用中也考虑使细胞无限增殖的其它方法，例如用编码myc、SV40大T抗原或MOT-2的DNA转化细胞(美国专利5,869,243，国际专利申请WO 97/32972和WO 01/23555)。
如果需要，可制备或进一步处理本发明的细胞，以体外除去未分化的细胞，或体内提供针对回复体的保护。使细胞群中未分化干细胞耗尽的方法，是用其效应子基因受诱导未分化细胞优先表达的启动子(如TERT启动子或OCT-4启动子)控制的载体转染细胞群。该效应子基因可以是引导细胞筛选的报告子，如绿荧光蛋白。该效应子可以直接裂解到细胞中，编码如毒素，或者细胞凋亡的介体，例如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)(Shinourad等，Cancer Gene Ther.7739，2000)。该效应子基因可具有使细胞易感于外源制剂如抗体或前体药物的毒性效应的作用。代表性的例子是单纯疱疹胸腺苷激酶(tk)基因，能导致表达它的细胞对9-〔1，3-二羟-2-丙氧甲基〕鸟嘌呤易感(美国专利6,576,464 B1)。或者，该效应子能引起外来决定簇在细胞表面表达，这种决定簇能使回复到未分化表型的任何细胞对体内自然产生抗体易感(美国2003-0032187 A1)。
还可遗传改变本发明的细胞，以增强它们在组织再生中的能力，或者增强它们将治疗基因送递到治疗对象中的能力。采用所需基因的已知编码序列来设计载体，操作性连接于组成型(如CMV启动子)或在少突胶质细胞谱系细胞中特别有活性(如髓磷脂碱性蛋白的启动子)的启动子。可根据此策略表达各转基因，例如增强少突胶质细胞生长、激活再髓鞘化、或促进轴突再生的那些转基因。代表性例子是编码神经生长因子的基因(美国专利5,885,584和6,268,340)。
在研究和临床治疗中少突胶质细胞的用途本发明提供了用于各种重要研究、开发和商业目的的生产大量少突胶质细胞的方法。
本发明的细胞能用于制备相对没有被在来自其他谱系的细胞中优势表达的cDNA污染的cDNA文库。本发明的分化细胞根据标准方法还可用于制备对少突胶质细胞和它们的衍生物的标记物特异的单克隆或多克隆抗体。
特别感兴趣的是本发明组合物在药物开发和临床治疗中的用途。
药物筛选本发明的细胞能用于筛选影响少突胶质细胞前体和成熟少突胶质细胞特性的各种因子(如溶剂、小分子药物、肽、多核苷酸)或环境条件(如培养条件和操作)。
在一个实施例中，使用pPS细胞(未分化的或启动进入分化程序(paradigm)的)筛选促进成熟为少突胶质细胞或促进长期培养中少突胶质细胞的增殖和维持的因子。例如，将候选的成熟因子或生长因子加到不同孔中的细胞中，然后根据细胞的进一步培养和用途的所需标准检测所产生的任何表型变化。这可导致改进的针对pPS衍生的少突胶质细胞和从初生(primary)神经组织中分离出来的少突胶质细胞和它们的祖代的衍生和培养方法。
本发明的其他筛选方法涉及测试药学化合物对少突胶质细胞的生长、发育的潜在不利影响或毒性。这种类型的筛选不仅在化合物被设计成对少突胶质细胞本身有药理学影响时是适当的，而且它们也适用于测试针对它处基本药理学影响而设计的化合物的少突胶质细胞相关副作用。
其他筛选方法涉及使用少突胶质细胞测量在其髓鞘化轴突的作用中对少突胶质细胞活性具有潜在影响的小分子药物的作用。为此，可体外混合这些细胞和待测化合物，并测定该化合物对髓磷脂相关活性的影响——例如，髓磷脂相关组分如髓磷脂碱性蛋白的表达；组织学上可检测的髓鞘的形成；以及在与神经细胞的协同培养中髓鞘化相邻轴突的能力。
对于药物筛选的一般原则，读者可参考美国专利5,030,015以及教科书“Invitro Methods in Pharmaceutical Research”，Academic Press 1997。候选药学化合物活性的评估通常包括将本发明的分化细胞和候选化合物混合，可单独或与其他药物混合。研究者测定归因于该化合物的细胞形态学、标记物表型或功能活性方面的任何变化(与未处理的细胞或用惰性化合物处理过的细胞相比较)，然后使化合物的作用与观察到的变化相关联。
