一种微白黄链霉菌菌株及其在农药中的应用的制作方法

本发明涉及一种来源于海洋的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌及其在农药中的应用，属于海洋微生物的应用和农作物病害防治等微生物
技术领域：
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背景技术：
：真菌性病害是造成农作物产量和品质降低的最主要原因。化学农药的频繁使用导致一些病原真菌抗药性急剧增强、造成环境与农产品的污染，以及破坏植物体内外微生物平衡而加剧病害的爆发流行等。土传植物真菌病害的防治研究一直以来是一个热点和难点，市面上的杀菌剂一般来说对其没有或是效果甚微。多年来人们也筛选到了一些抗土壤真菌的生防菌，如盾壳霉(coniothyriumminitans)用于纹枯病菌的防治、绿色木霉用于纹枯病菌及终极腐霉(pythiumultimum)引起的苗病或根腐病在内的各种病害的防治、灰绿链霉菌(streptomycesgriseoviridis)用于棉花枯萎病的防治等。这些土壤真菌病害生防菌株虽然都具有较强的抗真菌活性，但田间试验效果较差，很多菌株发酵性能较差，并且在应用中通常有一定的地域局限性。技术实现要素：本发明的目的是提供一种分离自深海污泥、用于防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68在农药中的应用。本发明所保护的是分离自深海污泥的微白黄链霉菌w68以及以该菌制备的微生物农药的应用技术。本发明所述的深海的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌害的微白黄链霉菌分离于海洋活性污泥，将定量的活性污泥装入含有小玻璃珠的无菌水中进行预处理，采用含有终浓度为50ug/ml重铬酸钾的高氏一号培养基进行分离培养，再使用pda培养基进行纯化培养。在ncbi数据库中比对16srdna序列，鉴定该基因属于streptomycesalbidoflavus类群。目前该菌已于2016年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(cgmcc)，保藏号为cgmccno.12210本发明中所述分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌害的微白黄链霉菌的生物学特征如下：表1.防治土传真菌病害的微白黄链霉菌害的微白黄链霉菌的菌落特征培养基菌落正面颜色菌落背面颜色isp2白色黄色isp3微黄微黄isp4白色白色isp5微痕生长无色素bennete白色微黄，白色cazpek’s微黄微黄glu+asp微痕生长无色素glu+asp+m白色白色pda白色黄色防治土传真菌病害的微白黄链霉菌害的微白黄链霉菌在各种培养基上的菌落特征见表1。在pda培养基上培养5-7天，气生菌丝初期呈白色，粉状，有白色和乳脂色次生丛。产孢后菌落呈现微黄色。扫描电镜观察孢子丝成弯曲型，无螺旋，每条孢子丝含大约30到50个孢子；孢子呈圆柱形，表面光滑，无凸起，无刺状物(图1)。本发明中所述分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌害的微白黄链霉菌的抗真菌活性如下：分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌害的微白黄链霉菌具有广谱的抗真菌活性。平板对峙实验显示，防治土传真菌病害的微白黄链霉菌对轮枝样镰刀菌(fusariumverticillioides)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、平脐蠕孢菌(bipolarissorokiniana)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)、大丽轮枝孢菌(verticilliumdahliae)、灰色大角间座壳菌(magnaporthegrisea)等引起植物病害的多种病原真菌都具有很好的拮抗作用(图2)。本发明中所述分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68可以在以几丁质为唯一碳源的培养基中生长，具有很强的产生几丁质酶活性的能力(图3)。本发明中所述分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌可以产生丰富的次级代谢产物，在培养基中添加20％的ms发酵上清液，可以明显抑制平脐蠕孢菌孢子的萌发及菌丝的生长(图4)。