强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物的制作方法

专利名称：强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物，及其制备和使用方法。
背景技术：
壳聚糖为N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖的无毒阳离子共聚物。壳聚糖可与核酸形成复合物并且已用作转染细胞的DNA运输载体。壳聚糖的许多生物应用已经涉及高分子壳聚糖聚合物的使用。大约数十万至数百万道尔顿的高分子壳聚糖聚合物仅可溶于酸性溶液。稀醋酸常用作这种高分子壳聚糖的溶剂。最初认为大约数万道尔顿或更低的低分子量壳聚糖太小而不能有效包裹和保护 DNA，并且不能用作DNA运输载体。然而，若干小组最近已确认低分子量壳聚糖可用于有效包裹和保护DNA，并且可用作DNA运输载体。因为低分子量壳聚糖在生理pH下表现出较高可溶性，所以已被认为可用作理想的DNA运输载体，并且据了解低pH环境促进核酸的降解。虽然对于许多用途而言高浓度核酸是理想的，但难以生产同质壳聚糖-核酸复合物的浓缩稳定分散体。提高混合液中壳聚糖和核酸的浓度导致聚集、不稳定、粒度变化和沉淀。已描述使用并流混合以生产包含DNA和凝聚剂的颗粒(U. S. 6，537，813)。为了生产这种颗粒，可同时和单独将DNA溶液和凝聚剂溶液引入顺流混合器中，该顺流混合器包括用于混合和颗粒形成的静态或动态混合器。该技术使人们认识到在引入和混合过程中维持DNA和凝聚剂的适当摩尔比很重要，并且电中性的显著偏离可导致该过程中不完全凝聚或颗粒聚集。发明概述本发明的发明人已发现pH低于通常用于使壳聚糖溶解的pH很多的强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物表现出比更接近生理PH的复合物组合物更高的粘膜上皮体内转染效率。本发明组合物的pH低于4. 5，但仍表现出对稳定性和核酸完整性的保持，和粘膜上皮运输的适合性。矛盾的是，已经在比高分子量壳聚糖更低的酸性PH下部分研究其可溶性的低分子量壳聚糖尤其适合用于本发明。本发明的发明人还克服了复合物聚集和沉淀问题，以生产稳定的浓缩强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物。另外，发明人已经能够生产等渗的浓缩制剂，这些制剂对于制药和治疗应用十分理想。因此，一方面，本发明提供包含壳聚糖-核酸复合物的强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物。
在一个优选的实施方案中，本发明组合物的pH低于4. 5，更优选低于4. 2，更优选低于4.0，更优选低于3. 8。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物包含治疗性核酸。在一个实施方案中，所述治疗性核酸为治疗性RNA。在另一个实施方案中，所述治疗性核酸为编码治疗性蛋白的治疗性核酸构建体。在一个优选的实施方案中，本发明组合物是等渗的。在一个优选的实施方案中，本发明组合物是稳定的。在一个优选的实施方案中，本发明组合物是同质的。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的平均多分散性指数(“PDI”)低于0. 5，更优选低于0. 4，更优选低于0. 3，并且最优选低于0.2。在一个优选的实施方案中，本发明组合物不含沉淀的复合物。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的核酸浓度高于0. 5mg/ml,并且不含沉淀的复合物。更优选地，本发明组合物的核酸浓度为至少0.6mg/ml，更优选地为至少0. 75mg/ml，更优选地为至少1. Omg/ml,更优选地为至少1. 2mg/ml,并且最优选为至少 1. 5mg/ml，并且不含沉淀的复合物。在一个优选的实施方案中，本发明组合物另外包含聚集抑制剂。在一个优选的实施方案中，所述聚集抑制剂为糖，优选为蔗糖。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物包含具有平均少于3000个、更优选少于2000个、更优选少于1500个、更优选少于1000个、更优选少于500个、更优选少于300个、更优选少于150个、更优选少于100个、更优选少于50个，并且最优选少于30个
氨基葡萄糖单体单元的壳聚糖分子。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物的N P比为至少2 1、更优选为至少5 1、更优选为至少10 1、更优选为至少15 1，并且最优选为至少20 1。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物包含具有以下平均分子量的壳聚糖低于500kDa、更优选低于300kDa、更优选低于250kDa、更优选低于150kDa、更优选低于lOOkDa、更优选低于50kDa、更优选低于25kDa、更优选低于16kDa、更优选低于8kDa，并且最优选低于5kDa。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物的平均直径小于750nm，更优选小于500nm，更优选小于250nm，更优选小于200nm，并且最优选小于150nm。在一个优选的实施方案中，本发明组合物主要由壳聚糖-核酸复合物和聚集抑制剂组成。在另一个优选的实施方案中，本发明组合物主要由壳聚糖-核酸复合物组成。