一种苹果酸‑乳酸发酵菌株及其培养方法和应用与流程

本发明涉及菌株领域，具体涉及一种苹果酸-乳酸发酵菌株及其培养方法和应用。
背景技术：
：目前，在国内还没有专业生产葡萄酒酿造用的高活性乳酸菌，葡萄酒企业只能从国外进口乳酸菌。通过该项目的实施，研究葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中环境条件对菌体生长的影响、苹果酸代谢规律以及能量代谢等方面的内容。选育出具有本土特色、原产地风格的优良乳酸菌株，提高乳酸菌株的良种率和供应能力具有很好的社会效益。技术实现要素：针对上述问题，本发明通过依据葡萄品种和土壤特点，从表皮上筛选苹果酸-乳酸发酵的酒类酒球菌，经诱变后菌株200株进行初筛和复筛，采用形态学鉴定、生理生化鉴定、培养基的筛选、发酵体系ph值的筛选、总酸滴定、高效液相色谱等试验方法，最终成功筛选出1株突变菌株：lab2-1菌株。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种苹果酸-乳酸发酵菌株，所述菌株为lab2-1菌株。上述苹果酸-乳酸发酵菌株的培养方法，包括如下步骤：在一个干净的容器中，加入100升蒸馏水和100升葡萄汁，调整温度到20。c，加入促进剂搅拌均匀，然后将lab2-1菌株缓慢加入，边加边搅拌，使之均匀，在18-22温度下扩培24小时，检测扩培液菌落达到107-108cfu/ml时，得可中试100吨干红葡萄原酒苹果酸-乳酸发酵用扩培液。上述一种苹果酸-乳酸发酵菌株可用于葡萄酒苹果酸-乳酸发酵，具体包括如下步骤：将lab2-1菌株与酵母菌同时接入到待浸提发酵的果浆中，启动两个发酵过程，初始启动温度18-20℃，在酒精发酵启动24小时后，添加乳酸菌扩培液，发酵温度保持18-20℃，7天后检测苹果酸≤0.8g/l时升温24-26℃至酒精发酵结束，降温至18-20℃，在此温度下继续进行苹果酸-乳酸发酵，使苹果酸分解完全彻底后同果皮分离。本发明具有以下有益效果：经过诱变筛选的lab2-1菌株发酵的葡萄酒其苹果酸-乳酸转化率为38.83％，发酵后酒的色度(od值)可达到14，酒的柔和指数为6.95，在发酵期间保持微生物之间的相互作用和平衡，快速抑制会引起变质的微生物群落。为苹果酸-乳酸发酵赢得时间，从而能够节省升温操作所造成的成本。中试产品各项指标符合国家标准，其中部分限定指标高于国家标准，本产品挥发酸含量0.42g/l，低于国际及国家标准限定指标(≤1.2g/l)要求，葡萄酒细菌学稳定性增加。附图说明图1为混合酸(苹果酸和乳酸)的标准品色谱图。图2为苹果酸标准曲线。图3为乳酸标准曲线。图4为发酵周期中苹果酸的含量分析。图5为葡萄酒在发酵周期中苹果酸、乳酸和总酸的变化。图6为发酵周期中乳酸含量的变化。图7为不同发酵时期干红葡萄酒总糖浓度的变化趋势(浓度mg/l)图8为在发酵周期中葡萄酒样中单宁含量的变化。图9为葡萄酒样的色谱图。图10为葡萄酒样柠檬酸加标的色谱图。图11为葡萄酒在发酵过程中柠檬酸的变化趋势。图12为本发明实施例葡萄酒苹果酸-乳酸发酵的工艺流程图。具体实施方式为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例放大增菌条件的确定：放大增菌数量1000克，在一个干净的容器中，加入100升蒸馏水和100升葡萄汁，调整温度到20℃，加入促进剂搅拌均匀，然后将利用诱变筛选好的乳酸菌缓慢加入，边加边搅拌，使之均匀，在18-22温度下扩培24小时，检测扩培液菌落达到107-108cfu/ml时，可中试100吨干红葡萄原酒苹果酸-乳酸发酵用扩培液。