本发明中所述分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68的生防应用技术及方法如下：(1)以制备的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68农药制剂用于种子包被技术；(2)以防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68为材料的微生物农药；(3)以防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68为材料，以常见农业废弃物为固体发酵物料，可以获得孢子浓度为1×1010个/g的微生物农药；(4)以防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68为材料的微生物农药，有效成分包括微白黄链霉菌w68的活性孢子、该菌株产生的几丁质酶及该菌株产生的活性刺激代谢物质；(5)微生物农药用途可用于包衣、浸种、蘸根、穴施、沟施、基肥使用。本发明中所述分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68的生防应用效果如下：分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68对小麦根腐病(bipolarissorokiniana)的防控效果。在对小麦根腐病防治的盆栽试验中，采用种子包被的方法，使用防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68制剂提高了小麦种子在含有小麦根腐病菌的土壤中的出苗率，株高、植株干重均高于发病组对照，且基本可以达到小麦种子在无病原菌土壤中的生长水平(图5)。分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68对甜瓜枯萎病(fusariumoxysporum)的防控效果。通过种子包被和灌根处理，使用防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68农药制剂可显著克服由镰刀菌枯萎病所引起的作物连作障碍：在上年种过甜瓜的田间连续种植甜瓜，处理组的甜瓜苗成活率可以达到93％，空白对照组的苗成活率仅为13％(图6)。分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68对辣椒疫霉病(phytophthoracapsici)的防控效果。辣椒幼苗移栽时采用防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68农药制剂蘸根处理幼苗，可显著减轻辣椒疫霉病的发病程度。与对照组相比，蘸根处理过的植株生长周期延长约1-2周，干辣椒产量增加5％(图7)。分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68对小麦全蚀病(gaeumannomyces.graminis)的防控效果。深海防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68农药制剂的使用可以明显减少小麦抽穗期的病株率，降低病情指数。与化学药剂相比，防治土传真菌病的基因制剂的防效明显优于化学试剂三唑酮，与全蚀净的防效相当。可见防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68农药制剂可以完全替代化学药剂的使用(图8)。附图说明：图1是防治土传真菌病的微白黄链霉菌w68在pda培养基上的生长形态及扫描电镜观察图。图2是防治土传真菌病的微白黄链霉菌w68对多种植物病原菌的拮抗作用图。图3是防治土传真菌病的微白黄链霉菌w68的几丁质酶活性试验结果图图4是防治土传真菌病的微白黄链霉菌w68产生对植物病原真菌抑制活性的次级代谢产物试验结果图。图5是防治土传真菌病的微白黄链霉菌w68农药制剂防控小麦根腐病的盆栽试验结果图。图6是防治土传真菌病的微白黄链霉菌w68农药制剂防控甜瓜枯萎病的大田试验结果图。图7是防治土传真菌病的微白黄链霉菌w68农药制剂防控辣椒疫霉病的大田试验结果图。图8是防治土传真菌病的微白黄链霉菌w68农药制剂防控小麦全蚀病的大田试验结果图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。以下实施条例中，用到如下培养基：高氏一号筛选培养基：可溶性淀粉20g，kno31g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g，nacl0.5g，琼脂20g，自来水定容到1000ml，ph7.2～7.4。