—方面，本发明提供包含本发明的强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物的药物组合物。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物是等渗的。在其它实施方案中，所述药物组合物可为高渗或低渗的。一方面，本发明提供一种转染粘膜上皮细胞的方法，所述方法包括使粘膜上皮细胞与本发明的强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物接触。在一个优选的实施方案中，所述粘膜上皮存在于选自以下各项的组织中胃肠道组织、呼吸道组织、肺组织、窦洞组织、口腔组织、尿道组织、膀胱组织、阴道组织、子宫组织、 子宫颈组织、眼组织、食道组织、唾液腺组织、鼻咽组织、肾组织和喉/咽组织。一方面，本发明提供一种治疗涉及粘膜上皮炎症的疾病的方法，所述方法包括对患有涉及粘膜上皮炎症的疾病的患者施用治疗有效量的本发明药物组合物。优选将所述受试药物组合物局部施用至所述粘膜上皮。在一个优选的实施方案中，所述受试药物组合物包含编码抗炎蛋白的治疗性核酸构建体。在一个实施方案中，所述抗炎蛋白为TNFa抑制剂。在另一个实施方案中，所述抗炎蛋白为IL-I抑制剂。在另一个实施方案中，所述抗炎蛋白为IL-10。在一个优选的实施方案中，涉及粘膜上皮炎症的所述疾病为炎症性肠病(IBD)。在另一个优选的实施方案中，涉及粘膜上皮炎症的所述疾病为间质性膀胱炎。在另一个优选的实施方案中，涉及粘膜上皮炎症的所述疾病为慢性阻塞性肺病(COPD)。在另一个优选的实施方案中，涉及粘膜上皮炎症的所述疾病为哮喘。附图简述

图1 响应施用含gWIZ-SEAP质粒DNA的cl50壳聚糖-核酸颗粒所检测的猪血浆 SEAP。pH 为 4 时的药品配方为 C(24，98)-N20-cl50-Ac25-Suc9-pH4. 0。pH 为 4. 8 时的药品配方为 C^24，98)-N20-cl50-Ac25-Suc9-pH4. 8。图2 :1L在线批量混合和TFF浓缩>透滤>浓缩的示例性过程框3 小规模在线混合示意图。注射器不含聚丙烯(PP)橡胶，并且每个注射器的容量可调整至高达60mL。两个精密注射泵驱动所述注射器。管材为1/16"钼金硫化硅胶 (Pt-cured silicone).所示混合连接处为Y。构建体的混合连接材料为PP。图4 =IOL中等规模的在线混合示意图。所示示意图适于IOL批量。对更小或更大批量规模，所有容器均做相应调整。钼金硫化管材的直径为0.48cm(3/16")。显示了 DNA 壳聚糖体积混合比为2 1的泵流量。图5 =TFF浓缩&透滤示意图。显示了 TFF透滤示意图。TFF浓缩期间，从渗余物容器断开透析缓冲液管线并用排气口过滤器代替。图6 对TFF浓缩期的pH变化建模。各个点表示所述复合物相对体积减少倍数 (=升高的DNA浓度)。例如，标有2X的点为约C1200。图7 第二 TFF浓缩步骤后复合物的稳定性。在25°C下温育TFF后未稀释样品并每池监测一次粒度。图8 过程中的pH数据。X轴上的TFF分数符号如下C1 :TFF浓缩步骤#1 ；D =TFF 透滤，用洗液体积(WV) #表示；C2 =TFF浓缩步骤#2。图9 小鼠膀胱的体内转染。向自然C57BL/6小鼠输送载有EFla-SEAP或对照载体的壳聚糖-DNA复合物，98)-cl000-pH4。2天后，处死小鼠并获取组织。示出了经治疗小鼠膀胱组织中SEAPmRNA超过自然小鼠(未转染)的相对增量。图10 =EG-IO (hlL-10)强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物对慢性IBD小鼠体重的影响。每隔7天施用各剂量的强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物。整个实验期间每周监测一次这些小鼠的体重，并且观察到每周治疗之后与EG-10治疗组相关的增重明显增加。图11 =EG-IO (hlL-10)强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物对3种前炎性细胞因
5子的影响。在末次治疗5天后，处死两组的小鼠并且除去其结肠并测定前炎性细胞因子水平。与SEAP治疗的小鼠相比，EG-10治疗的小鼠导致IL-6、IL-1 β和TNF- α mRNA的水平降低。图12 :360天后在_80°C下对两批来自中等规模生产的最终复合产物(DP-0089和 DP-0090)进行的琼脂凝胶电泳。示出了复合物和DNA(超螺旋和带缺口)的位置。药品配方为 C^24，98)-N10-cl000-Ac70-Suc9-pH4. 0。发明详述所谓“壳聚糖-核酸复合物”、“壳聚糖-核酸复合物颗粒”、“壳聚糖-核酸复合物”、“复合物”或同义语是指包含若干壳聚糖分子和若干核酸分子的复合物。壳聚糖单体包括衍生物，所述衍生物包括附有配体的壳聚糖。“衍生物”应理解为包括广泛的包含共价修饰的N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖单元的壳聚糖基聚合物，以及结合其它单元或连接其它部分的壳聚糖基聚合物。衍生物往往基于对氨基葡萄糖的羟基或氨基的修饰。壳聚糖衍生物的实例包括但不限于三甲基化壳聚糖、聚乙二醇化壳聚糖、巯基化壳聚糖、半乳糖苷化壳聚糖、烷基化壳聚糖、结合PEI的壳聚糖、精氨酸修饰的壳聚糖、糖醛酸修饰的壳聚糖等。