苹果酸、乳酸在各自的浓度范围内和色谱条件下相关系数均大于0.9995，相关性良好。根据得到的标准曲线，可将葡萄酒样中相应物质的峰面积代入相应的线性方程即可得到葡萄酒中相应物质的浓度。agilent1100高效液相色谱仪对目标物的分析方法是线性的，仍然选用外标法进行分析，结果见图1，图2，图3。该干红葡萄酒在发酵过程中苹果酸的浓度范围是6.97144-8.00600g/l，乳酸的浓度在3.82726-5.22338g/l范围内。从图5可见葡萄酒在发酵过程中苹果酸的含量呈下降趋势，而乳酸呈上升趋势。其变化规律可解释为①葡萄酒中的苹果酸来源于葡萄，前段的下降主要是由于酒精发酵的过程中被酵解。从发酵第11天至发酵第25天这一段平台期可能是由于酵母菌分解苹果酸已经达到阈值，苹果酸浓度不再下降。后一段时间苹果酸含量下降后达到平台期，主要是由于葡萄酒进入苹果酸-乳酸发酵后，乳酸菌分解苹果酸而产生乳酸而导致的。综上，苹果酸在发酵过程中含量的降低一部分是由于酵解，另一部分是由于乳酸菌的分解而减少。②葡萄酒中的乳酸并不是来源于葡萄，而是发酵的产物。葡萄酒在发酵过程中乳酸含量变化趋势线中前段的上升主要是由于前发酵的过程中酵母代谢产生少量的乳酸，后一段时间乳酸含量上升主要是由于进入苹果酸-乳酸发酵后，乳酸菌分解苹果酸而产生乳酸而导致的。(3)干红葡萄原酒苹-乳发酵接种的时间：确定适宜的接种时间是为了保证苹-乳发酵顺利进行，苹果酸全部转化的情况下尽量避免酒石酸分解和色泽的锐减。因此，选择接种的最佳时间，第一个选择是在酒精发酵期间进行接种；第二个选择是在酒精发酵结束后立即进行接种；发酵结束分析不同接种时间所对应的挥发酸、苹果酸、ph值、色度指标，确定出了可行的接种方法及时间如下：酒精发酵启动接种：将诱变菌株与酵母菌同时接入到待浸提发酵的果浆中，启动两个发酵过程，初始启动温度18-20℃，在酒精发酵启动24小时后，添加乳酸菌扩培液，发酵温度保持18-20℃，7天后检测苹果酸≤0.8g/l时升温24-26℃至酒精发酵结束。为使苹果酸-乳酸发酵继续进行，故采用延迟与皮渣接触时间，降温至18-20℃，在此温度下继续进行苹果酸-乳酸发酵，使苹果酸分解完全彻底后同果皮分离。以适应苹果酸-乳酸发酵的顺利进行。酒精发酵结束接种：在酒精发酵快要结束原酒与果皮分离，所得原酒添加乳酸菌扩培液，搅拌均匀后入橡木桶中进行苹果酸-乳酸发酵，入桶数量为容器的95％，密封桶口，将酒窖温度控制在22-24℃，苹果酸全部转化为乳酸发酵结束。由图6-图7可看出，糖的含量变化可分五个阶段：第一阶段，在进入发酵期前13天糖含量平稳下降；第二阶段，至第15天糖含量猛然升高，酒液中的糖含量升高甚至超过酒液的初始糖含量；第三阶段，第15天到第23天样品中的糖含量急剧降低几乎趋近于0；第四个时期即糖的含量又骤然升高；第五个时期即第25天开始至发酵结束，糖含量有短暂的升高后趋于平稳下降，由6.05-3.98mg/l，符合干红葡萄酒的标准。单宁的百分含量变化趋势可分为四个阶段：第一阶段，进入发酵期的前7天单宁百分含量稍有降低；第二阶段，自发酵的第7天起到第9天，单宁百分含量升高；第三阶段，发酵中期，即第9天到第19天，单宁含量持续降低至最小值；第四阶段，自第19天到第31天，单宁百分含量第二次升高，随后基本达到一个平台期。干红葡萄酒在发酵过程中的变化规律的原因可能是：单宁含量降低。由于单宁主要存在于葡萄的果梗、果皮中，发酵刚开始，单宁含量较高，可推测，制作时混入了大量葡萄枝梗，单宁可直接融入到酒液中，随着发酵的进行，葡萄枝梗被筛出去，单宁含量稍有降低。