pda培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基，马铃薯200g煮沸30分钟后过滤取滤液，葡萄糖20g，琼脂15-20g，自来水定容到1000ml，自然ph；115℃高温灭菌。isp2培养基(酵母膏麦芽膏琼脂)：酵母膏10g，葡萄糖4g，麦芽膏10g，琼脂20g，自来水定容到1000ml，ph7.3。isp3培养基(燕麦粉琼脂)：燕麦粉20g浸液，迹量盐溶液1ml，琼脂20g，自来水定容到1000ml，ph7.2。isp4培养基(淀粉琼脂)：可溶性淀粉10g，mgco31g，k2hpo41g，nacl1g，nano31g，琼脂15g，自来水定容到1000ml，ph7.2～7.4。isp5培养基(甘油天门冬素琼脂)：l-天门冬素1g，k2hpo41g,迹量盐溶液1ml，甘油10g，琼脂20g，自来水定容到1000ml，ph7.0～7.4bennete培养基：葡萄糖10g，牛肉膏1g，琼脂15g，酵母膏1g，水解酪素2g，自来水定容到1000ml，ph7.3cazpek’s培养基(察氏)：蔗糖30g，nano32g,k2hpo41g,mgso4·7h2o0.5g，kcl0.5g，feso4·7h2o0.01g，琼脂20g，自来水定容到1000ml，ph7.2～7.4。glu+asp培养基(葡萄糖天门冬素琼脂)：葡萄糖10g，天门冬素0.5g，k2hpo40.5g，琼脂15g，自来水定容到1000ml，ph7.2～7.4。glu+asp+m培养基(葡萄糖天门冬素肉膏琼脂)：葡萄糖10g，天门冬素0.5g，牛肉膏2g，k2hpo40.5g，琼脂15g，自来水定容到1000ml，ph6.8。迹量盐溶液：feso4·7h2o0.1g，znso4·7h2o0.1g，mncl2·4h2o0.1g，蒸馏水定容至100ml。2×yt液体培养基：蛋白胨16g，酵母粉10g，nacl5g，自来水定容到1000ml，自然ph。ms培养基：甘露醇20g，黄豆粉20g，定容至1l几丁质降解菌筛选培养基：kh2po40.3g，k2hpo40.7g，feso4﹒2h2o0.01g，mgso4﹒7h2o0.5g，znso40.001g，agar20g，加水定容至1000ml，调整ph7.0；121℃灭菌30min；使用前加入80ml5％胶状几丁质，混匀后倒板，制成终浓度为0.4％的几丁质筛选培养基。实施例1防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68的分离、鉴定及生物学特性一、防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68的分离和纯化本实验从海洋活性污泥中分离得到了若干株放线菌，过程如下：1g样品加于灭菌的装有小玻璃珠和99ml无菌生理盐水的300ml三角瓶中，28℃摇床培养1h。取1ml悬液，采用梯度稀释的方法稀释到10-4，取原液、10-2稀释液和10-4稀释液分别涂布重铬酸钾终浓度为50ug/ml高氏一号培养基，分别于第5天、第7天和第10天挑取单菌落，再采用平板划线法于pda培养基上进行纯化和分离培养。利用20％甘油保存所得纯化菌株于-80℃。二、菌株的鉴定1、形态学鉴定分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68的形态鉴定，运用平板划线的方法在不同培养基接种培养后进行形态观察(表1)。2、分子鉴定pcr扩增16srdna采用通用引物27f和1492r(退火温度为56℃，靶序列约为1400bp，序列如下：27f:5’-agagtttgatcctggctcag-3’；1492r:5’-tacggctaccttacgactt-3’。pcr反应程序为：95℃5min；95℃30s，56℃90s，72℃60s(33cycles)；72℃10min；4℃。扩增序列进行纯化测序后，通过ncbi的blastn程序进行同源性比较，采用mega5软件运用neighbor-joining法建立系统发育树。三、基因的生物学特性使用biologgeniii微孔板对防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68进行94中表型测试，包括71种碳源利用测试和23种化学敏感性测试(表2、表3)。表2.防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68对71种不同碳源的利用情况备注：+表示可以利用，-表示不能利用表3.