有关壳聚糖衍生物的进一步教导，参见例如，“Non-viral Gene Therapy(非病毒基因疗法)”第 63-74 页，K. Taira, K. Kataoka, T. Niidome (编辑)，Springer-Verlag Tokyo，2005，ISBN4-431-25122-7 ；Zhu 等，Chinese Science Bulletin, 2007 年 12 月，第 52 卷(23), H 3207-3215 页；WO 2008/082282 ；禾口 Varma 等，Carbohydrate Polymers (糖类聚合物)55 (2004) 77-93，其各自的全部内容以引用的方式明确并入本文。分散体系由被称为分散相、分布遍及连续介质的颗粒物质组成。壳聚糖-核酸复合物的“分散体”为包含含水壳聚糖-核酸复合物的组合物，其中所述复合物分布遍及所述介质。本文所使用的壳聚糖聚合物“平均重量”指平均分子量。所谓“平衡阴离子”是指能够与带有电荷的壳聚糖胺或在此处的其它阳离子产生静电相互作用的阴离子。优选的平衡阴离子包括醋酸根离子和氯离子。本文所使用的“预浓缩”分散体是未经浓缩过程而形成如本文所述的浓缩分散体。本文所使用的“不含”复合物沉淀指所述组合物基本上不含可目视观察到的颗粒。壳聚糖可按照2007年3月30日提交的U. S. S. N. 11/694，852所公开的方法制备， 该申请的全文以引用的方式明确并入本文。强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物一方面，本发明提供强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物，所述组合物包含壳聚糖-核酸复合物。所述壳聚糖-核酸复合物的核酸组分被封装在壳聚糖-核酸复合物内。 在一个优选的实施方案中，本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物是同质的并且在所述组合物中是稳定的。包含多种“同质”壳聚糖-核酸复合物的组合物指复合物大小分布范围狭窄的组合物。例如，可通过所述组合物的“多分散性指数”(PDI)测定分布范围狭窄的复合物大小。 本发明组合物的优选PDI低于0. 5、更优选低于0. 4、更优选低于0. 3，并且最优选低于0. 2。包含多种“稳定”壳聚糖-核酸复合物的组合物指其中复合物保持大小稳定，即， 不倾向于随时间增加尺寸或聚集。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含在室温下至少6h、更优选至少12h、更优选至少Mh，并且最优选至少48h，平均直径增加少于 100%,更优选少于50%，并且最优选少于25%的复合物。本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物优选在冷却状态下稳定。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含在2-8°C下至少他、更优选至少12h、更优选至少Mh，并且最优选至少48h，平均直径增加少于100%、更优选少于50%，并且最优选少于25%的复合物。本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物优选在冻融状态下稳定。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含在-20°C至-80°C下冻融之后，在室温下至少他、更优选至少 12h、更优选至少Mh，并且最优选至少48h，平均直径增加少于100%、更优选少于50%，并且最优选少于25%的复合物。例如，可用凝胶电泳中核酸的延迟表示本发明壳聚糖-核酸复合物中核酸的封装作用。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的pH低于4. 5、更优选低于4. 2、更优选低于4.0、更优选低于3. 8。在一个实施方案中，本发明组合物的pH在3. 5-4. 5范围内。在一个实施方案中， 本发明组合物的PH在3. 6-4. 2范围内。在一个实施方案中，本发明组合物的pH在3. 8-4. 2 范围内。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物包含具有平均少于3000个、更优选少于2000个、更优选少于1500个、更优选少于1000个、更优选少于500个、更优选少于300个、更优选少于150个、更优选少于100个、更优选少于50个，并且最优选少于30个
氨基葡萄糖单体单元的壳聚糖分子。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物包含具有以下平均分子量的壳聚糖低于500kDa、更优选低于300kDa、更优选低于250kDa、更优选低于150kDa、更优选低于lOOkDa、更优选低于50kDa、更优选低于25kDa、更优选低于16kDa、更优选低于8kDa，并且最优选低于5kDa。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的壳聚糖组分具有在3kDa和250kDa之间的平均分子量。在一个实施方案中，本发明组合物的壳聚糖组分具有高于或等于250kDa的平均分子量。在一个实施方案中，本发明组合物的壳聚糖组分具有低于或等于3kDa的平均分子量。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物的平均直径小于750nm、更优选小于500nm、更优选小于250nm、更优选小于200nm，并且最优选小于150nm。在一个实施方案中，本发明组合物的复合物的平均直径大于lOOnm。