专利名称：免疫原性组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫原性组合物，其包括融合蛋白和皂苷佐剂。也涉及疫苗、制备疫苗的方法、以及免疫原性组合物的用途。
在现代人类和兽医学中，人类和动物将会被定期接种疫苗以或多或少地预防令人虚弱的疾病或传染病，或者确保一定的经济收益性。在2000年仅用作兽医疫苗接种的生物制品的市场价值就为25亿美元(Wood-Mackenzie，2001)。任何疫苗接种策略的目的在于在受试者中实现免疫系统激活的状态，这将保护其免于感染或疾病(的症状)。为产生免疫保护，将感染性因子(的一部分)以能够使免疫系统产生保护性应答的方式呈递给受试者。通过免疫记忆现象，当将来发生此疫苗接种所瞄准的真正感染时，受试者的免疫系统被触发，以更加容易且强烈地作出反应。
为此目的，疫苗通常是由靶向的感染性因子或其部分制备的，例如通过使用活性、活性减毒或杀死形式的传染微生物，或者其蛋白质亚单位或核酸。理想地，所有这些都将包括(或编码)可在人类或动物靶标中诱发期望的保护性免疫应答的抗原性结构。
出于安全性的原因，优选亚单位疫苗。亚单位则可介由(重组)核酸分子的表达通过表达系统的细胞产生。
只有当抗原能够诱发降低感染或疾病迹象的免疫应答时，它才被称之为保护性抗原或免疫原。
因此在亚单位疫苗领域，表达的蛋白可能是抗原性的，但多数时候发现不是免疫原性的。更别提具有足够的免疫原性，以产生在实地条件下有效而且经济上可行的疫苗了。
然而，亚单位免疫原性的优化可能负面地干扰获得足够的表达产率。这可能是由于过表达可能会导致用于蛋白表达的细胞机器超负荷并崩溃、或者用于表达异源蛋白的表达系统多数时候并不表现出与蛋白天然地表达的细胞中所发生的相同的翻译后修饰的事实而引起的。例如，提供分泌或表面暴露的疏水信号序列的加工通过与细胞的细胞器或外膜相互作用，可能会在表达系统的细胞中产生问题。因此常见的作法是在细胞表达系统中生产没有C-端疏水锚定信号的蛋白亚单位，并缺失或修饰N-端信号序列。然而该途径的不利之处在于这通常导致低免疫原性。
为克服以这种方式产生的蛋白的低免疫原性的问题，通常采用的是向亚单位抗原添加佐剂(免疫刺激物质)。此类物质相对便宜，且能够非常有效。通常利用的佐剂有铝盐、油乳剂、脂质A和皂苷。然而这些物质大多数在施用部位以组织刺激的形式导致某种局部反应。这造成受试者的不适，并且在兽医应用的情况下，可能导致生产力(如奶或蛋产量、饲料转化)下降或屠宰场肉或畜体的禁止食用。
这些佐剂之中，发现有效浓度下具细胞毒性的一个是奎拉雅属(Quillaja)皂苷。当然，施用皂苷的局部反应类型和强度取决于使用的量，并且也取决于该材料的纯度或者所使用的特定批次。B.Rnnberg等(1995，Vaccine，vol.13，p.1375-1382)描述了奎拉雅属皂苷衍生物不同级分的溶血细胞毒性。对不同级分而言，毒性浓度在5和100μg/ml之间变化。局部反应据观察从肿胀到皮肤退化变化不一，并且甚至有实验所用小鼠的死亡。在类似的研究中，Pillion等(1996，J.Pharm.Sci.，vol.85，p.518-524)描述了奎拉雅属皂苷衍生物在0.006和1.5mM之间的浓度造成红细胞溶血。Leung等(1997，BBA vol.1325，p.318-328)描述细胞溶解的原因在于游离皂苷与细胞膜中的胆固醇反应。
防止皂苷的毒性压倒其佐剂活性的常见方式是掺入到免疫刺激复合物(ISCOM)(WO 9611711)中。这些复合物是通过混合皂苷、磷脂和胆固醇形成的。在正确条件下形成具笼状结构的颗粒。当整合了抗原性蛋白时，可产生微粒结构，该结构将这些抗原呈递到表面，由此模拟抗原在感染细胞上的“天然”呈递(综述于Morein，B.和K.L.Bengtson，1999，Methods，vol.19，p.94-102和EP109.942之中)。
或者可以生产ISCOM-基质颗粒。这些是ISCOM-样颗粒，其中亚单位抗原并不整合，而是后来添加的。
在这两种情况下，奎拉雅属皂苷的细胞毒性效应都得以中和。通过在ISCOM中整合携带表位的融合肽，Hsu等(1996，Vaccine，vol.14，p.1159-1166)选择了这样的途径。
