一种酪蛋白/壳聚糖复合生物微球及其制备方法

专利名称：一种酪蛋白/壳聚糖复合生物微球及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种生物活性分子的载体——复合生物微球，尤其涉及一种酪蛋白/壳聚糖复合生物微球；本发明同时还涉及该复合生 物微球的制备方法。
背景技术：
天然高分子物质(如壳聚糖、淀粉等)及合成聚合物(如藻酸钙、聚丙烯 酰胺等)，由于表面具有功能基团而被广泛地用作载体材料。酪蛋白是一种天 然高分子化合物，其分子具有双亲性和良好的柔韧性。以蛋白质和生物多糖为 材料制备的内部多孔、表面有特殊功能基团的耐酸碱的酪蛋白复合高分子微 球，可以作为酶或其它生物活性分子的载体。中国专利CN10107040提供了一种具有核壳结构的糖基化聚丙烯微球的制 备方法，是以聚丙烯微球为载体材料，在紫外光辐照下接枝带羟基的丙烯酸酯 类单体，得到羟基化的聚丙烯微球；再将乙酰基保护的糖结合到此微球表面的 羟基上；然后把乙酰基保护的糖基化聚丙烯微球浸入甲醇钠/甲醇溶液中，脱 去乙酰基，得到糖基化的聚丙烯微球。该方法是将糖基结合在微球表面，可直 接装填成柱(高效液相色谱的固定相)或用作流化床的固体相，用于蛋白质的 分离、浓縮或靶向清除。由于糖基稳定存在于微球表面，易于回收并可重复使 用。但是，该方法制备的核壳结构的糖基化聚丙烯微球，在酸碱性溶液中稳定 性较差，而且生产工艺较复杂，成本高，从而影响了其作为生物载体的应用。发明内容本发明的目的在于提供一种酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。 本发明的另一目的是提供一种酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备方法。 本发明酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备方法，包括以下工艺步骤 (1)酪蛋白溶液的制备将酪蛋白以(1 8) : (100 200)的质量(g) /体积(ml)比加入到体 积分数为2 6%的冰乙酸水溶液中，在50。C 6(TC水浴中搅拌，得到酪蛋白溶液。(2) 复合胶体溶液的制备在室温下，将酪蛋白质量0.3 1倍的壳聚糖加入到上述制备的酪蛋白溶液 中，搅拌，使壳聚糖溶解，得到酪蛋白与壳聚糖的复合胶体溶液。(3) 乳化溶液的制备在40。C 5(TC水浴中，将吐温80或司盘80，上述复合胶体溶液加入到石 蜡-乙酸乙酯的混合溶液中，在搅拌下，乳化10 20min，得乳化溶液。所述吐温80或司盘80、复合胶体溶液、石蜡-乙酸乙酯混合溶液的体积比 为(1.5 4.0) : (30 60) : (50 90)。所述液体石蜡-乙酸乙酯混合溶液中石蜡与乙酸乙酯的体积比为(40 60): (10 30)。(4) 分散微球的制备在上述制备的乳化溶液中，加入质量浓度40 60%的戊二醛水溶液和质量 浓度37 40%的甲醛水溶液，升温到50 60。C，在搅拌下反应1 2h;反应完 成后静置8 10分钟，离心分离，固体部分依次用石油醚、无水乙醇或丙酮洗 涤，抽滤，得到分散的微球。所述乳化溶液、戊二醛水溶液、甲醛水溶液的体积比为(80 150) : (1.5 3) : (0.5 3)。(5) 酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备室温下，将上述制备的分散微球用蒸馏水洗涤，在30 4(TC， 0.02 0.09MPa条件下真空干燥4 10h，得酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。 本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的性能测试1、 利用扫描电镜经扫描电镜检测，本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球呈表面粗糙 且多孔的蜂窝状结构，微球形态均一，比表面积大，易于与生物活性物质发生 反应，粒径在0.8X102 3.1Xl()2um;其扫描电镜图见图1、 2、 3。2、 红外光谱分析本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的红外光谱见图2。红外光谱显 示，在3404.35cm—'处为O-H的伸縮振动的特征峰，可能与N-H的伸縮振动峰发 生了重叠；在2930.86cm"、 2874.03 cm"处的吸收峰是C-H (CH， CH2和CH3 ) 伸縮振动引起的；1448.54cm"是C-H的弯曲振动引起的，在1061.48 cm"处有 一个强的糖环特征吸收峰，在840cm"左右无吸收，说明不含a-糖苷键，而含p-糖苷键，这些均为多糖的吸收峰；在1527.62cm"处出现了-NH2的吸收峰，在 1658.78cm"处的为"ON的吸收峰，并且O-H的变角振动引起1236.71 cm"吸收 峰。红外光谱图表明，酪蛋白复合微球表面含有-NH2和-OH等功能基团。3、 DSC热分析图DSC热分析图显示，84'C为复合微球上残留有机溶剂挥发时的吸热峰， 在404'C开始分解，而壳聚糖微球的分解温度一般为20(TC。表明所制得微球 的耐热性能较好。4、 溶胀性测试室温下，溶胀性测试结果微球溶涨系数为0.60 0.93 ml/g，在pH1 14环境下稳定，耐酸碱性优良。从以上试验证明，本发明酪蛋白复合生物微球具有一NH2和一OH表面功 能基团，在ph 1 14环境下稳定，耐酸碱性强，使用范围广，溶胀系数小、 无毒、生物相容性良好，可以作为酶或其它生物活性分子的载体。微球表面的 功能基团能与酶和其它生物活性物质发生反应，将它们固定在微球的内部或外 表面，固定化了的这些活性分子的微球在多种反应中可以重复使用，且回收率 较高，可以节约成本。本发明以酪蛋白与壳聚糖复合物为原料，以戊二醛和甲醛为交联剂聚合而 成。原料来源充足广泛，其操作工艺简单，制备方法为常压、低温操作，安全 性好，设备投资少，成本低，是一种天然蛋白质复合微球的理想制备工艺。