在一个实施方案中，本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物的N P比在2 1和 100 1之间，更优选在5 1和90 1之间，更优选在10 1和90 1之间，并且最优选在20 1和90 1之间。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物的平均ζ电势在 +20mV 和 +60mV 之间。在一个实施方案中，本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物的平均ζ电势低于或等于 +20mV。在一个实施方案中，本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物的平均ζ电势高于或等于 +60mV。在一个优选的实施方案中，所述复合物的壳聚糖分子的脱乙酰程度高于70%、更优选高于75 %、更优选高于80 %、更优选高于85 %、更优选高于90 %、更优选高于95 %，并且最优选为至少98%。在一个实施方案中，所述复合物的壳聚糖分子的脱乙酰程度低于或等于70%。在一个优选的实施方案中，本发明组合物主要由壳聚糖-核酸复合物和聚集抑制剂组成。除本发明的复合物和聚集抑制剂外，这种组合物可包括平衡阴离子和其它赋形剂， 但不包括显著影响本发明组合物活性的其它物质。在一个优选的实施方案中，本发明组合物主要由壳聚糖-核酸复合物组成。除本发明复合物外，这种组合物可包括平衡阴离子和其它赋形剂，但不包括显著影响本发明组合物活性的其它物质。在一个优选的实施方案中，本发明组合物不包括对羟基苯甲酸酯。这在组合物的核酸浓度高于0. 5mg/ml时尤其需要。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的平衡阴离子浓度在10_200mM之间，特别优选为60-100mM。在一个优选的实施方案中，所述平衡阴离子为醋酸根离子。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的核酸浓度高于0.5mg/ml，并且不含沉淀的复合物。更优选地，所述组合物的核酸浓度为至少0. 6mg/ml、更优选为至少0. 75mg/ ml、更优选为至少1. Omg/ml、更优选为至少1. ang/ml，并且最优选为至少1. 5mg/ml，并且不含沉淀的复合物。在一个优选的实施方案中，所述组合物含水。在一个优选的实施方案中， 所述组合物基本上不含未复合的核酸。在一个优选的实施方案中，所述壳聚糖-核酸复合物组合物另外包含聚集抑制剂。所述聚集抑制剂为部分或完全减少复合物聚集和/或沉淀的试剂并且通过浓缩方法， 优选通过使用切向流过滤(“TFF")来浓缩壳聚糖-核酸复合物。尽管可使用其它聚集抑制剂，例如能够减少复合物沉淀和能够浓缩壳聚糖-核酸复合物的其它糖类，但特别优选的聚集抑制剂为蔗糖。聚集抑制剂的实例包括但不限于海藻糖、甘油、果糖、葡萄糖和其它还原和非还原性糖类。在一个优选的实施方案中，所用聚集抑制剂为蔗糖。壳聚糖-核酸复合物分散体中蔗糖的浓度优选为按重量计在约3% -20%之间。最优选地，蔗糖浓度提供等渗组合物。在一个优选的实施方案中，所述强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物是等渗的。 在配制药物组合物期间，在维持复合物稳定性的同时实现等渗性是非常需要的，并且这些优选的组合物非常适于制药和治疗应用。在其它实施方案中，所述组合物可为高渗或低渗的。核酸所述强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物包含核酸组分和壳聚糖组分。本发明的核酸通常含有磷酸二酯键，尽管某些情况下出于任一多种目的(例如，稳定性和保护)包括可具有替代骨架或其它修饰或部分的核酸类似物。所考虑的其它核酸类似物包括带非核糖主链的类似物。另外，可制备天然存在的核酸、类似物及二者的混合物。所述核酸可为单链或双链或含有部分双链和单链序列。核酸包括但不限于DNA、RNA和杂合体，其中所述核酸含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基的任何组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。核酸包括任何形式的DNA、任何形式的RNA，包括三链体、双链体或单链体、反义、siRNA、核酶、 脱氧核酶、多聚核苷酸、寡核苷酸、嵌合体、微RNA及其衍生物。在一个实施方案中，核酸组分包含治疗性核酸。治疗性核酸包括治疗性RNA，这是能够在哺乳动物细胞中发挥治疗作用的RNA分子。治疗性RNA包括反义RNA、siRNA、短发夹RNA、微RNA和酶性RNA。治疗性核酸包括用于形成三链体分子的核酸、蛋白结合核酸、核酶、脱氧核酶和小核苷酸分子。治疗性核酸还包括编码治疗性蛋白的核酸。在一个优选的实施方案中，所述核酸组分包含治疗性核酸构建体。所述治疗性核酸构建体为能够发挥治疗作用的核酸构建体。治疗性核酸优选包含编码治疗性蛋白的核酸，但可替代生成治疗性RNA的转录产物。治疗性核酸可通过用作缺陷基因的替代物或增强物来用于实现基因治疗，或通过编码治疗性产物来补偿特定基因产物的缺乏。治疗性核酸也可抑制内源基因的表达。治疗性核酸可编码全部或部分翻译产物，并且可通过与细胞中已经存在的DNA重组来发挥作用，从而替代缺陷基因或其部分。治疗性核酸还可编码蛋白的一部分。治疗性蛋白可通过抑制基因产物发挥其作用。在一个优选的实施方案中，治疗性核酸选自U. S. S. N. 11/694,852中公开的核酸，该申请的全文以引用的方式明确并入本文。同样见全文以引用的方式明确并入本文的W02008020318。