临床治疗中的少突胶质细胞本发明提供少突胶质细胞前体细胞和它们的衍生物在需要这样治疗的病人中保持或恢复神经功能的用途。具体而言，为了使神经元阻止再髓鞘化，或者为了给神经网络的维持或再生提供支持，可给予本发明的细胞。不包含任何限制，所给予的细胞可以具有稳定或提高已经在适当位置的神经元的功能，或者辅助神经元在相互之间或与它们控制的组织形成新的连接。
药物组合物的性质将部分依赖于待治疗的病症。在一些实例中，采用具有良好的复制能力和操作复原的前体细胞(NP2或GalC阳性)配制组合物是适当的。在其他实例中，采用更成熟的细胞(GalC或MBP阳性)配制组合物以提供更直接的髓鞘化能力也是适当的。
现已发现，通过把悬浮培养中形成的大团聚体吸附到合适的基质上，如Matrigel，可容易地从pPS衍生的细胞获得相对分散的少突胶质细胞谱系细胞群。把培养的细胞接种在底物上几小时到几天，并去除未吸附的细胞。然后采用合适的化学或机械方法收获少突胶质细胞谱系细胞，例如经短暂酶消化后进行研磨。据信，不多于～30个细胞的单分散细胞群或簇在细胞操作、保持性能和给予后提供有益作用的能力方面是有利的。通常洗涤这些细胞，然后以适合于给予有效剂量以将细胞维持在疾病部位的浓度将其悬浮在药学上兼容的培养液中(即每微升20,000到100,000个细胞，根据治疗区域的体积来测量)。
根据针对神经学适应治疗的通常程序来准备患者。采用标准的免疫抑制治疗(如环孢霉素A)来治疗患者，以防止排斥。选择地或另外地，采用造血细胞或来自同一pPS细胞系的未分化细胞，他们可以特异性耐受少突胶质细胞的异型(WO 02/44343；WO 03/050251)。在一些实例中，使损伤部分的神经元短暂脱髓鞘化可能是有利的，这可改善给予的细胞的进入(access)或去除可能抑制再髓鞘化的因子。实现这些的一个方法是将局部环境补体固定的抗体给予髓鞘上的一个或多个表位，如GalC、O4、或髓磷脂相关糖蛋白。参见Keirstead等，Brain Res.Bul.44727，1997；以及加拿大专利2,253,078。然后在需要神经功能髓鞘化或再生的部位或其周围给予一剂或多剂本发明的分化细胞。
然后让对象接受支持性的术后护理，并监视其移植接受性或神经功能的再生。适当时，患者可同时接受据信能恢复少突胶质细胞功能的其他方法的治疗，例如Fampridine-SR(4-氨基吡啶)。可采用免疫细胞化学分析组织学样本的相关标记物，如先前所述的，并评估各种功能性事情，例如由所给予的细胞的存在引起的轴突再髓鞘化以及轴突萌发。可根据患者疾病的典型病理特征监测患者临床症状的维持或改善，并进行功能评估，例如在增殖无能状态等级的基础(expanded disability status scale，EDSS)上。
适合用本发明组合物治疗的病症包括但不限于涉及渐进性脱髓鞘的病症，以及其维持或生产髓磷脂的能力可能有助于治愈或帮助预防进一步恶化的中枢神经系统损伤。
多发性硬化是一种以大脑或脊髓中脱髓鞘的弥散性修补(patch)为特征的缓慢渐进性疾病。脱髓鞘斑以及少突神经胶质的破坏和血管周围的炎症发生在整个CNS中，主要在白质(尤其在颈部或背侧地区)、视神经以及室周区域。中脑、脑桥和小脑、大脑中的灰质和脊髓也受到影响。
急性弥散性脑脊髓炎(感染后脑脊髓炎)的特征是血管周围CNS脱髓鞘化，它可自发地发生，但通常发生在病毒感染或病毒疫苗接种之后。慢性炎性脱髓鞘多神经根神经病(CIDP)的特征是神经内膜间隙和血管周围收到炎性T细胞和巨噬细胞的浸润，并导致末梢神经的节段性脱髓鞘。HTLV相关的脊髓病是以双腿痉挛性无力为特征的一种慢性渐进性脊髓疾病。一些末梢神经病，例如急性热病性多神经炎，也是以脱髓鞘为特征的。
先天性代谢病(例如苯丙酮尿症和其他氨基酸尿症；泰-萨病、尼曼-皮克病、和戈谢病；胡尔勒综合征、克拉贝病和其他脑白质营养不良)会影响CNS中发育的髓鞘，并会导致永久性、广泛性的神经缺陷。肾上腺脑白质营养不良(adernoleukodystrophy)和肾上腺髓神经病(adrenomyeloneuropathy)以肾上腺功能障碍和神经系统的广泛脱髓鞘为特征的X-连锁退行性代谢病。家族性中叶性硬化是一种由于蛋白脂质蛋白基因中点突变而无法形成髓磷脂的疾病。Leber’s遗传性视神经萎缩和相关的线粒体疾病首先主要以中心视力的两边丧失为特征。