不幸的是，ISCOM及ISCOM-基质的产生复杂且昂贵，因此使得其对于例如兽医学上的一般应用来说不经济。使用游离形式的皂苷(即不整合到ISCOM中)不太复杂，且便宜。然而，在作为佐剂正常有效的浓度下，可能出现皂苷细胞毒性的不利之处，如上文所提到的那样。
本发明的目的在于首次提供佐以皂苷的蛋白质抗原的免疫原性组合物，其按成本有效生产水平计，确实提供有效的免疫刺激，而没有显著的不利局部效应。
现在令人惊讶地发现，通过将疏水肽与免疫原性蛋白质的核心融合，该融合蛋白能够与如此低浓度的游离皂苷组合，从而所得组合物不会导致不利的局部效应，而仍然诱导有效的免疫应答。
这与在ISCOM和ISCOM-基质颗粒中掺入皂苷以克服细胞毒性的普通习惯相反。同样这也与由在异源表达系统中表达的亚单位蛋白习惯性去除疏水氨基酸(aa)区段相抵触。表达系统中融合蛋白产量可能的损失通过就游离皂苷而言提高的免疫原性以及下降的不利局部反应而得到了弥补。
因此，本发明首次提供了佐以皂苷的亚单位疫苗，其足够安全、在免疫学上有效且具有经济可行性。
因此，在第一方面，本发明提供了免疫原性组合物，包括融合蛋白和皂苷佐剂，其特征在于所述融合蛋白包括融合于核心多肽N-端和/或C-端的异源疏水肽，所述核心多肽包括至少一个保护性表位，所述皂苷佐剂以游离形式存在。
免疫原性组合物应理解为经给受试者给药后，诱导该受试者的免疫应答，使感染或疾病下降的组合物。这意味着刺激免疫系统成分。这些可以是细胞成分例如B或T淋巴细胞、巨噬细胞、杀伤细胞、抗原提呈细胞(APC)等，或者免疫系统的体液成分，例如抗体、细胞因子(如干扰素或白介素)等。
为了本发明的目的，术语“蛋白”是指氨基酸分子链。蛋白并不限于特定长度，且如需要，可在体内或在体外通过例如糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化修饰。其中，肽、寡肽和多肽包含在该定义之内。蛋白或肽可以是天然或合成来源的。
融合蛋白是两条或更多条氨基酸链的天然不存在的集合。所述氨基酸链可以等长，但通常它们长度不同，其中异源疏水肽优选短于核心多肽。氨基酸链的结合可通过多种手段实现，如-化学上，通过脱水、酯化等直接或间接通过中间体结构对氨基酸序列进行偶联、缀合或交联。
-物理上，通过在高分子结构之中或之上的俘获进行偶联。
-通过联合包含了编码两蛋白中每一个的核酸片断的重组核酸分子进行分子生物学融合，从而单个连续的表达产物得以最终产生。
皂苷为表面活性的糖苷，可通过提取自植物中获得。众所周知的皂苷是，其由南美皂树奎拉雅属皂树(Quillaja saponaria[Molina])的树皮提取而得的Quillaja皂苷(Dalsgaard，K.，1974，Arch.Gesamte Virusforsch.vol.44，p.243-254)。取决于提取方法，将获得不同的皂苷制剂。多种奎拉雅属皂苷是商业上可获得的Iscotec AB，Sweden的SpikosideTM、Superfos AS，Denmark的QuilATM、Nor-Vet，Denmark的Q-vacTM以及Antigenics，USA的QS-21TM和Desert King，Chili的Vax-SapTM。有些是粗制品，而其它的是更为纯化的制剂。
为了本发明的目的，如果皂苷还没有被有目的地与胆固醇和磷脂混合以产生ISCOM或ISCOM-基质颗粒，它是游离形式的。
一般而言佐剂是以非特异性方式加强接受受试者的免疫应答的物质。
待与疏水肽相连的核心多肽系不含存在于该蛋白天然形式之中的N-端或C-端疏水区的多肽。因而本发明的核心蛋白是来自因子或生物体的蛋白组分。不含疏水末端的蛋白无需对其天然组成进行进一步修饰，以天然形式就可作为“核心”。
这些疏水区可利用化学或酶学操作自蛋白切除。优选地，编码此种蛋白的核酸序列通过遗传工程技术以这种方式修饰，从而使这些疏水区不再表达。
原则上任何具有医学重要性的蛋白都可作为本发明的核心多肽。优选核心多肽为已知或预期可对人类或动物造成疾病的感染性因子或生物学因子的组分。例如导致癌症、HIV或AIDS、(自身)免疫病、神经学、神经退行性变、呼吸道或皮肤疾病的感染性因子或因子。
更优选核心多肽为在疫苗接种研究中(例如在由感染性因子分离之后，通过用作活重组运载微生物(LRCM)中的插入物，在表达系统中表达后，或者在用作为DNA疫苗之后)已表现出免疫原性潜能的蛋白组分。
能够用作本发明的核心多肽的此类蛋白的实例有来自包膜、基质蛋白、细胞器或细胞核的蛋白，或者来自寄生虫、细菌或病毒的非结构性蛋白或糖蛋白，以及它们在宿主中诱导或与之相互作用的蛋白。