所考虑的供本发明使用的治疗性蛋白包括但不限于激素、酶、细胞因子、趋化因子、抗体、生长因子、分化因子、影响血块形成的因子、影响血糖含量的因子、影响葡萄糖代射的因子、影响脂类代谢的因子、影响血胆固醇水平的因子、影响血LDL或HDL水平的因子、 影响细胞凋亡的因子、影响食物摄取的因子、影响能量消耗的因子、影响食欲的因子、影响营养吸收的因子、影响发炎的因子和影响骨生成的因子。尤其优选的是编码以下各项的治疗性核酸胰岛素、瘦素、胰高血糖素拮抗剂、GLP-U GLP-2、(ihrelin、肠促胰酶肽、生长激素、凝血因子、？￥￥、促红细胞生成素、炎症抑制剂、11^-10、11^-17拮抗剂3顺0拮抗剂、IL-I 拮抗剂、生长激素释放激素或甲状旁腺激素。本发明中所考虑的特别优选的治疗性蛋白为抗炎蛋白。考虑用于本发明的抗炎蛋白包括但不限于抗炎细胞因子以及前炎性分子(例如前炎性细胞因子)的蛋白质拮抗剂。示例性抗炎蛋白包括 IL-10 (例如，Fedorak 等，2000，Gastroenterology. 2000 年 12 月；119 (6) :1473-82. ；Whalen 等，1999，J Immunol. 1999 年 3 月 15 日；162 (6) :3625-32)、 IL-IRa (例如，Arend 等，1998，Annu Rev Immunol. 1998 ；16 :27-55 ；Makarov 等，1996，Proc Natl Acad Sci USA. 1996 年 1 月 9 日；93(1) :402-6)、IL-lRa-Ig(例如，Ghivizzani 等， 1998，Proc Natl Acad SciUSA. 1998 年 4 月 14 日；95 (8) :4613-8)、IL_4(例如，Hogaboam 等，1997，J Clin Invest. 1997 年 12 月 1 日；100(11) :2766-76)、IL-17 可溶性受体(例如，Zhang 等，2006，Inflamm Bowel Dis. 2006 年 5 月；12(5) 382-8 ；Ye 等，2001，The Journal of Experimental Medicine,第 194 卷，第 4 期，2001 年 8 月 20 日，519-528)、 IL-6(例如，Xing 等，1998，J Clin Invest. 1998 年 1 月 15 日；101 (2) :311-20)、IL_11 (例如，Tr 印 icchio 等，1997，JImmunol. 1997 年 12 月 1 日；159(11) :5661-70)、IL-13 (例如，Mulligan 等，1997，J Immunol. 1997 年 10 月 1 日；159 (7) :3483-9 ；Muchamuel 等，1997，J Immunol. 1997年 3 月 15 日；158(6) J898-903)、IL-18 可溶性受体(例如，Aizawa 等，1999， FEBS Lett. 1999 年 2 月洸日；445 (2-3) :338-42)、TNF-α 可溶性受体(例如，Watts 等， 1999，J Leukoc Biol. 1999 年 12 月；66 (6) :1005-13)、TNF-α 受体 Ig (例如，Ghivizzani 等，1998，Proc Natl Acad Sci USA. 1998 年 4 月 14 日；95(8) :4613-8) ；TGF-β (例如， Song 等，1998，J Clin Invest. 1998 年 6 月 15 日；101 (12) :2615-21 ；Giladi 等，1994)、 IL-12(例如，Hogan 等，1998，Eur J Immunol. 1998 年 2 月；28 (2) :413-23)、IFN-γ (例如， Dow 等，1999，Hum Gene Ther. 1999 年 8 月 10 日；10(12) :1905-14)、IL-4 可溶性受体(例如，Steinke 等，2001，RespirRes. 2001 ;2 O) :66-70. Epub 2001 年 2 月 19 日)。用于本发明的特别优选的抗炎蛋白包括IL-10、TNFa的蛋白质拮抗剂和IL-I的蛋白质拮抗剂。表达控制区在一个优选的实施方案中，本发明的复合物包含治疗性核酸，所述治疗性核酸是包含与编码区可操作连接的表达控制区的治疗性构建体。所述治疗性构建体生成本身具有治疗性或者可编码治疗性蛋白的治疗性核酸。在一些实施方案中，治疗性构建体的表达控制区具有构成活性。在多个优选的实施方案中，治疗性构建体的表达控制区没有构成活性。这提供了治疗性核酸的动态表达。所谓“动态”表达是指随时间变化的表达。动态表达可包括若干这种被可检表达期分开的低表达或不表达期。在多个优选的实施方案中，所述治疗性核酸可操作地连接至可调启动子。 这提供了治疗性核酸的可调表达。表达控制区包含影响可操作连接的治疗性核酸表达的调节性多聚核苷酸(本文有时称为元件)，例如启动子和增强子。本文中包括的表达控制元件可来自于细菌、酵母、植物或动物(哺乳动物或非哺乳动物)。表达控制区包括全长启动子序列(例如天然启动子和增强子元件)以及保留全部或部分全长或非变异体功能(例如，保留一定量的营养调节或细胞/组织特异性表达) 的子序列或多聚核苷酸。本文所使用的术语“功能性”及其语法变型，用于核酸序列或片段时是指具有天然氨基酸序列(例如，非变异或未修饰序列)的一种或多种功能的序列。本文所使用的术语“变异”指序列取代、缺失或添加或其它修饰(例如，化学衍生物(如耐核酸酶的修饰形式))。