本发明属于生物工程技术和酿酒领域。涉及一株耐乳酸的产酯酵母。
背景技术：
：中国白酒的主要成分是乙醇和水(占总量的98％－99％)，而占总量1％-2％的微量成分(指溶于酒中的酯、酸、醇、醛等种类众多的微量有机化合物)作为白酒的呈香呈味物质，却决定着白酒的风格与品质。其中，微量成分中酯类物质具有芳香的风味物质，是形成酒体香气浓郁的主要因素。在各香型白酒国家标准中，总酯含量是划分白酒等级的重要指标，例如酱香型优级酒总酯含量应高于2.2g/l，浓香型优级酒总酯含量应高于2.0g/l。同时，不同酯类物质各自具有独特的香气特征，如乙酸乙酯香气较清纯优雅，丙酸乙酯果香舒适、乙酸苯乙酯具有玫瑰的甜香，酒中酯类物质的多样性，有助于提升其风味的丰富性与协调性。因此，如何提高白酒中酯类的含量及丰富白酒中酯类的多样性，是白酒生产者普遍关注的问题。酒中酯类物质主要是在酿造过程产酯酵母代谢生成，通过蒸馏取酒环节进入。而酿造环境为酸性环境，酒醅中含有大量的乳酸，一般不适合产酯酵母的生长繁殖，从而影响酯类物质的代谢生成。如专利《一种高耐受性产酯酵母菌株及其应用》(专利号：201310191489.0)中筛选获得了一株环境耐受性强且产乙酸乙酯能力强的酵母，但该专利并未阐述此酵母对酒醅中主要酸类物质——乳酸的耐受能力情况，同时该酵母菌主要代谢产物只是乙酸乙酯，产酯种类较少。因此选育适应性好、耐受性好，特别是耐受乳酸能力强、产酯丰富的酵母成为解决这一难题的关键因素。技术实现要素：针对上述提高酒中酯类种类与含量措施中存在的问题和缺陷，本发明的目的是选育出一种能够在实际酿造环境下，特别是在高乳酸浓度下能够代谢丰富的酯类物质的酵母菌。一方面，本发明提供了一株高耐受乳酸的产酯毕赤酵母。该毕赤酵母菌已于2017年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno：14068，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。分类命名为库德里阿兹威氏毕赤酵母(pichiakudriavzevii)1)菌株来源：本发明所获得的库德里阿兹威氏毕赤酵母(pichiakudriavzevii)，是从白酒酿造过程中分离得到，该毕赤酵母菌生长迅速，适应性好、耐受乳酸能力强、产酯种类丰富且产量高。2)形态特征：该毕赤酵母的菌落呈白色，表面粗糙，易挑取，菌落较大。利用显微镜观察该菌株的细胞形态，在15×40倍下该菌株细胞呈椭圆形，且有出芽，其繁殖方式为出芽。3)耐受性：所述的耐乳酸产酯酵母可在0％-15％(体积浓度)的乳酸浓度下生长繁殖，所述的耐乳酸产酯酵母的最高耐受温度为45摄氏度，最适宜生长温度为30℃；最高耐受乙醇浓度为10％(体积浓度)；最高耐受乙酸浓度为3％(体积浓度)。其可以在温度25℃-45℃、乙醇浓度0％-10％(体积浓度)，乙酸浓度0％-3％(体积浓度)条件下生长繁殖。4)菌株种子液的培养方法：所述的耐乳酸产酯酵母菌株种子液培养方法为：250ml的三角瓶中装入100ml液体培养基，121℃，灭菌15min，再从斜面上挑取一环该菌株于培养液中，28℃-40℃，静止培养2-4天即得。其中，所述种子液培养基的含有：乳酸10-30g/l，葡萄糖10-30g/l，蛋白胨15-30g/l，酵母膏5-15g/l，氯化钠0.5-1.5g/l，ph3.2±0.5，该ph为自然ph，无需通过酸碱调配)。5)产酯特性：该库德里阿兹威氏毕赤酵母(pichiakudriavzevii)在0％-12％乳酸环境下代谢产生乙酸乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸异戊酯和乳酸乙酯等多种乙酯类挥发性风味物质中的一种或多种。另一方面，本发明还提供了该毕赤酵母的代谢产物。所述的代谢产物为乙酯类挥发性风味物质。其中，所述的乙酯类挥发性风味物质包含乙酸乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸异戊酯和乳酸乙酯等多种风味物质。另一方面，本发明还提供了该毕赤酵母在酿酒中的应用。该毕赤酵母产生的乙酯类风味物质，可以提高白酒的风味和品质。另一方面，本发明还提供了毕赤酵母用于酿酒的方法，其特征在于，取下甑冷却后酒醅，加入糖化剂或大曲，再接入体积为酒醅质量1％-5％的毕赤酵母种子液，搅拌均匀后堆积于室内，保持室内环境温度为25℃-35℃之间，发酵3-5天后可提高酒醅中酯类物质含量。本发明的有益效果：本发明得到了一株耐受高浓度乳酸且产酯种类丰富的酵母菌，该菌可在0％-15％(体积浓度)的乳酸浓度下生长繁殖，并在0％-12％(体积浓度)乳酸环境下代谢产生乙酸乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯等多种乙酯类挥发性风味物质。附图说明图1为耐乳酸产酯酵母的菌株的菌落形态。具体实施方式下面结合附图和具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。需要说明的是，本发明中“接入体积为酒醅质量1％-5％的毕赤酵母种子液”，其中，毕赤酵母种子液的体积与酒醅质量的单位对应关系如ml/g，l/kg，或者依次类推。