防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68对23种不同试剂的耐受性情况备注：+表示可以耐受，-表示不耐受实施例2分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68的抗真菌活性测试采用平板对峙法测定防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68的抗真菌活性：(1)、菌株培养及收集：利用划线法接种防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68于pda平板上，28℃培养5-7天至产生足量孢子；刮取孢子于适量无菌水中制成孢子悬液备用。(2)、病原菌的培养：接种黄瓜立枯病菌、甘蓝枯萎病菌、小麦根腐病菌、稻瘟病菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌于pda平板上，28℃培养一周后使用。(3)、平板对峙实验：分别接种病原菌培养物菌块于pda平板中央，在距离病原菌2.0cm左右接种防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68孢子悬液5ul，28℃培养3-5天，观察病原菌生长情况。实施例3分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68的几丁质酶活性测试(1)胶状几丁质的配置：称取10g几丁质样品，缓慢加入200ml浓盐酸(通风橱中操作)，一边加一边搅拌均匀。4度静置24小时后使用玻璃棉过滤至600ml预冷的50％乙醇中，继续4度静置24小时。接下来3000rpm离心20min*3次，水洗涤至中性ph，最后溶于200ml水中。制作成5％胶状几丁质，并用naoh调ph至中性，115度高温高压灭菌20min，4度避光保存。(2)几丁质酶活的测定：将已经在pda培养基上生长5-7天的w68菌株，挑取单菌落，接种至以几丁质为唯一碳源的0.4％的几丁质筛选培养皿上，28度培养5-7天，观察菌落周围透明圈的大小。(3)结果：将微白黄链霉菌w68接种至以几丁质为唯一碳源的培养基培养5天后，菌落周围出现明显的透明圈，表明该菌株可以产生几丁质酶，来降解利用培养基中的胶状几丁质(图3)。实施例4分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68的次级代谢产物抗真菌活性测试(1)挑取在pda培养基上生长5-7天的微白黄链霉菌w68单菌落于ms液体培养基中，28度，180rpm摇床培养，于32h、58h、79h、96h取样。(2)样品于12000rpm离心10min，留取上清液，按照20％的比例与pda培养基混合后倒平皿。(3)打孔器打取在pda培养基生长5天的平脐蠕孢菌菌块，接种于含微白黄链霉菌w68发酵液的平皿中央，28度培养箱培养，于3天观察菌株生长结果。(4)结果：微白黄链霉菌w68在ms液体培养基中可以产生丰富的对平脐蠕孢菌具有抑制活性的次级代谢产物，与空白对照相比，在含有微白黄链霉菌w68发酵液的培养基上，平脐蠕孢菌基本不生长，被完全抑制。该活性次级代谢物在32小时就已经产生，并可以稳定维持到96小时。表明微白黄链霉菌w68产生的活性次级代谢物对植物病原真菌抑制效果明显，且效果持久(图4)。实施例5分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68为材料的微生物农药的制备：(1)一级液体种子的制备挑取在pda平板上生长4-5天的微白黄链霉菌w68的单菌落，接种至2×yt液体培养基中，28-30℃，180rpm振荡培养1-2天后作为种子液使用。(2)二级液体种子的制备将一级液体种子按质量比1％接入装有二级种子发酵液(ms)的液体培养基中，28-30℃，180rpm振荡培养4天后作为二级种子液使用。(3)微生物农药的制备以农业废弃物畜禽粪便、食用菌菌渣、麸皮或豆粕等为基本原料，添加一定比例的mnso4、(nh)2so4，料水比1:1。按照30％的比例将二级液体种子接种固体发酵物料中。28-30℃培养3-5天，发酵培养结束后风干，孢子浓度可以达到1×1010个/g，作为链霉菌微生物农药使用。实施例6分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68对植物真菌病害的防控应用：一、分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68农药对小麦根腐病的防控(1)试验地点及环境条件：中国科学院微生物研究所室外自然环境，分别进行三次盆栽试验。(2)试验药剂：空白对照、防治土传真菌病的基因孢子悬液、70％甲托粉剂(3)试验方法：种子处理：取小麦种子若干，10％84消毒液处理5min后，无菌水冲洗2次，然后无菌水浸种4h；种子包被：取浸泡好的种子于培养皿中，分别使用1ml羧甲基纤维素钠溶液和1ml收集好的w68孢子悬液进行种子包被，混匀后28℃放置过夜；种子闷种：按照甲托的使用方法，对表面消毒过的小麦种子进行闷种6h处理。