本文所使用的术语“可操作连接”是指如所述使组分按其预期的方式作用的物理并列。在与核酸可操作连接的表达控制元件的实例中，该关系是便于控制元件调节核酸的表达。通常，调节转录的表达控制区并列于转录核酸的5'末端(即，“上游”)附近。表达控制区也可位于转录序列的3'末端(即，“下游”)或在转录产物内(例如，内含子内)。表达控制元件可距转录序列一定距离(例如，来自核酸的100至500个、500至1000个、2000 至5000个或更多个核苷酸)。表达控制元件的特殊实例是通常位于转录序列5'的启动子。 表达控制元件的另一个实例是可位于转录序列的5'或3'或位于转录序列内的增强子。一些表达控制区为可操作连接的治疗性核酸赋予可调表达。信号(有时称为刺激)可增强或降低与这种表达控制区可操作连接的治疗性核酸的表达。此类响应于信号增强表达的表达控制区常常被称为诱导型表达控制区。这种响应于信号降低表达的表达控制区常常被称为抑制型表达控制区。通常，这种元件赋予的增强或降低的量与存在的信号量成正比；信号量越多，表达增强或降低越多。本领域已知许多可调启动子。优选的诱导型表达控制区包括包含用小分子化合物刺激的诱导型启动子的那些表达控制区。在一个实施方案中，表达控制区对可口服但在血液中一般不存在的化学药品起反应。例如，可在美国专利第5，989，910,5, 935，934、 6，015，709和6，004，941号中找到具体实例。在一个实施方案中，所述治疗性构建体还包含整合序列。在一个实施方案中，所述治疗性构建体包含单条整合序列。在另一个实施方案中，所述治疗性构建体包含用于将治疗性核酸或其部分整合至靶细胞的基因组中的第一和第二整合序列。在一个优选的实施方案中，整合序列功能在于结合选自以下各项的整合元件mariner整合元件、sleeping beauty整合元件、FLP整合元件、Cre整合元件、Φ031整合元件、R整合元件、λ整合元件和来自整合病毒(例如AAV、逆转录酶病毒和慢病毒)的整合元件。在一个实施方案中，除治疗性构建体外，本发明组合物还包含非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码与第二表达控制区可操作连接的整合元件的核酸序列。该第二表达控制区和与所述治疗性核酸可操作连接的表达控制区可相同或不同。编码的整合元件优选选自mariner整合元件、sleeping beauty整合元件、FLP整合元件、Cre整合元件、OC31整合元件、R整合元件、λ整合元件和来自整合病毒(例如AAV、逆转录酶病毒和慢病毒)的整合元件。关于进一步教导，参见全文以引用的方式明确并入本文的W02008020318。制备强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物的方法尽管可使用其它方法，例如通过将核酸或壳聚糖溶液滴入另一种溶液中以形成混合溶液的方法，但优选通过在线混合制备强酸性壳聚糖-核酸复合物的组合物。然而，在线混合有利于大量同质壳聚糖-核酸复合物的制备，所述同质壳聚糖-核酸复合物的平均PDI 优选小于0. 5、更优选小于0. 4、更优选小于0. 3，并且最优选小于0. 2。在一个优选的实施方案中，所述分散体的PH在3. 5-5. 5之间。在线混合是一种已知方法，其中两股(或更多股)液体被汇聚成单股。2008年9 月26日提交的PCT/CA2008/001714(公开为W02009/039657)中有壳聚糖-核酸复合物在线混合和浓缩的附加说明，该申请的全文以引用的方式明确并入本文。在线混合的附加公开，参见例如各自的全文以引用的方式明确并入本文的U. S. 6，251，599和6，537，813。所述组合物可在所需低pH下复合，或可在较高pH和复合后调节的pH下复合，以形成所需强酸性分散体。虽然可使用诸如静态混合器和动态混合器的混合器，但此类装置导致使用本方法形成的复合物的PDI升高。因此，在本发明优选的实施方案中，不使用此类混合器进行在线
混合ο在一个优选的实施方案中，通过浓缩壳聚糖-核酸复合物的预浓缩分散体生产本发明的强酸性高浓度壳聚糖-核酸复合物组合物。在一个实施方案中，预浓缩分散体的pH 低于4.8，优选pH在3. 5-4. 5之间。在另一个实施方案中，预浓缩分散体的pH高于4. 5。可将浓缩产物的PH调节至低于4. 5。预浓缩分散体的浓度优选低于0. 5mg/ml。在本发明中，切向流过滤(“TFF")是浓缩壳聚糖-核酸复合物的预浓缩分散体的优选方式。在TFF操作中，泵送壳聚糖-核酸复合物分散体通过半透膜的表面，同时向所述膜施压以促使部分液体通过所述膜。比膜孔小的分子被运输通过所述膜孔并作为透过物收集。渗透溶质包括但不限于盐、离子、糖和微生物防腐剂。太大而不能通过所述膜孔的分子实体(包括壳聚糖-核酸复合物)留在流中并作为渗余物再循环。在TFF浓缩操作中， 当渗余物通向大气压的时候除去所述透过物，导致渗余物的体积减少。使用TFF，复合物浓度可升高很多倍，产物是高度浓缩的复合物分散体。在一个优选的实施方案中，所述浓缩的复合物分散体是等渗的。在一个优选的实施方案中，浓缩过程还包括一步或多步透滤操作。尽管可对pH高于4. 8的组合物使用透滤法，但在使用pH低于4. 8的预浓缩壳聚糖-核酸复合物组合物时尤其优选。在TFF透滤操作中，通过向渗余物添加新缓冲液不断补给透过物，导致渗余物中缓冲液的调换。使用TFF透滤法，在维持复合物浓度的同时可调换复合物的缓冲液，产物是有新缓冲液的复合物分散体。在一个实施方案中，在对浓缩复合物分散体进行TFF浓缩之前，对壳聚糖-核酸复合物的预浓缩分散体进行TFF透滤操作。在一个优选的实施方案中，在对浓缩复合物分散体进行TFF浓缩之后，对壳聚糖-核酸复合物的预浓缩分散体进行TFF透滤操作。