图1为本发明酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的扫描电镜图 图2为酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的扫描电镜表面放大图 图3为酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的扫描电镜截面放大图 图4为本发明酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的红外光谱图 图5为本发明酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的热分析图具体实施方式
实施例l、酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备(1)取2g的酪蛋白加入到100ml体积分数为2。/。的冰乙酸水溶液中，冰 乙酸水溶液与酪蛋白比为体积(ml):质量(g) =100:2，在50。C水浴中、在 600rpm/min的搅拌下，得到酪蛋白溶液。(2) 将lg壳聚糖加入到上述制备的酪蛋白溶液中，在室温、600rpm/min 的搅拌转速下，使壳聚糖溶解，得到酪蛋白与壳聚糖的复合胶体溶液。(3) 在40。C水浴中、在600rpm/min的搅拌转速下，将1.5ml吐温80和 35ml复合胶体溶液先后加入到50ml的液体石蜡-乙酸乙酯混合溶液中(液体 石蜡和乙酸乙酯的体积比为4:1)，乳化10min，得乳化溶液。(4) 在乳化溶液中同时加入质量浓度为40%的戊二醛水溶液1.5ml，质量 浓度为37 40。/。的甲醛水溶液lml，升温到6(TC，在600rpm/min的搅拌转速 下反应lh;反应完成后静置8分钟，离心5分钟，弃去上层清液，剩余部分 依次用石油醚、无水乙醇或丙酮各浸泡30min，于0.06MPa下抽滤，得到分散 的微球。(5) 室温下，将所得分散的微球用蒸馏水洗涤微球若干次，在40°C， 0.08MPa条件下真空干燥5h，得酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。扫描电镜检测，本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球呈表面粗糙且 多孔的蜂窝状结构，微球形态均一，粒径在0.9Xl(^ 2.6X10、m。红外光谱图表明，酪蛋白复合微球表面含有-NH2和-OH等功能基团。 DSC热分析显示，其分解温度在392"C，具有较好的耐热性能。 溶胀性测试结果室温下，微球溶涨系数为0.71ml/g，在pH 1 14环境 下稳定，耐酸碱性优良。实施例2、酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备(1) 取4g的酪蛋白加入到150ml体积分数为4%的冰乙酸水溶液中，冰 乙酸水溶液与酪蛋白比为体积(ml):质量(g) =150:4，在55"C水浴中、 800rpm/min搅拌转速下，得到酪蛋白溶液。(2) 2.5g壳聚糖加入到上述制备的150ml酪蛋白溶液中，在25°C、 600rpm/min的转速下，使壳聚糖溶解，得到酪蛋白与壳聚糖的复合胶体溶液。(3) 在45"C水浴、800rpm/min的转速下，将3ml司盘80和45ml复合胶 体溶液先后加入到70ml液体石蜡-乙酸乙酯混合溶液中(液体石蜡和乙酸乙酯 的体积比为50:20)，乳化15min，得乳化溶液。(4) 在乳化溶液中同时加入质量浓度为50。/。的戊二醛水溶液2ml，质量浓 度为37 40%的甲醛水溶液1.5ml，升温到6(TC，在800rpm/min的搅拌转速 下反应1.5h，反应完成后静置9分钟，离心8分钟，弃去上层清液，剩余部分 依次用石油醚、无水乙醇或丙酮各浸泡40min， 0.06MPa下抽滤，得到分散的 微球。(5)室温下，将所得分散的微球用蒸馏水洗涤微球若干次，在40°C， 0.08MPa条件下真空干燥7h，得酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。
扫描电镜检测，本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球呈表面粗糙且 多孔的蜂窝状结构，微球形态均一，粒径在l.lX102 2.7X102um。
红外光谱图表明，酪蛋白复合微球表面含有-NH2和-OH等功能基团。 DSC热分析显示，其分解温度在404"，具有较好的耐热性能。 溶胀性测试结果室温下，微球溶涨系数为0.80ml/g。在pH 1 14环境 下稳定，耐酸碱性优良。