单宁含量升高。随着发酵的进行，一部分来源于葡萄的单宁，即儿茶单宁、缩合单宁或焦儿茶单宁，也称内源单宁，在葡萄酒发酵的过程中从葡萄果皮和籽中浸提出来。但浸提的过程比较缓慢，因此通常在葡萄酒中的花色素刚开始浸出时便添加单宁，一般在发酵启动前两天加入，若加入时间太晚，则会起不到应有的缩合作用，以保证单宁迅速与花色素相结合，保证酒的品质和色泽。单宁含量开始逐渐下降。此阶段既有来源于葡萄的单宁在葡萄酒发酵过程中从果皮和葡萄籽中逐渐浸提出来的，使发酵液中单宁含量增多，又有单宁和其它物质的综合反应而被消耗。葡萄酒中柠檬酸含量的分析。在测定柠檬酸的最佳色谱条件下，将不同发酵时期的干红葡萄酒样分别进样，得到葡萄酒样的高效液相色谱图，如图9。根据图10柠檬酸标准品的色谱图可以得出，在色谱条件下柠檬酸的保留时间为4.9min左右。由于葡萄酒中其他物质的干扰，葡萄酒中柠檬酸的保留时间会与柠檬酸标准溶液的保留时间有所出入，并不是完全吻合。因此，进行加标实验是十分必要的，即在葡萄酒样中加入一定浓度的柠檬酸标准溶液，得到的色谱与相应的没加柠檬酸标准液的葡萄酒样进行对比观察。葡萄酒中柠檬酸浓度的数据。对葡萄酒样色谱图中柠檬酸的峰进行积分，得到柠檬酸的峰面积。然后根据柠檬酸标准曲线：y＝1437.5x+45.365，(其中y为柠檬酸峰的峰面积，x为葡萄酒中柠檬酸的浓度g/l)计算出柠檬酸的浓度，列于表1：表1干红葡萄酒不同发酵时期柠檬酸浓度表1可以看出，测得的该品种的干红葡萄酒柠檬酸浓度在发酵前期小于0.15g/l，发酵后期，其浓度范围是在0.07-0.3g/l之间。葡萄酒发酵过程中柠檬酸的变化趋势从图11可以看出，干红葡萄酒在发酵过程中生成的柠檬酸含量变化可分为四个阶段：(1)随着酒精发酵的进行，柠檬酸含量逐渐上升，且上升的速度较为缓慢，直至发酵第13天达到最大值0.18702g/l。(2)进入苹乳发酵后，柠檬酸含量从发酵第13天达到最高值开始有所下降，到发酵第18天达到最小值。(3)当柠檬酸含量很少时，在发酵第19天突然增加至0.23091g/l。(4)从发酵第19天开始，柠檬酸含量逐渐减少，呈缓慢下降趋势并趋于平缓。表2酒精发酵启动和结束成分对比分析数据由上表可以看出，在启动酒精发酵24小时后接种乳酸菌，此时对乳酸菌发酵温度必须在18-20℃的条件下进行易于掌控，此时提升了苹果酸-乳酸发酵速率。在发酵期间保持微生物之间的相互作用和平衡，快速抑制会引起变质的微生物群落。为苹果酸-乳酸发酵赢得时间，从而能够节省升温操作所造成的成本和降低对大自然的污染；减少化学分析测定的次数和成本；使酒窖的管理变得更加方便舒适；能够更早地结束苹果酸-乳酸发酵，从而可以更早地进行新酒的品尝对销售带来帮助。(5)酒精发酵结束接种：酒精发酵结束接种苹果酸-乳酸发酵启动缓慢，发酵周期长，容易引起变质现象的野生菌种的活性和繁殖，导致挥发酸增高，色泽锐减的现象。(6)通过实施本项目，购置关键工艺设备和检测设备和法国橡木桶，得出了在橡木桶中进行苹果酸-乳酸发酵及陈酿稳定性指标。表3橡木桶中苹果酸-乳酸发酵及陈酿陈酿标准要求表6工艺技术指标项目熟化前指标熟化后指标酒精度(20℃)％vol11-1212-13挥发酸(以醋酸计)g/l≤1.1≤0.7干浸出物g/l≥16≥18游离二氧化硫mg/l≤50≤30总二氧化硫mg/l≤150≤100ph≤3.8≤3.6色度(0d值)≤6≥10以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12