(4)处理排列：每个花盆种植10粒种子，每个处理做四个平行，随机排列，室外自然环境条件培养2-3周，观察生长情况。该实验重复三次。(5)统计数据：对植株的高度、地上部植株的湿重和干重、植物茎秆的直径进行记录，统计分析数据。(6)结果分析：在对小麦根腐病防治的盆栽试验中，采用种子包被的方法，使用防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68提高了小麦种子在含有小麦根腐病菌的土壤中的出苗率，株高、植株干重均高于发病组对照，且基本可以达到小麦种子在无病原菌土壤中的生长水平(图3)。二、分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68农药制剂对甜瓜枯萎病的大田试验。(1)试验地点及环境条件：该实验设在山西省忻州市东楼乡。试验田肥力中等，前茬作物为甜瓜。甜瓜播种，栽培、管理件均匀一致，符合当地的农业实践。(2)示范药剂：空白对照、防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68为材料的微生物农药、其它公司同类产品。(3)小区面积与处理排列：每个处理70m2，用地膜覆盖，每个处理种植2行甜瓜。(4)施药方法：试验进行，采用浸种处理法，甜瓜播种前用菌肥浸泡1小时，播种后将泡过种子的菌液罐于种穴中。(5)数据统计：进行拍照，清点死苗，统计试验结果。(6)结果分析：通过对甜瓜种子的浸种处理，使用防治土传真菌害的微白黄链霉菌w68为材料的微生物农药可显著克服由镰刀菌枯萎病所引起的甜瓜连作障碍：在上年种过甜瓜的田间连续种植甜瓜，处理组的甜瓜苗成活率可以达到93％，空白对照组的甜瓜苗成活率仅为13％(图4)。三、分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68农药制剂对辣椒疫霉病的大田试验。(1)试验地点及环境条件：该实验设在山西省忻州市高城村。前茬作物为辣椒，品种为北京红。辣椒育苗。(2)示范药剂：空白对照、微白黄链霉菌w68为材料的微生物农药、其他公司同类产品。(3)小区面积与处理排列：每个处理70m2，用地膜覆盖，每个处理种植2行辣椒。(4)施药方法：辣椒苗移栽时用菌肥蘸根处理2-3小时，移栽后将菌液灌于种穴中。(5)数据统计：进行拍照，进行产量统计。(6)结果分析：辣椒幼苗移栽时采用防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68为材料的微生物农药对幼苗进行蘸根处理，可显著减轻辣椒疫霉病的发病程度。与对照组相比，蘸根处理过的植株生长周期延长约1-2周，且干辣椒产量增加5％(图5)。四、分离自深海污泥的防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68农药制剂对小麦全蚀病的大田试验。(1)试验地点及环境条件：该试验设在河北省景县洚河流镇东李庄村。前茬作物为玉米，小麦常年单产每亩平均950斤左右。小麦播种，30斤/亩。每亩底施田丰牌小麦专用肥100斤，灌溉情况播种时为抢墒播种，播后浇冻水1次，浇返青水，亩施尿素60斤。用10％苯磺隆+56％甲四氯钠防治杂草，用25g/l高效氯氟氰菊酯防治小麦吸浆虫、蚜虫。(2)示范药剂：空白对照、防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68的农药制剂、另设化学药剂对照50％三唑酮wp和12.5％全蚀净fs。(3)小区面积与处理排列：每公斤小麦种子使用50g微生物农药制剂。(4)数据统计：调查出苗率，小麦拔节期和抽穗期各进行一次根系调查，采取对角线5点取样法，每点取20株，调查根系受侵染情况，按小麦全蚀病分级标准记录、统计病株率和病情指数。调查白穗，每点取1米双行，调查总穗数与白穗数，统计白穗率。进行测产调查，每个处理随机5点取样，调查1米双行总穗数，统计亩穗数，每点取有效穗数20穗，干后脱粒，统计穗粒数和千粒重，计算产量和增产效果。(5)结果分析：深海防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68为材料的微生物农药的使用可以明显减少小麦抽穗期的病株率，降低病情指数。与化学药剂相比，防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68为材料的微生农药的防效明显优于化学药剂三唑酮，与全蚀净的防效相当。可见以防治土传真菌病害的微白黄链霉菌w68为材料的微生物农药可以完全替代化学药剂的使用(图6)。当前第1页12