任何急性或长期的由CNS的创伤所导致的异常，以及与通过缺氧和缺血引起髓磷脂的损失的病症都可以考虑加以治疗。包括于这一类的病症有中风或创伤性脑损伤相关的病症。
导致任何级别的截瘫或不完善的运动功能的各种脊髓损伤是采用本发明细胞进行治疗的首要候选者。依赖于性质和可及性，对于颈部、腰部、胸部和骶骨脊柱的损伤都可获得它们症状的改善或稳定。导致SC功能完全或不完全丧失的急性损伤可同时或在减压外科手术后立即治疗。慢性病症在需要的时候治疗或再治疗。可使用针、插管、或其它合适的装置在损伤部位上或在其周围以外科手术、内窥镜检查或经皮注射给予细胞。如果得到批准，可使用诱发电位试验测试电生理学功效。也可使用各种标准，如美国脊椎损伤协会(ASIA)运动评分、Ferrans和Powers生命指数质量(QLI)，评估患者运动和感觉传导路(sensory pathway)中的临床改善。
总的说，对于患者选择、给药方式、以及复原监测的最终职责是临床医生的责任。
为了商业配送的目的，通常以药物组合物的形式提供本发明的少突胶质细胞，该组合物含有等渗赋形剂，并且在对人给药时充分无菌的条件下制备。本发明也包括了一个试剂系统，包含有在制造、配送或使用中存在于任何时间的细胞集合(set)或组合(combination)。这个细胞集合包含本发明描述的两个或更多细胞群的任一组合，例子包括但不限于一类分化的pPS衍生的细胞(神经胶质细胞、少突胶质细胞、它们的前体和亚型等)与未分化的pPS细胞或其他分化的细胞类型(有时候具有相同的基因组)的组合。同一集合中的各细胞类型在同一时间或不同时间，在相同实体或具有商业关系的不同实体的控制下，可一起包装，或包装在相同设备的独立容器中，或在不同的地方。
对于细胞组合物的药学配制中的一般原则，读者可以参考“细胞治疗干细胞移植，基因治疗，以及细胞免疫治疗”，由G.Morstyn和W.Sheridan编辑，剑桥大学出版，1996；以及“针对神经疾病的细胞移植”，T.B.Freeman等编辑，Humana Press，1998。细胞可以被包装在一个适合配送或临床使用的设备或容器中，任选地伴有涉及细胞保存或它们作为药物治疗上述临床病症的用途，或用于任何其他值得做的目的的信息。
提供下面的实施例用于进一步阐述本发明的特定实例，但不起限定作用实施例实施例1hES细胞分化成少突胶质细胞在用原代小鼠饲养细胞调理过且含加入bFGF的剔除型(knockout)(无血清)培养基中，在Matrigel基质上，在没有饲养细胞的条件下，人类胚胎干(hES)细胞H7和H1细胞系以未分化的状态繁殖(WO 99/20741；WO 01/51616，GeronCorp)。
根据下面的方案，hES细胞被分化成少突胶质细胞谱系细胞表1从hES中产生少突胶质细胞祖细胞
GRM是神经胶质限制培养基(见表2)。
转换培养基(TR)的制备是GRM和用于制备hES细胞的条件培养基的1∶1混合物。
表2神经胶质限制培养基(GRM)的组成部分
分化方案的实施如下●第1天用胶原酶IV(Gibco 17101-015)分离来自粘附基质上的ES集落，并且将该集落置于低粘附6孔培养板的含4ng/mLbFGF(Gibco 13256-029)的TR中。仅在分化方案的开始时，使用青霉素-链霉素(Gibco 10378-016)3天。
●第2-10天细胞与维甲酸一起培养(RA；全反式维甲酸，Sigma223018)，10μM，每天供料共计8天。RA原液被配制在DMSO中，浓度为6mg/mL(约为0.02M)。
●从第3天起，培养基用GRM替换，并且不再把bFGF加到培养中。培养基每天替换。在饲养过程中，因为RA对光敏感，所以光线被调暗至最小。从含ES细胞团聚体的孔中的培养基收集于15毫升试管中。在低速短暂离心(800rpm，1分钟)后，吸出上层清液并加入新鲜培养液。轻轻地用吸管上下吸取(2-3次)，确保6孔培养板的每个孔中4mL液体分布均匀。
●第10到15天第10天后，在每天的供料过程中，添加浓度为20ng/mL的EGF(Sigma E9644)和2ng/mL的bFGF。
●第15到21天从培养基中去除bFGF，而EGF持续维持浓度20ng/mL。