甚至更为优选地，核心多肽是下列蛋白的组分·寄生虫蛋白例如来自艾美球虫属的寄生虫酶(可溶的或内部的)、或者可溶保护性抗原例如来自巴贝虫属(Babesia)的外抗原或裂殖子(merozoite)表面抗原。
·病毒蛋白如来自逆转录病毒的蛋白包膜蛋白gp20、gp40、gp120、rev、tat或nef蛋白、逆转录病毒组特异性抗原；新城疫病毒融合或血凝素-神经氨酸酶蛋白；流感病毒血凝素或神经氨酸酶蛋白；双RNA病毒VP2；冠状病毒刺突或基质蛋白；瘟病毒包膜蛋白Ems、E1或E2；猪生殖和呼吸道疾病病毒的病毒蛋白。
·细菌蛋白例如毒素、粘附素、纤维蛋白、纤毛蛋白、基柱蛋白或外膜蛋白。
·诱导的蛋白例如白介素；干扰素；癌抗原例如来自p53级联、HER-2/Neu、癌胚抗原；肿瘤诱导的血管发生因子象纤连蛋白或神经节苷脂；受体分子。
用于本发明之目的的术语异源是指疏水肽相对于其待连接的核心多肽而言的来源。因而如果肽不是特定物种的生物体或因子中核心多肽作为其组分的同一蛋白的一部分，它是异源来源的。例如，如果来自牛巴贝虫(Babesia bovis)的Bd37蛋白的C-端疏水肽待与来自分歧巴贝虫(B.divergens)的Bd37蛋白同系物的核心多肽融合，则其符合作为异源肽的要求。
一般而言，疏水肽应理解为对非极性环境具有偏好的氨基酸链。此类肽在本领域也被称作亲脂性或水不溶性的。以建立了多种能够评估肽的疏水性的计算机算法。为了本发明的目的，采用的是Kyte &Doolittle的亲水性算法(J.Kyte和R.F.Doolittle，1982，J.Mol.Biol.，vol.157，p.105-132)。这种广泛采用的程序计算某一窗口氨基酸自由转移能的移动平均值(moving average)，由此产生可表现为数据点表格或表现为图表的疏水性分布图。表格中移动平均值数字为正指示疏水氨基酸；图表描述的疏水性分布图中，低于中线的部分是疏水性的。
该算法在多数用于蛋白分析或结构预测的软件包中、以及通过互联网借助于多数生物信息学研究所的网页可获得。
对于本发明，如果60％或更多个来自Kyte-Doolittle疏水性分析的数据点显示疏水值，则肽被认为是疏水性的；所述疏水性必需利用5个氨基酸的窗口计算。疏水性百分比由来自这种分析的数据表计算疏水数据点(移动平均值数字为正)的数目除以肽的氨基酸总数。优选70％来自Kyte-Doolittle疏水性分析的数据点是疏水性的，更优选80％、85％、90％、95％、98％或100％，优选等级渐增。
为举例说明Kyte-Doolittle疏水性分布图，表1描述了可用于产生本发明的融合蛋白的来自多种来源的疏水肽，而与之相伴的疏水性分布图示于
图1。该图也列出了疏水性百分比。
用于本发明的疏水肽优选包含3到200个氨基酸之间的序列，更优选4到150个，甚至更优选4到100个，还甚至更优选5到75个，并且更优选6到50个氨基酸。
可用于产生本发明的融合蛋白的疏水肽可来自其来源的供体蛋白的不同区域。例如·N-端N-端疏水肽例如信号序列可来自各种各样的蛋白质如蜂毒肽(蜂蜜毒)、人组织纤溶酶原激活剂(TPA)、酵母交配信息素α-因子、杆状病毒包膜糖蛋白gp67或假狂犬病病毒gX。这些信号序列由Izard和Kendall(1994，Mol.Microbiol.，vol.13，p.765-773)、Claros等(1997，Curr.Opin.Struct.Biol.，vol.7，p.394-398)以及Lammertyn和Anne(1998，FEMS Microbiol.Lett.，vol.1，p.1-10)综述。
·内部内部疏水肽序列有例如跨膜区(TMR)，这些肽可位于蛋白的N-端或C-端附近，而且也还在内部，例如在具有跨膜片断的蛋白的情况下。实例有来自麻疹病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的膜锚点；跨膜信号受体象“七跨膜结构域”受体；膜通道；细胞孔隙及泵等。此类信号由Goder和Spiess(2001，FEBS Lett.，vol.31，p.87-93)、von Heijne和Manoil(1990，Protein Eng.，vol.4，p.109-112)以及普通教科书象Alberts等的《细胞分子生物学》(2002，Garland Sciencepubl.，ISBN0815340729)综述。
