专利名称：一种自身免疫型复发性流产小鼠模型的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种动物模型的构建方法，用于自身免疫型复发性流产及抗磷脂抗体 综合征的发病机制研究、诊断及治疗的动物实验研究。
背景技术：
自身免疫型复发性流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)是指与自身免 疫有关的连续发生3次或3次以上的自然流产者，是一种自身免疫病，被认为是抗磷脂抗体 综合征(Anti-phospholipids syndrome, APS)的临床表现之一。长期以来，因为自身免疫 型RSA及APS的发病机制尚未阐明，对自身免疫型RSA及APS的治疗，临床上缺乏针对性 的、有效的治疗措施，患者往往以再次妊娠失败而告终，这给流产患者的家庭造成了极大的 痛苦。因此，自身免疫型RSA的发病机制探讨及治疗探索是近年的研究热点课题。为了阐明自身免疫型RSA和APS的发病机制，人们从上世纪90年代就开始了动 物模型的研究。APS的动物模型研究主要有APS自发性遗传模型和实验诱导模型两种。自 发性遗传模型的研究源于SLE小鼠品系，1989年Gharavi等人对SLE小鼠三种主要品系进 行IgG型ACA (抗心磷脂抗体)测定，结果显示MRL/lpr及MRL/+品系ACA水平升高。实验 证实MRL/lpr小鼠具有APS表现，如生殖力下降、血小板减少并伴血清高滴度的ACA等，并 存在脑血栓等脑部病变，SLE小鼠品系存在基因缺陷，但在临床上大多数APS及自身免疫型 RSA均发生于既往无自身免疫性疾病病史的患者，没有证据提示这类患者存在基因缺陷，因 此实验诱导模型可能更符合自身免疫型RSA和APS的临床特征。到目前为止，实验诱导模型 所采用的主要免疫原为ACA。1990年M. Blank等采用尾静脉注射人和鼠的ACA诱发BALB/ c及孕ICR小鼠均出现低种植胚胎数、胚胎高吸收率及胚胎、胎盘重量下降等现象。Bakimer R等人用ACA单克隆抗体IgM进行腹腔注射免疫BALB/c小鼠后，诱发出了高滴度的ACA以 及典型的APS的临床表现。1998年，Shoenfeld Y证实磷脂酰丝氨酸及其抗体均可成功诱 导出APS。1999年Krause等利用ACA尾静脉注射诱导BALB/c产生APS小鼠。纵观现有有 关实验诱导型自身免疫型RSA和APS的小鼠模型研究，我们发现，虽然都能够诱导出相关的 临床特征，但是即使是采用同一种免疫原和免疫途径所得到的结果如种植胚胎数、胚胎丢 失率及ACA滴度等方面均存在较大的差异，这说明ACA所诱导的实验型模型存在一定的缺 陷。目前亦缺乏一种理想的自身免疫型RSA动物模型，这给疾病的发病机制探讨以及治疗 研究带来很大的不便。
发明内容
本发明的目的是提出一种能造成稳定的胚胎丢失及产生胚胎丢失的小鼠发生率， 并伴有自身免疫反应的自身免疫型RSA小鼠模型的构建方法。本发明的技术方案是采用人β 2GP-1作为免疫原，以子宫腔注射作为免疫途径。 具体构建方法选取8周龄BALB/c小鼠，应用人β26Ρ-1200μβ/πι1 50 μ 1，采用子宫腔注 射方法，并以腹腔注射、皮下注射作为免疫途径的对照方法，以佐剂、生理盐水(NS)代替人β 2GP-1行子宫腔注射作为免疫原对照方法，第8天加强免疫一次，第18天合笼小鼠，观察 妊娠结局以及进行相关指标的检测。本发明采用的小鼠均为BALB/c清洁级近交系小鼠。相对现有技术，本发明动物模型的构建方法安全可靠、简便经济，减少了自身免疫 型RSA小鼠模型的造模时间、提高造模成功率和造模效率，具有良好的应用前景。
具体实施例方式实施例11、材料和方法1.1 试剂人β 2GP-1 (β 2-glycoprotein-l)，购自美国 Cell Sciences 公司， CFA(Freund‘ s Adjuvant Complete)、IFA(Freund' s Adjuvant Incomplete),购自美国 Sigma公司，BALB/c小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供。1.2实验动物8周龄清洁级雌、雄性BALB/c近交系小鼠，由中国科学院上海实验动物中心提供， 体重20 士 2g。2、动物模型的构建雌性Balb/c小鼠40只，雄性20只。雌性随机分成正常妊娠组(n = 8)、子宫腔注 射β 2GP-1组(η = 8)、腹腔注射β 2GP-1组(η = 5)、皮下注射β 2GP-1组(η = 7)、子宫 腔注射佐剂组(η = 7)及子宫腔注射NS组(η = 5)。