●第21天后通过维持含20ng/mL EGF的GRM培养基，产生了具有神经特征的新的团聚体/簇(即使在第42天后)。
●为了选择这些神经球形体(neurospheres)，在分化过程的第28天时，不采用任何解离方案，将全部培养物转移到Matrigel包被的6-孔板上(Matrigel130，BD Bioscience 356231)，培养12-20小时(过夜)。第二天，在轻轻摇晃培养物之后，只有神经球形体保持粘附，然后将其余培养液用新鲜的GRM培养液替代。
●在第35天，这些神经团聚体被接种于包被有聚-L-赖氨酸(Sigma P2636)和层粘连蛋白的4室成像玻片(Nalgene-Nunc International 154917)。用胰蛋白酶-EDTA的短时间处理(5分钟)，以解离细胞团聚体。细胞在PLL-层粘连蛋白上生长7天，在该期间培养物每隔一天供料。
●在第42天，培养物用多聚甲醛固定，并用免疫组织化学对细胞进行表征。采用的标志物是NeuN、半乳糖脑苷脂(GalC)、Map2、O4、波形蛋白(Vimentin)、GFAP。
结果显示在所附的相倒置(phase inverted)显微照片中。
图1显示了在转换培养液(50％神经胶质前体培养液)中悬浮培养两天的胚状体。
图2显示了在维甲酸中培养结束时，在分化第7天的球形体。从前3天起，清晰的球形体(sphere)开始出现在培养悬液中。至第7天，这些球形体占培养液中80-90％的细胞。
图3显示了在去除RA处理后，球形体发生瓦解。通过添加细胞到球形体的里面和外面，某些小泡继续生长；细胞的凝集表现出深阴影球状形态。在20ngEGF单独存在时，球形体瓦解。然而，通过加入低浓度bFGF，球形体可以被维持。某些球形体通过新细胞的加入能继续生长，导致了球状形态的、深阴影的细胞凝集形式。一些具有厚壁的小球形体可继续生长，但在几天后完全消失。因此，bFGF以低浓度(2ng/ml)在培养液中维持5天，并且通过加入细胞层，使球形体继续生长。
图4显示了在bFGF去除后出现的变化。大多数细胞团聚体开始解离，并且整个培养基充满单个细胞和小集落。同时，观察到新的明黄色的球形体(箭头)。
图5显示了在培养继续时，亮黄色球形体(箭头)被选择性地维持。新的球形体每天出现，一些是从其他球形体中以出芽方式形成，一些来自分离的细胞块，一些来自深色的细胞团聚体。
在第28天，整个培养基被吸附在Matrigel基质上过夜。只有定向为神经的(neural committed)的球形体吸附到基质上，而其余培养物继续漂浮。
图6显示了在接种于Matrigel上2-3天后，来自球形体的神经胶质定向的神经前体的迁移和分支情况。通过各细胞的纵向分裂，较小的集落形成一个圆圈，而大的集落表现出星状迁移并具有长突起。在生长于Matrigel上数天后，出现了更多的迁移细胞。
一周后，用胰蛋白酶使培养物从Matrigel上解离下，然后以低密度接种于包被聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白(Gibco 12163-010)的Nunc成像室，以便进一步表征。在层粘连蛋白基质上生长3-4天后，接种的细胞就具有少突胶质细胞的特征形态。
随后发现，Matrigel选择步骤能减少至10-20小时。非吸附的细胞被去除，然后将吸附细胞悬浮，并在含FGF、EGF和神经胶质前体的培养基中增殖。这有利于产生更分散的细胞群，更适合于治疗性给药及其他目的。
图7显示了该技术的结果。在吸附于Matrigel后，细胞增殖7天，接种于包被聚-L-赖氨酸层粘连蛋白上，并在无促分裂原下培养。这些细胞用4％多聚甲醛固定，并在3％羊血清和0.3％Triton-X 100去污剂中被封闭。免疫细胞化学分析的进行，是采用抗半乳糖脑苷脂(GalC，Chemicon)的抗体，之后用过氧化物酶标记的抗免疫球蛋白。细胞核用溶血毒素复染(第一图，20倍放大率；第二图40倍放大率)。
在视野中至少大约95％细胞的显示出GalC染色，(GalC是成熟少突胶质细胞谱系细胞的标志物)。
图8显示了对GalC进行染色的ES衍生少突胶质细胞的更高倍数的放大图(60倍放大率)。至少约10％或20％的细胞具有少突胶质细胞的形态学特征具体地，有许多突起，并且在突起之间有髓磷脂层所引起的网状物(webbing)。