在一个十分优选的实施方案中，在TFF浓缩操作期间进行TFF透滤操作。在该操作中，通过TFF浓缩部分浓缩壳聚糖-核酸复合物的预浓缩分散体，然后进行TFF透滤，然后进一步通过TFF 浓缩进行浓缩。这产生有新缓冲液的浓缩复合物分散体，该分散体进一步促进壳聚糖-核酸复合物的稳定性。在一个实施方案中，TFF透滤的洗液体积量优选少于40。在一个优选的实施方案中，TFF透滤的洗液体积量优选少于20。在一个更优选的实施方案中，TFF透滤的洗液体积量优选少于10。在一个十分优选的实施方案中，TFF透滤的洗液体积量优选少于6。在一个实施方案中，浓缩操作期间进行的TFF透滤操作次数少于5次而大于1次。 在一个优选的实施方案中，进行的TFF透滤操作次数为1次。在一个优选的实施方案中，TFF透滤缓冲液包含壳聚糖。在一个优选的实施方案中，TFF透滤缓冲液包含壳聚糖和平衡阴离子(优选醋酸根离子)。在一个优选的实施方案中，TFF透滤缓冲液包含壳聚糖、平衡阴离子(优选醋酸根离子)和聚集抑制剂(优选蔗糖)。在一个优选的实施方案中，通过加PH调节缓冲液将浓缩壳聚糖-核酸复合物分散体的PH调节至更低的pH。在一个优选的实施方案中，所述pH调节缓冲液包含壳聚糖。在一个优选的实施方案中，所述pH调节缓冲液包含壳聚糖和平衡阴离子(优选醋酸根离子)。在一个优选的实施方案中，所述pH调节缓冲液稍微稀释浓缩的壳聚糖-核酸复合物，优选低于5%。在一个优选的实施方案中，在完成TFF浓缩操作的Ih之内将所述pH调节缓冲液加入浓缩的壳聚糖-核酸复合物中。
12
在一个优选的实施方案中，预浓缩壳聚糖-核酸复合物分散体包含糖，优选蔗糖。 如下文所述，发现蔗糖是防止颗粒在浓缩过程中聚集的聚集抑制剂。使用方法一方面，本发明提供转染粘膜上皮细胞的方法。所述方法包括使所述粘膜上皮细胞与本发明的强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物接触。在一个实施方案中，在体外进行转染。在另一个实施方案中，在体内进行转染。本发明组合物适于向粘膜上皮施用并表现出粘膜上皮细胞高转染效率，尽管所述组合物具有强酸性。在一个优选的实施方案中，所述粘膜上皮存在于选自以下各项的组织中胃肠道组织、呼吸道组织、肺组织、窦洞组织、口腔组织、尿道组织、膀胱组织、阴道组织、子宫组织、 子宫颈组织、眼组织、食道组织、唾液腺组织、鼻咽组织、肾组织和喉/咽组织。一方面，本发明提供治疗涉及粘膜上皮炎症的疾病的方法。所述方法包括对患有涉及粘膜上皮炎症的疾病的患者施用治疗有效量的本发明药物组合物。所述受试药物组合物优选局部施用至所述粘膜上皮。所述受试药物组合物包含有抗炎活性的治疗性核酸。在一个优选的实施方案中，所述受试药物组合物包含编码抗炎蛋白的治疗性核酸构建体。在一个实施方案中，所述抗炎蛋白为TNFa抑制剂。在另一个优选的实施方案中， 所述抗炎蛋白为IL-10。在一个实施方案中，所述治疗性核酸为靶向前炎性细胞因子的治疗性RNA。特别优选的是靶向前炎性细胞因子的siRNA。在一个优选的实施方案中，所述涉及粘膜上皮炎症的疾病为IBD。在另一个优选的实施方案中，所述涉及粘膜上皮炎症的疾病为间质性膀胱炎。在另一个优选的实施方案中， 所述涉及粘膜上皮炎症的疾病为慢性阻塞性肺病(COPD)。在另一个优选的实施方案中，所述涉及粘膜上皮炎症的疾病为哮喘。本发明组合物非常适合用于治疗可通过粘膜上皮细胞转染治疗的疾病或病状。这种疾病包括但不限于涉及粘膜上皮组织的疾病。本发明组合物也可用于治疗不涉及可施用所述组合物的粘膜上皮组织的疾病和病状。这种病状和疾病仍然可通过这样的粘膜上皮组织转染进行治疗。例如，见全文以引用的方式明确并入本文的W02008020318。例如，可使用向肠粘膜上皮细胞施用本发明组合物以向全身输送编码的治疗性蛋白。治疗性核酸可通过用作缺陷基因的替代物或增强物来用于实现基因治疗，或通过编码治疗性产物来补偿特定基因产物的缺乏。治疗性核酸也可抑制内源基因的表达。治疗性核酸可编码全部或部分翻译产物，并且可通过与细胞中已经存在的DNA重组来发挥作用，从而替代缺陷基因或其部分。治疗性核酸还可编码蛋白的一部分。治疗性蛋白可通过抑制基因产物发挥其作用。可治疗的疾病或病状包括但不限于糖尿病、肥胖症激素缺乏症、炎症性肠病、腹泻、过敏性肠综合征、Gl传染病、胃溃疡、胃食管反流、胃轻瘫、痔疮、营养吸收障碍、胰腺炎、 血色素沉积症、乳糜泻、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、葡萄膜炎、色素性视网膜炎、虹膜炎、巩膜炎、青光眼、角膜炎、视网膜病、眼感染症(例如，角膜真菌病)、传染病、子宫内膜异位、子宫颈炎、泌尿疼痛、息肉、纤维瘤、子宫内膜增生、尿失禁、膀胱和尿路感染、膀胱过动症、勃起功能障碍、糖尿病性神经病、糖尿病性肾、膜性肾病、高血压、食物过敏、哮喘、多囊肾病、肾小球性肾炎、血脂异常/高胆固醇血症、代谢综合征、牛皮癣、痤疮、红斑痤疮、肉芽肿性皮炎、皱纹、色素脱失、慢性阻塞性肺病、呼吸道感染、囊肿性纤维化、肺血管疾病、纤维症、亨廷顿氏舞蹈病(Huntington' s disease)、阿尔茨海默症(Alzheimer disease)、帕金森氏症(Parkinson' s disease)、神经障碍、自身免疫性疾病、代谢综合征、动脉粥样硬化和炎症。所述方法包括向患者施用治疗有效量的本发明药物组合物。可用包含编码治疗性蛋白的治疗性核酸的本发明组合物生产本发明的治疗性蛋白。以下所述治疗性蛋白的用途指使用本发明组合物实现这种治疗性蛋白的用途。考虑用于本发明的治疗性蛋白具有多种活性并且可用于多种病症的治疗。以下对治疗性蛋白活性和可用本发明治疗性蛋白治疗的适应症的描述是示例性的而非旨在进行详尽说明。术语“受试者”指动物，优选哺乳动物，而人尤其优选。在所述治疗性蛋白为靶蛋白的拮抗剂的实施方案中，替代性治疗实施方案可采用靶向相同靶蛋白的治疗性RNA。下表中示出了一部分治疗性蛋白和目标疾病。