正常妊娠组未做任何干预，雌、雄小鼠按2 1合笼。实验组(1)子宫腔注射β 2GP-1组(以下称宫腔β 2GP-1组)采用人β 2GP-1进行子宫 腔注射免疫BALB/c (早)小鼠。具体方法人β 2GP-1溶于无菌PBS中，调整浓度为400 μ g/ ml，第1天注射人β 2GP-1溶液与弗氏完全佐剂1 1比例混合液50 μ 1 (即人β 2GP-1最 终浓度为200μ g/ml)；第8天以弗氏不完全佐剂代替完全佐剂加强免疫1次，剂量同第1 次；至第18天雌、雄小鼠按2 1合笼。自合笼之日起，每天8:00和14:00分别观察1次， 如见阴栓即确定为妊娠第1天。(2)腹腔注射人β 2GP-1组(以下称腹腔组)采用腹腔注射人β 2GP-1方法，人 β 2GP-1及佐剂注射时间、剂量、合笼时间同宫腔β 2GP-1组。(3)皮下注射人β 2GP-1组(以下称皮下组)采用皮下注射人β 2GP-1方法，人 β 2GP-1注射时间、剂量、合笼时间同宫腔β 2GP-1组。子宫腔注射对照组(1)子宫腔注射佐剂组(以下称宫腔佐剂组)以无菌PBS代替人i32GP_l，其余 同宫腔3 2GP-1组。(2)子宫腔注射NS组(以下称宫腔NS组)仅采用NS 50 μ 1进行子宫腔注射，注 射时间、次数、合笼时间同宫腔0 2GP-1组。附子宫腔注射方法采用自制子宫腔注射器进行注射。注射器制作方法如下选 用美国Axygen公司Tip头，在无菌超净台操作，用酒精灯加热3 5秒，镊子拉住Tip头前端，缓慢拉长至长度3cm、直径Imm左右大小，剪去前端稍许，Tip头后面接Iml注射器即为 子宫腔注射器。注射时，左手抓住小鼠头颈及背部以固定小鼠，右手持注射器，将注射针头 通过阴道，缓慢推入子宫腔后(进针共约1cm)，开始缓慢注射(注射时间需大于1分钟)。 小鼠子宫腔注射染料后，子宫充盈注射液，而盆腔、腹腔临近器官均未见染色。在妊娠第14天颈椎脱白法处死孕鼠，观察以下指标(1)胚胎丢失率胚胎丢失率(Embryo loss rate, ELR)=[丢失胚胎数/(丢失 胚胎数+存活胚胎数)]X 100%。胚胎丢失判断标准参照赵爱民等人及BertOja等人文献。(2)产生胚胎丢失的小鼠发生率产生胚胎丢失的小鼠发生率=(出现胚胎丢失 的小鼠数/小鼠总数)X 100%。(3)采用ELISA方法检测外周血抗β 2GP-1抗体浓度。3、结果(1)胚胎丢失率结果如表1。 表1显示实验3组胚胎丢失率显著高于正常妊娠组(P < 0. 05)，宫腔β 2GP-1组亦 显著高于子宫腔注射对照组(P < 0. 05)，正常妊娠组与子宫腔注射对照组各组之间比较， 差异无显著性(P > 0. 05)。(2)产生胚胎丢失的小鼠发生率结果见表2。
表2显示仅宫腔β 2GP-1组产生胚胎丢失的小鼠发生率显著高于正常妊娠组、宫 腔NS组(P < 0. 05)，其余组别之间比较，差异无显著性(P > 0. 05)。(3)外周血抗β 2GP-1抗体浓度结果见表3。 表3显示，实验3组抗β 2GP-1抗体浓度均显著高于正常妊娠组及子宫腔注射对 照组(Ρ<0. 05)，正常妊娠组与子宫腔注射对照各组之间比较，差异无显著性(Ρ>0. 05)。实施例21、材料和方法
1.1 试剂人β 2GP-1 (β 2-glycoprotein-l)，购自美国 Cell Sciences 公司， CFA(Freund‘ s Adjuvant Complete)、IFA(Freund' s Adjuvant Incomplete),购自美国 Sigma公司，BALB/c小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供。1. 2实验动物8周龄清洁级雌、雄性BALB/c近交系小鼠，由中国科学院上海实验动物中心提供， 体重20 士 2g。2、动物模型的构建雌性Balb/c小鼠37只，雄性19只。雌性随机分成正常妊娠组(n = 7)、子宫腔注 射β 2GP-1组(η = 7)、腹腔注射β 2GP-1组(η = 5)、皮下注射β 2GP-1组(η = 7)、子宫 腔注射佐剂组(η = 6)及子宫腔注射NS组(η = 5)。正常妊娠组未做任何干预，雌、雄小鼠按2 1合笼。实验组(1)子宫腔注射β 2GP-1组(以下称宫腔β 2GP-1组)采用人β 2GP-1进行子宫 腔注射免疫BALB/c (早)小鼠。