实施例2hES衍生少突胶质细胞在体内导致再髓鞘化和神经发芽(sprouting)对于该实施例，采用与实施例1类似的策略(稍有改动)，将来自H7细胞系的hES细胞分化成用于移植的少突胶质细胞的前体细胞。GRM配方是相同的，不同点在于黄体酮浓度重新计算为65ng/mL。EGF从开始起就包含在培养物中，并且bFGF在第2天后被取消。
表3 来自hES细胞的少突胶质细胞祖代的生产
在第一周，在供料之前先在低速离心4-5分钟。在球形体开始生长后，通过使培养物在培养箱内于15-50mL锥形管中沉淀5-10分钟来进行饲养。在单次细胞悬浮中，表达粘附因子的细胞比非粘附细胞更快形成团聚体(球形体)和更快沉淀。这提高了具有细胞间粘附特征的培养物的纯度。
图9显示了在分化过程中细胞形态的进展过程。(A)在mEF条件培养基中，在无饲养细胞培养下，生长在Matrigel上的未分化hES细胞。(B)第3天之前，在含维甲酸的培养基中，在悬浮培养中，从胚状体中长出的透明球形体，这表明了快速的细胞扩散。(C)用维甲酸(阶段3)诱导神经谱系细胞，随后在EGF(阶段4)存在下出现少突胶质细胞前体细胞的定向化和增殖，其证据是黄色球形体的大量积累。(D)细胞然后接种于Matrigel，以便对所需细胞类型进行阳性选择。(E，F)当增殖阶段前进时，球形体的尺寸和占培养物的百分比是增加的。在优先选择之后，定向为神经胶质的祖细胞能被维持和并增殖长达8周。(G，H)随后在无促分裂原下，将少突胶质细胞的前体细胞接种于聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白上，导致它们在一周内具有成熟少突胶质细胞的形态。
图10显示了对成熟少突胶质细胞的免疫细胞化学分析结果。接种后一周，超过94％细胞被抗NG2的抗体所标记(NG2是一种早期神经胶质细胞的标志物)(A)。接种后八周，95％以上细胞的GalC(C)、O4(D)以及RIP(E)染色呈阳性。当细胞用抗-GFAP染色并用DAPI复染时，几乎所有未被少突胶质细胞标志物标记的细胞，都是GFAP阳性(B)。
然后，少突胶质细胞的前体细胞被施用于麻醉的成年Sprague Dawley大鼠的低胸脊髓，该大鼠具有用Infinite HorizonTM冲击设备(Precision Systems andInstrumentation，LLC)所导致的脊柱中等挫伤性损伤。
图11显示了用特异性抗人类核蛋白的抗体染色的，在施用了细胞后获得的组织切片。深暗的染色证实人细胞在移植后存活着。
图12显示了移植后9周后，用抗人核蛋白染色的、环绕脊髓的区域的横切片。这些动物已用环孢霉素A处理过以防排斥。这些细胞已经迁移或已经增殖成白质。
图13显示了用于检测细胞植入是否在给药位置产生不利影响的详细分析结果。沿着脊髓长度方向，贯穿未治疗动物和接受移植的动物的损伤位置，获得连续切片(serial section)。每棒(bar)显示在五个切片中测得的平均横截面积。(平均值±SEM)。靠近挫伤的较小横截面积是损伤后继发扩大的结果。少突胶质细胞不会引起保护(sparing)，但也不会使损伤加剧。这表明，hES衍生少突胶质细胞是安全的，即使在脊髓损伤的1mm以内给药时。
图14是从测量神经分支的实验中得到的。损伤后八周，对动物注射BDA，作为在皮质脊髓束中运动皮质的顺向示踪物。这些切片是在两周后获得的。只有在用hES衍生少突胶质细胞治疗过的动物中，才存在轴突分支的迹象在上部两个图中是染成深色的窄线。刚好在损伤上面的脊髓区域中观察到分支。
图15显示了在损伤和细胞植入位置(中心)起按1mm间隔测量得到的神经分支定量结果(针对每段3个切片的平均值±SEM)。在受到损伤且在该位置上3mm处没有接受治疗的动物中，计数被标记的轴突。治疗过的动物在损伤吻端(rostral side)直到中心处，具有明显更高水平的标记轴突。这证实了植入的细胞正在诱导再生可塑性。