蛋白质目标疾病功能疗效胰岛素糖尿病替代胰岛素增强葡萄糖耐受性。
延迟/预防糖尿病。胰高血糖素拮抗剂糖尿病减少内源性葡萄糖生成增强葡萄糖耐受性GLP-I糖尿病肥胖症刺激A细胞生长，提高胰岛素敏感性， 抑制食欲增强葡萄糖耐受性。
诱发体重减轻。瘦素肥胖症糖尿病抑制食欲和提高胰岛素敏感性诱发体重减轻。 增强葡萄糖耐受性CCK肥胖症抑制食欲诱发体重减轻。生长激素(GH)GH缺乏、消痩和抗衰老替代GH促进生长凝血因子血友病替代凝血因延长凝血时间治疗性抗体和抗体片段/部分传染病病原体中和或免疫调节防止感染或移植排斥炎症抑制剂，例如， IL-10、TNFa 拮抗剂、 IL-17 拮抗剂、IL-I 拮抗剂胃肠器官炎症；例如，炎症性肠病；膀胱炎，例如，间质性膀胱炎；肺炎，例如， 慢性阻塞性肺病(COPD)；哮喘免疫调节、炎症调节预防靶组织的炎症
权利要求
1.一种强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物，所述组合物包含稳定的壳聚糖-核酸复合物，其中所述组合物的pH低于4. 5。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的PH低于4.2。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的PH低于4.0。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的PH低于3.8。
5.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物具有10-200mM之间的平衡阴离子浓度。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述平衡阴离子为醋酸根离子。
7.根据权利要求1所述的组合物，其具有至少0.5mg/ml的核酸浓度。
8.根据权利要求1所述的组合物，其具有至少1.Omg/ml的核酸浓度。
9.根据权利要求1所述的组合物，其具有至少1.5mg/ml的核酸浓度。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物不含复合物沉淀。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述壳聚糖-核酸复合物包含治疗性核酸构建体。
12.—种转染粘膜上皮细胞的方法，所述方法包括使所述粘膜上皮细胞与根据权利要求1所述的组合物接触。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述粘膜上皮存在于选自以下各项的组织中 胃肠道组织、呼吸道组织、肺组织、窦洞组织、口腔组织、尿道组织、膀胱组织、阴道组织、子宫组织、子宫颈组织、眼组织、食道组织、唾液腺组织、鼻咽组织、肾组织和喉/咽组织。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述粘膜上皮存在于胃肠道组织中。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述粘膜上皮存在于膀胱组织中。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述粘膜上皮存在于肺组织中。
17.一种药物组合物，其包含根据权利要求13所述的组合物，其中所述药物组合物的 PH低于4. 5。
18.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述药物组合物是等渗的。
19.一种治疗涉及粘膜上皮炎症的疾病的方法，所述方法包括对患有涉及粘膜上皮炎症的疾病的患者施用治疗有效量的根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述治疗性核酸构建体编码抗炎蛋白，并且其中将所述药物组合物局部施用至所述粘膜上皮。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗炎蛋白选自TNFa抑制剂、IL-I抑制剂和 IL-IO0
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗炎蛋白为IL-10。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病为IBD。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病为间质性膀胱炎。
24.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病为COPD。
25.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病为哮喘。
全文摘要
本发明提供强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物。所述组合物可用于在体内或体外转染细胞，并且尤其可用于转染粘膜上皮细胞。
文档编号C12N15/87GK102439158SQ201080021941
公开日2012年5月2日 申请日期2010年3月31日 优先权日2009年3月31日
发明者A·钟, C·弗里特, E·苏, J·高 申请人:恩吉内股份有限公司