实施例3、酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备
(1) 取6g的酪蛋白加入到200ml体积分数为6%的冰乙酸水溶液中，冰 乙酸水溶液与酪蛋白比为体积(ml):质量(g) =200:6，在60。C水浴中、 1000rpm/min搅拌转速下，得到酪蛋白溶液。
(2) 将4g壳聚糖加入到上述制备的200ml酪蛋白溶液中，在室温下搅拌 (搅拌转速600rpm/min)，使壳聚糖溶解，得到酪蛋白与壳聚糖的复合胶体溶液。
(3) 在5(TC水浴、1000rpm/min的搅拌转速下，将3.5ml司盘80和55ml 复合胶体溶液先后加入到90ml液体石蜡-乙酸乙酯的混合溶液中(液体石蜡和 乙酸乙酯的体积比为60:30)，乳化20min，得乳化溶液。
(4) 在乳化溶液中同时加入质量浓度为40。/。的戊二醛水溶液2.5ml，质量 浓度为37 40%的甲醛水溶液2ml，升温到60°C，在1000rpm/min的搅拌转速 下反应2h，反应完成后静置10分钟，离心10分钟，弃去上层清液，剩余部 分依次用石油醚、无水乙醇或丙酮各浸泡30min， 0.06MPa下抽滤，得到分散 的微球。
(5)室温下，将所得分散的微球用蒸馏水洗涤微球若干次，在4(TC， 0.08MPa条件下真空干燥9h，制得酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。
扫描电镜检测，本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球呈表面粗糙且 多孔的蜂窝状结构，微球形态均一，粒径在1.3X102 3.1X102um。
红外光谱图表明，酪蛋白复合微球表面含有-NH2和-0H等功能基团。 DSC热分析显示，其分解温度在42(TC，具有较好的耐热性能。 溶胀性测试结果室温下，微球溶涨系数为0.79ml/g。在pH 1 14环境 下稳定，耐酸碱性优良。
权利要求
1、一种酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备方法，包括以下工艺步骤(1)将酪蛋白以(1～8)∶(100～200)的质量(g)/体积(ml)比加入到体积分数为2～6％的冰乙酸水溶液中，在50℃～60℃水浴中搅拌，得到酪蛋白溶液；(2)在室温下，将酪蛋白质量0.3～1倍的壳聚糖加入到上述制备的酪蛋白溶液中，搅拌，使壳聚糖溶解，得到酪蛋白与壳聚糖的复合胶体溶液；(3)在40℃～50℃水浴中，将吐温80或司盘80，上述复合胶体溶液加入到石蜡-乙酸乙酯的混合溶液中，在搅拌下，乳化10～20min，得乳化溶液；所述吐温80或司盘80、复合胶体溶液、石蜡-乙酸乙酯混合溶液的体积比为(1.5～4.0)∶(30～60)∶(50～90)；所述液体石蜡-乙酸乙酯混合溶液中石蜡与乙酸乙酯的体积比为(40～60)∶(10～30)；(4)在上述制备的乳化溶液中，加入质量浓度40～60％的戊二醛水溶液和质量浓度37～40％的甲醛水溶液，升温到50～60℃，在搅拌下反应1～2h；反应完成后静置8～10分钟，离心分离，固体部分依次用石油醚、无水乙醇或丙酮洗涤，抽滤，得到分散的微球；所述乳化溶液、戊二醛水溶液、甲醛水溶液的体积比为(80～150)∶(1.5～3)∶(0.5～3)；(5)室温下，将上述制备的分散微球用蒸馏水洗涤，在30～40℃，0.02～0.09MPa条件下真空干燥4～10h，得酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。
2、 如权利要求1所述酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备方法，其特征在 于所述搅拌速度为500 1000rpm/min。
3、 如权利要求1所述方法制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球，其特征在 于微球体呈表面多孔蜂窝状结构，表面含有一NH2和一OH功能基团；粒径 在0.8X 102 3.1 X 102um，分解温度在380~430°C ，溶胀系数为0.60 0.93ml/g， 在pHl 14环境中稳定。
全文摘要
本发明提供了一种酪蛋白/壳聚糖复合生物微球，是以天然酪蛋白与壳聚糖为原料，以戊二醛，甲醛为交联剂进行聚合反应而得。本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。本发明的复合生物微球体呈表面多孔蜂窝状结构，形态均一，粒径在0.8×10²～3.1×10²um；微球表面含有-NH₂和-OH功能基团；分解温度在380～430℃；溶胀系数为0.60～0.93ml/g，在pH 1～14环境中稳定，无毒、生物相容性良好，可以作为酶或其它生物活性分子的载体。本发明原料来源充足广泛，制备工艺简单，在低温、常压下制备，安全性好，设备投资少，成本低。
文档编号B01J13/02GK101530765SQ20091002150
公开日2009年9月16日 申请日期2009年3月5日 优先权日2009年3月5日
发明者继 张, 杜兆莉, 王云普, 陈久存, 颜小东, 魏铄蕴 申请人:西北师范大学