图16是来自接受移植的动物的一系列切片的电子显微镜图片，显示了大量再髓鞘化的证据。在上面左图中的浓密圆圈是正常地髓鞘化的纤维。在这个区域中的其他轴突显示出薄的髓磷脂层。鞘与轴突的直径比表明，这些轴突是新髓鞘化的。上面右图是新髓鞘化的轴突的更高分辨率图像。有大约5或6个缠绕(wrap)，并且在顶部有轴突舌状物(tongue)，这代表了少突胶质细胞的前导边缘。这显示出这个轴突的髓鞘化是一个正在进行的过程。下图显示了神经膜细胞(Schwann cell)正在沉积形成厚的髓磷脂鞘。该过程的发生与移植体无关，并该过程在未治疗动物中提供有限程度的恢复。然而，只有接受hES衍生少突胶质细胞移植的动物，才显示出在上图中观察到的那种少突胶质细胞特有的髓鞘化证据。
实施例3少突胶质细胞谱系细胞的表型特征在这个实施例中，根据表4中方案，在用hES细胞系H7产生少突胶质细胞的过程中，跟踪标志物的表达。
表4 从hES细胞产生少突胶质细胞的祖细胞
在该方案的一般应用中，适合移植的少突胶质细胞的祖细胞是在固相选择步骤之后获得的(在约第23天后的任何时间)。在最后阶段中，可按需要进行培养使细胞增殖(至少8周)，并用胰蛋白酶的每隔一周进行一次传代。
为了该实施例的表型分析目的，用含5％剔除型血清替代物的GRM，对细胞进行低密度培养。当接种于Matrigel时，从第21天开始存在5％KO-SR会提高双极性细胞的增殖。当细胞以低密度接种于层粘连蛋白(15μg/mL，位于聚L-赖氨酸上)时，KO-SR改善了细胞的存活和生长。在方案中更早期使用KO-SR不影响分化过程，正如观察到的生长率和黄色球形体的比例所显示的那样。
图17显示了在未分化的hES细胞集落中检测到的标志。左图以黑白方式显示了特异针对每个标志物的抗体的红色荧光，该红色荧光被叠加DAPI染色的蓝色荧光上，从而标出了区域中所有细胞核的位置。右图显示了单独对标志物染色的结果。比较两个图片使得观察者能够评估在区域的所有细胞中表达有关标志物的比例。
顶部图显示了SSEA-4标记阳性的集落(SSEA-4是一种多能细胞标志物)。底部图显示了在对中胚层标志物BMP4呈标记阳性的集落四周的基质细胞。在每个集落中的未分化细胞都是BMP4阴性的。
图18显示了在分化过程中转录因子Pax6的短暂出现(左侧抗体加上DAPI；右侧仅抗体染色)。顶部图显示了在第10天的对簇中心的染色，在朝向外周的方向上，更多分化细胞已经被下调了。底部图显示在第35天的样本细胞中几乎没有染色。
图19显示了在早期阶段(正好在第10天去除维甲酸之后)的少突胶质细胞谱系细胞中检测到的标志物(左侧抗体加上DAPI；右侧仅抗体染色)。顶部图转录因子Olig1(83％±7％)。中部图转录因子SOX10(72％±12％)。底部图非特异性少突胶质细胞的祖细胞标志物A2B5(97％±3％)。
图20A-20B显示了在第35天完全分化的少突胶质细胞的祖细胞中占优势的标志物(左侧抗体加上DAPI；右侧仅抗体染色)。第一和第二行图(20A)NG2(硫酸软骨素蛋白多糖，一种少突胶质细胞前体的标志物)；第三行图(20A)GalC；第四行图(20B)O4；第五行图(20B)Tuj1(一种神经元标记物)。
这些结果显示至少大约80％的细胞是对少突胶质细胞标记物NG2、GalC和O4呈阳性。没有被少突胶质细胞标记物所标记的细胞，主要对神经元标记物GFAP或Tuj1呈阳性(20B，底部图)。双重免疫细胞化学分析显示，GFAP或Tui1呈阳性的细胞不共表达少突胶质细胞标记物。此外，没有检测到BMP4或SSEA-4，表明这些培养物缺乏未分化细胞或中胚层谱系细胞。该细胞群能在至少8个随后的传代中增殖。
实施例4在髓磷脂缺陷型的动物中hES衍生少突胶质细胞使轴突再髓鞘化为了证明这些细胞在体内所导致的髓鞘化是直接效果(而不是内源性少突胶质细胞的诱导)，将来自分化方案第28天的细胞移植入脱髓鞘的发抖小鼠模型中。对于位于1 8号染色体的髓磷脂碱性蛋白基因的突变而言，发抖小鼠是纯合的(Mbpshi/Mbpshi)。该基因被复制，并且大部分复制的基因是反向的，导致形成反义RNA；这导致了在整个CNS中严重的髓磷脂缺陷。
从培养物中收获少突胶质细胞的祖细胞，在DMEM中洗涤，浓缩，然后上样于包被硅的Hamilton注射器中。在该实验中，就象在所有实验中一样用10mg/kg环孢霉素A来免疫抑制动物。六周后，杀死这些动物，取切片用于EM分析。