·C-端C-端疏水肽有例如糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号，例如来自人类CD14(单核细胞分化抗原(NCBI蛋白数据库登录号P08571)，鸡TGF-β神经营养因子受体1(NCBI登录号013156)，以及酿酒酵母胞壁蛋白1(见表1和图1)的C-端。此类GPI锚点的特征由P.Englund(1993，Ann.Rev.Biochem.，vol.62，p.121-138)以及Chatterjee和Mayor(2001，Cell.Mol.Life Sci.，vol.58，p.1969-1987)综述。
NBNCBI蛋白和核酸序列数据库可通过互联网http//www.ncbi.nlm.nih.gov进入，而且其用于获得核酸或蛋白序列目的的用途是本领域众所周知的。
表1可用于本发明的疏水肽的实例
DAF＝衰变加速因子(CD 55)；CWP 1＝酵母菌胞壁蛋白1；MV HN＝麻疹病毒血凝素-神经氨酸酶；HHV-4 EBNA-3C＝人类疱疹病毒4，核抗原EBNA-3C。
用来计算示于图1的疏水性分布图的计算机包(Clone Manager，SeiEd software，Durham，USA)将超过零的数值归结于疏水氨基酸段，而亲水段得分为负值。移动平均值以5个氨基酸的窗口计算。
不用说当使用不同的计算机包计算此分布图时，可能稍有差异。不过，疏水和亲水氨基酸区之间的区别将依然清晰。
文献中，通常表达融合蛋白以便于下游加工期间的纯化。然而，用于彼目的的融合肽不符合作为本发明的疏水肽的要求。
表位应理解为T细胞受体会对其作出应答、或者B细胞将对其产生抗体的抗原性分子的一部分。因此用于本发明的保护性表位将诱导特异性T细胞、或激活B细胞产生特异性抗体，从而这些细胞或抗体引起免疫反应，干涉侵染或疾病的病程。因而，通过此类保护性表位，可产生保护性免疫应答。
保护性表位包含在用于本发明的融合蛋白的核心多肽部分中。
与核心多肽相连的异源疏水肽也可以包含表位。融合蛋白中不止一个表位的存在甚至可以增强本发明的融合蛋白的免疫功效。
当前，存在多种技术可用来容易地识别蛋白表位。一种尤其适于检测B细胞表位的经验性方法是所谓的PEPSCAN法。这由Geysen等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.81，p.3998-4002(1984)、J.Imm.Meth.vol.102，p.259-274(1987)和专利申请WO84/03564及WO 86/06487以及美国专利号no.4,833,092中描述。所述PEPSCAN法是容易实施、快速且为大家所公认的用于表位检测的方法。它包括合成与待研究的蛋白渐进地重叠的系列肽片断，并随后用该蛋白的特异性抗体测试这些多肽。
同样，给定任何蛋白(其编码基因)的氨基酸(或核酸)序列，都存在能够基于其与目前已知表位的序列和/或结构一致性，标明作为免疫学上重要的表位的特定蛋白区的计算机算法。这些区域的确定是建立在根据Hopp和Woods(Hopp T.P and Woods，K.R.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，vol.78，p.3824-3828)的亲水性标准与根据Chou和Fasman(Adv.In Enzymology，vol.47，p.45-148(1987)以及美国专利4,554,101)的二级结构方面的组合的基础上的。采用此类算法组合的程序实例是PepPlot(Gribskov等，1986，Nucl.Acids Res.vol.14，p.327-334)。
由于T细胞表位正常地隐藏在蛋白的疏水区，其折叠远离极性亲水的外部(这里通常是B细胞表位的位置)，待与核心多肽融合的异源肽的疏水特点尤其适用于掺入T细胞表位。
如由Berzofsky等(1987，Immunol，Rev.，vol.98，p.9-52)所综述的那样，T细胞表位由短的氨基酸线性区段组成，并且只能在MHC-I的环境下，在其被APC加工后呈递给免疫系统。
许多实例中的一个是来自人疱疹病毒4的EBNA-3C核抗原(NCBI登录号S27922)，也描述在表1和图1中。