具体方法人β 2GP-1溶于无菌PBS中，调整浓度为400 μ g/ ml，第1天注射人β 2GP-1溶液与弗氏完全佐剂1 1比例混合液50 μ 1 (即人β 2GP-1最 终浓度为200μ g/ml)；第8天以弗氏不完全佐剂代替完全佐剂加强免疫1次，剂量同第1 次；至第18天雌、雄小鼠按2 1合笼。自合笼之日起，每天8:00和14:00分别观察1次， 如见阴栓即确定为妊娠第1天。(2)腹腔注射人β 2GP-1组(以下称腹腔组)采用腹腔注射人β 2GP-1方法，人 β 2GP-1及佐剂注射时间、剂量、合笼时间同宫腔β 2GP-1组。(3)皮下注射人β 2GP-1组(以下称皮下组)采用皮下注射人β 2GP-1方法，人 β 2GP-1注射时间、剂量、合笼时间同宫腔β 2GP-1组。子宫腔注射对照组(1)子宫腔注射佐剂组(以下称宫腔佐剂组)以无菌PBS代替人i32GP_l，其余 同宫腔3 2GP-1组。(2)子宫腔注射NS组(以下称宫腔NS组)仅采用NS 50 μ 1进行子宫腔注射，注 射时间、次数、合笼时间同宫腔0 2GP-1组。子宫腔注射方法同实例1。在妊娠第14天颈椎脱白法处死孕鼠，观察以下指标(1)胚胎丢失率胚胎丢失率(Embryo loss rate, ELR)=[丢失胚胎数/(丢失 胚胎数+存活胚胎数)]X 100%。胚胎丢失判断标准参照赵爱民等人及BertOja等人文献。(2)产生胚胎丢失的小鼠发生率产生胚胎丢失的小鼠发生率=(出现胚胎丢失 的小鼠数/小鼠总数)X100%。(3)采用ELISA方法检测外周血抗β 2GP-1抗体浓度。3、结果(1)胚胎丢失率结果如表4。
表4显示实验3组胚胎丢失率显著高于正常妊娠组(P < 0. 05)，宫腔β 2GP-1组亦 显著高于子宫腔注射对照组(P < 0. 05)，正常妊娠组与子宫腔注射对照组各组之间比较， 差异无显著性。(2)产生胚胎丢失的小鼠发现率结果见表5。
表5显示实验组仅宫腔β 2GP-1组产生胚胎丢失的小鼠发生率显著高于正常妊娠组、宫腔佐剂组及宫腔NS组(P<0. 05)，其余组别之间比较，差异无显著性(P>0. 05)。
(3)外周血抗β 2GP-1抗体浓度结果见表6。 表6显示，实验3组抗β 2GP-1抗体浓度均显著高于正常妊娠组及子宫腔注射对 照组(Ρ<0. 05)，正常妊娠组与子宫腔注射对照各组之间比较，差异无显著性(Ρ>0. 05)。综上，由表1 6可以看出，实施例1、2应用子宫腔注射人β 2GP-1方法免疫BALB/ c小鼠诱导自身免疫型RSA小鼠模型其胚胎丢失率显著高于正常妊娠组以及子宫腔注射对 照组，产生胚胎丢失的小鼠发生率结果显示子宫腔注射方法的稳定性优于腹腔注射以及皮 下注射方法，外周血抗0 2GP-1抗体表达情况显示了模型小鼠存在自身免疫反应状态，符 合自身免疫型RSA的临床特征。以上实例说明，子宫腔注射人β 2GP-1方法是目前最佳的自身免疫型RSA小鼠模 型的建立方法，此方法安全可靠、简便经济、可重复性高，为进一步的实验研究打下良好的 ■石出。
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权利要求
一种自身免疫型复发性流产小鼠模型的构建方法，其特征在于所用动物为8周龄BALB/c小鼠；免疫原为人β2GP 1；构建方法为将人β2GP 1稀释为200μg/ml，采用子宫腔注射方法注射BALB/c小鼠，剂量为50μl，并在第8天加强免疫一次。
2.如权利要求1所述的自身免疫型复发性流产小鼠模型的构建方法，其特征在于，在 第18天合笼小鼠，观察妊娠结局以及进行相关指标的检测。
3.如权利要求1或2所述的自身免疫型复发性流产小鼠模型的构建方法，其特征在于， 所述BALB/c小鼠为清洁级近交系小鼠。
全文摘要
本发明涉及一种动物模型的构建方法，具体涉及一种用于自身免疫型复发性流产及抗磷脂抗体综合征的发病机制研究、诊断及治疗的动物实验研究模型。通过BALB/c小鼠子宫腔注射人β2GP-1诱导建立自身免疫型复发性流产小鼠模型。本发明动物模型的构建方法安全可靠、简便经济，减少了自身免疫型RSA小鼠模型的造模时间，提高了造模成功率和造模效率，具有良好的应用前景。
文档编号A61K39/00GK101897962SQ20101021768
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月2日 优先权日2010年7月2日
发明者肖世金, 赵爱民, 鲍世民 申请人:上海交通大学医学院附属仁济医院;中国科学院上海生命科学研究院