图21显示了结果。在超微结构上，发抖小鼠的轴突是缺乏髓磷脂的，或者围绕一或两层不紧密的髓磷脂缠绕物(上图)。细胞移植后六周，电子显微镜分析显示有多层稠密的髓磷脂，这表明移植细胞群能够产生髓鞘(下图)。
因为这些小鼠缺乏产生髓磷脂碱性蛋白的能力，因此稠密的髓磷脂必然是植入的少突胶质细胞所直接产生的，并不能归咎于营养作用。
实施例5ES衍生少突胶质细胞使脊髓功能恢复在脊髓损伤的挫伤性大鼠模型中，测定ES衍生少突胶质细胞谱系细胞使神经活性恢复的能力。
采用冲击设备，在被麻醉的Sprague Dawley大鼠的低胸脊髓中诱导中度挫伤性损伤。损伤后一周，挫伤位置植入在4μl培养基中的2.5×105个细胞。移植细胞群的制备如下在分化方案第35天(实施例1)，将细胞暴露于胰蛋白酶和EDTA3分钟，从而使细胞不粘附。然后在基础培养基中漂洗细胞，并浓缩到每微升6×104个细胞。
损伤后六周，将顺向示踪物BDA(生物素化的右旋糖酐胺)注射到这些动物的运动皮质中。将翠绿(emerald green)注射到脊柱腰段，以标记腰神经束。当实验在8周结束时，检测这些标记物的位置。
图22显示了在这个实验中，两组中每个组的地上运动的评分。上图显示了受到200千达因挫伤的动物的结果。下图显示了250千达因挫伤的结果。BBB等级是基于关节运动、体重支撑、四肢协调、足部位置和步态稳定性的地上运动21-分的度量法(Basso，Beattie，和Bresnahan，J.Neurotrauma，121，1995)。(■)在损伤后1星期用ES衍生少突胶质细胞治疗的动物(n＝5)；(▲)接受相同的挫伤但不植入细胞的对照动物(n＝3)。平均值±SEM，用于盲法评估。
植入hES衍生少突胶质细胞的动物显示出明显地更好的功能(p＜0.05)，在治疗后持续5周以上。
这些结果表明，在脊髓损伤的动物模型中，ES衍生少突胶质细胞可帮助恢复功能。更早的实施例显示了植入的少突胶质细胞导致神经发芽以及髓磷脂缺陷型轴突的再髓鞘化。这两种效果或其中之一可能导致了本实验中所观察到的行为改善。
应理解，本发明的某些改动形式事实上是常规优化，并且在不脱离本发明精神和所附权利要求的范围的情况下实施。
权利要求
1.作为产生神经胶质细胞的系统的一部分的分化细胞群，其中该分化细胞群的至少～80％的细胞是少突胶质细胞前体，所述前体具有如下特征·它们是灵长类动物多能干(pPS)细胞的后代；·它们采用特异针对NG2蛋白聚糖的抗体染色；并且·它们是神经元标记物NeuN阴性；并且其中该系统还包含产生所述分化细胞的pPS细胞系。
2.用于产生神经胶质细胞的系统，它包含未分化的pPS细胞系和分化细胞群，其中该分化的细胞群中至少80％的细胞具有如下特征·它们是灵长类动物多能干(pPS)细胞的后代；·它们采用特异针对NG2蛋白多糖的抗体染色；并且·它们是神经元标记物NeuN阴性。
3.如前述任一项权利要求所述的分化细胞群，其特征在于，至少80％的所述细胞也表达A2B5。
4.如前述任一项权利要求所述的分化细胞群，其特征在于，至少80％的所述细胞还表达血小板衍生的生长因子受体α(PDGFRα)。
5.如前述任一项权利要求所述的分化细胞群，其特征在于，至少20％的所述细胞显示少突胶质细胞前体的两极形态特征。
6.如前述任一项权利要求所述的分化细胞群，其特征在于，在促分裂原缺乏时在聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白上培养3天，至少10％的细胞具有成熟少突胶质细胞的复杂突出特征。
7.如前述任一项权利要求所述的分化细胞群，其特征在于，将所述细胞群植入发抖突变小鼠脊髓内导致在神经元轴突周围沉积稠密的髓磷脂。
8.如前述任一项权利要求所述的分化细胞群，其特征在于，在挫伤性损伤大鼠脊髓里或周围的所述细胞群的植入导致地上运动的改善。
9.如前述任一项权利要求所述的分化细胞群，其特征在于，采用在含有促分裂原和至少两种少突胶质细胞分化因子的培养基中培养未分化pPS细胞的方法获得所述分化的细胞群。
10.如前述任一项权利要求所述的分化细胞群，其特征在于，采用将未分化的pPS细胞在碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、三碘甲腺原氨酸(T3)和维甲酸存在时悬浮培养以形成细胞团聚体的方法获得所述分化细胞群。