T细胞表位可象B细胞表位一样，通过计算机借助于Berzofsky的两亲性标准(1987，Science，vol.235，p.1059-1062)自序列中预测。这由Lu等(1992，Vaccine vol.10，p.3-7)综述。采用这些方法的功效的举例说明由H.Margalit等(1987，J.of Immunol.，vol.138，p.2213-2229)公开，其描述运用此类方法预测T细胞表位的成功率为75％。
所述异源疏水肽和/或核心多肽也可以含有其它免疫激活特征。此类特征可包括象来自趋化因子或免疫毒素的免疫刺激信号。
产生本发明的融合蛋白的优选方式是使用遗传工程技术和重组表达系统。这些可包括使用(重组)核酸序列、LRCM及宿主细胞。
可用于编码本发明的融合蛋白的核酸序列可通过熟练技术人员众所周知的标准分子生物学技术获取、操作和表达，并且在标准教科书如Sambrook和RussllMolecular doninga laboratorymanual(2000，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；ISBN0879695773)中极为详细地进行了说明。
为构建编码本发明的融合蛋白的核酸，优选采用DNA质粒。此类质粒可用于例如增大DNA-插入物的含量、用作为探针、以及作为进一步操作的工具。用于克隆的此类质粒的实例有pBR、pUC及pGEM系列，所有这些都可从多家商业供货商获得。
编码多肽核心和疏水肽的DNA可以例如克隆到不同的质粒上，经修饰以获得期望的构象，然后组合到一个重组质粒中；所述肽及核心的读框以此方式排列，从而使可表达单个连续的融合蛋白。
能够编码本发明的疏水肽和/或核心多肽的核酸序列的修饰可通过例如限制性酶消化、通过定点突变、或通过聚合酶链式反应(PCR)技术实施。例如，用于实施PCR的标准技术和方案详尽地描述在C.Dieffenbach和G.Dveksler；PCR primersa laboratory manual(1995，CSHL Press，ISBN879694473)中。
为了蛋白纯化、检测、或提高表达水平的目的，可添入附加序列。这可导致重组核酸分子或质粒中的最终插入物大于编码疏水肽和核心多肽融合物的序列。当此类附加元件以正确的读码插入时，这些元件变成本发明融合蛋白的完整的一部分。
由重组核酸分子表达核酸序列的必要条件是核酸可操作地连接于转录调控序列，从而使它能够控制核酸序列的转录。转录调控序列是本领域众所周知的，并且包含启动子和增强子。对本领域技术人员显而易见的是启动子的选择延及能够指导基因转录的任何真核、原核或病毒启动子，只要该启动子在所用的表达系统中具有功能。
细菌、酵母、真菌、昆虫和脊椎动物细胞表达系统被极为频繁地利用。此类表达系统是本领域众所周知的，并且一般可在商业上例如由Invitrogen(the Netherlands)获得。
可用于表达本发明的融合蛋白的宿主细胞可以是细菌来源的细胞，如来自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)或新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)，并联合应用细菌来源的质粒或噬菌体，用以表达编码融合蛋白的序列。宿主细胞也可以是真核来源的，如酵母细胞联合酵母特异性载体分子，或者高等真核细胞，象昆虫细胞(Luckow等Bio-technology 647-55(1988))联合载体或重组杆状病毒；植物细胞联合如基于Ti-质粒的载体或植物病毒载体(Barton，K.A.等Cell vol.32，p.1033(1983))；或者哺乳动物细胞如Hela细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或Crandell-Rees猫肾细胞，连同合适的载体或重组病毒。
表达的本发明的融合蛋白的实例是禽流感病毒H5 HA蛋白核心(如可来源于NCBI登录号CAC28131)，融合于异源疏水序列，并在杆状病毒表达载体系统中表达，见实施例4。
除了这些表达系统，植物细胞或基于寄生虫的表达系统是有吸引力的表达系统。寄生虫表达系统描述在例如法国专利申请
发明者S·德尔贝克, E·普雷西古, A·F·格伦夫洛特, T·P·M·谢勒斯 申请人:阿克佐诺贝尔公司