11.如前述任一项权利要求所述的分化细胞群，其特征在于，采用从非神经胶质细胞中分离神经胶质细胞的方法获得所述分化的细胞群。
12.如前述任一项权利要求所述的分化细胞群，其特征在于，采用在含有甲状腺激素和硒的培养基中培养细胞的方法获得所述分化的细胞群。
13.如前述任一项权利要求所述的分化细胞群，其特征在于，采用在促分裂原缺乏时培养而使细胞进一步分化的方法获得所述分化的细胞群。
14.如前述任一项权利要求所述的分化细胞群，其特征在于，所述pPS细胞是人胚胎干(hES)细胞。
15.一种从未分化灵长类动物多能干(pPS)细胞生产神经胶质细胞的方法，所述方法包括在含有促分裂原和至少两种少突胶质细胞分化因子的培养基中培养未分化的pPS细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法包括在存在生长因子、甲状腺激素受体的配体、以及维甲酸受体的配体的条件下将未分化pPS细胞培养在培养悬液中以形成细胞团聚体。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述生长因子是碱性成纤维细胞生长因子。
18.如权利要求15-17所述的方法，其特征在于，所述方法包括在含有甲状腺激素T3和硒的培养基中培养所述细胞。
19.如权利要求15-18任一项所述的方法，其特征在于，在培养悬液中，细胞团聚体形成黄色球形体。
20.如权利要求15-19所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从非神经胶质细胞中分离神经胶质细胞。
21.如权利要求15-20所述的方法，其特征在于，通过将所述细胞接种到固体表面上，并收获黏附于所述表面的细胞而进行所述分离。
22.如权利要求15-21所述的方法，其特征在于，在不存在促分裂原条件下培养，诱导神经胶质细胞进一步分化。
23.如权利要求15-22所述的方法，其特征在于，所获得细胞具有权利要求1-14任一项所述的分化细胞的特征。
24.一种基于化合物对神经胶质细胞的作用而筛选化合物的方法，它包括a)获得权利要求1-14任一项所述的分化细胞群；b)使细胞群与所述化合物混合；c)检测细胞群中细胞的任何变化或者由与所述化合物混合所导致的它们的活性的变化；以及d)使所述变化与该化合物对神经胶质细胞的影响相关联。
25.一种髓鞘化轴突的方法，该方法包括使权利要求1-14中任一项所述的分化细胞群与轴突从中延长的神经元细胞混合。
26.一种药物组合物，它含有权利要求1-14中任一项所述的分化细胞群。
27.权利要求1-14中任一项所述的分化细胞群在制备改善中枢神经系统功能的药剂的中的用途。
28.权利要求1-14中任一项所述的分化细胞群在制备治疗脊髓损伤的药剂中的用途。
29.权利要求1-14中任一项所述的分化细胞群改善中枢神经系统功能的用途。
30.权利要求1-14中任一项所述的分化细胞群治疗脊髓损伤的用途。
31.一种改善对象CNS功能的方法，其特征在于，该方法包括给予所述对象权利要求1-14中任一项所述的分化细胞群。
32.一种改善对象脊髓功能的方法，其特征在于，该方法包括给予所述脊髓权利要求1-14中任一项所述的分化细胞群。
33.权利要求1-14和26中任一项所述的组合物，基本上如上文结合任一实施例所述。
34.权利要求15-25和27-30中任一项所述的方法或用途，基本上如上文结合任一实施例所述。
全文摘要
本发明提供具有神经胶质细胞如少突胶质细胞和它们的前体的标记物的神经细胞群。通过在促进具有所需表型或功能性能力的细胞富集的条件下分化多能干细胞如人胚胎干细胞而产生所述细胞群。可使用分化因子和促分裂原的各种组合来生产携带有少突胶质细胞前体细胞标记物的细胞群。进一步分化后形成成熟少突胶质细胞的复杂突起特征。这些细胞能形成髓鞘，并可用于治疗性地改善中枢神经系统的功能。
文档编号C12Q1/02GK1852971SQ03816184
公开日2006年10月25日 申请日期2003年7月11日 优先权日2002年7月11日
发明者G·I·尼斯托尔, H·S·基尔斯特德 申请人:加利福尼亚大学董事会