实施例1耐乳酸产酯毕赤酵母的筛选称取大曲或酒醅样品10g于90ml带玻璃珠无菌水中，充分振荡均匀，吸取0.1ml上清液到富集培养基液体中，30℃条件下静止培养2-4天，观察培养液是否浑浊，并进行闻香；若培养液已明显浑浊且闻香有愉悦的水果香气时，吸取0.1ml富集液于新的筛选培养基中再次进行培养，培养3-4次后将培养液梯度稀释于平板上，培养3～4天后，挑取单菌落进行发酵。发酵结束后，测定发酵液的风味物质，挑选产酯能力最高的菌株即为目标菌株。筛选培养基的组成为：乳酸20g/l，葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏10g/l，氯化钠1g/l，ph3.2(自然ph)。发酵培养基的组成为：乳酸40g/l，葡萄糖50g/l，蛋白胨2g/l，酵母膏1g/l，磷酸氢二钾1g/l，氯化钠1g/l，硫酸镁0.1g/l，硫酸锰0.05g/l，ph2.9(自然ph)。实施例2耐乳酸产酯毕赤酵母的鉴定对获得的高效降解乳酸的菌株进行菌落形态观察(图1)，发现该菌落呈白色，表面粗糙，易挑取，菌落较大。利用显微镜观察该菌株的细胞形态，在15×40倍下该菌株细胞呈椭圆形，且有出芽，可初步确定为酵母菌。利用酵母特异分类鉴定引物扩增菌株的26srdna片段，并将扩增产物连接到pmd18-t载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，提取质粒进行测序与比对，确定所筛得酵母的种属，其分类命名为：库德里阿兹威氏毕赤酵母(pichiakudriavzevii)。已于2017年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno：14068。实施例3不同耐受条件下菌株生长能力酿造环境对微生物的生长及代谢有着十分重要的影响。而在白酒酿造过程由于发酵温度、乙醇浓度、基质酸度等不断变化，造成微生物所处环境也时刻发生变化，因此研究了该酵母菌株在不同发酵温度、乙醇浓度、乙酸浓度、乳酸浓度条件下的生长情况。温度耐受性实验：将活化后的毕赤酵母菌2％(毕赤酵母种子液的体积/ypd液体培养基的体积)种子液接种到装有100mlypd液体培养基的三角瓶中，分别放置在25℃、30℃、37℃、42℃、45℃下条件下静止培养4天后，测定600nm波长下的od值，浓度大的菌液可以作适当稀释，经稀释后测得的od值乘以稀释倍数，即为培养液实际的od值。从表1中可以看出，该毕赤酵母菌在42℃下仍有较高生长量，在45℃下菌株生长微弱。因此该菌株的最高耐受温度为45℃，最适生长温度30℃。表1不同温度下毕赤酵母生长情况温度25℃30℃37℃42℃45℃47℃od值32.634.733.816.20.260.06乙醇耐受性实验：ypd液体培养基灭菌后，分别加入不同体积的无水乙醇，使ypd液体培养基中乙醇的浓度为0％、2％、4％、6％、8％、10％(体积浓度)的无水乙醇，然后将2％(毕赤酵母种子液的体积/ypd液体培养基的体积)种子液接入，30℃条件下静止培养4天后，测定600nm波长下的od值，浓度大的菌液可以作适当稀释，经稀释后测得的od值乘以稀释倍数，即为培养液实际的od值。从表2中可以看出，在一定范围内，随着乙醇浓度的升高，菌株生长旺盛；但当乙醇浓度进一步上升时，该毕赤酵母菌受到明显抑制。表2不同乙醇浓度下毕赤酵母生长情况乙醇浓度0％2％4％6％8％10％od值34.745.649.848.733.910.1乙酸耐受性实验：ypd液体培养基灭菌后，分别加入不同体积的乙酸，使ypd液体培养基中乙酸的浓度为0％、0.5％、1％、2％、3％、4％(体积浓度)的乙酸，然后将2％(毕赤酵母种子液的体积/ypd液体培养基的体积)种子液接入，30℃条件下静止培养4天后，测定600nm波长下的od值，浓度大的菌液可以作适当稀释，经稀释后测得的od值乘以稀释倍数，即为培养液实际的od值。从表3中可以看出，当乙酸浓度为0.5％时菌株生长od值最高，但当乙酸为2％时菌株受到明显抑制，而在4％乙酸浓度下几乎停止生长，因此菌株最高耐受3％乙酸。表3不同乙酸浓度下毕赤酵母生长情况乙酸浓度0％0.5％1％2％3％4％od值34.735.417.247.630.850.17乳酸耐受性实验：ypd液体培养基灭菌后，分别加入不同体积的乳酸，使ypd液体培养基中乳酸的浓度为0％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、15％(体积浓度)的乳酸，然后将2％(毕赤酵母种子液的体积/ypd液体培养基的体积)种子液接入，30℃条件下静止培养4天后，测定600nm波长下的od值，浓度大的菌液可以作适当稀释，经稀释后测得的od值乘以稀释倍数，即为培养液实际的od值。从表4中可以看出，当乳酸浓度为12％时菌株生长抑制严重，而乳酸达到15％，菌株od值只有0.5，因此菌株最高乳酸耐受浓度为15％。表4不同乳酸浓度下毕赤酵母生长情况乳酸浓度0％2％4％6％8％10％12％15％od值34.734.836.330.721.315.53.20.5实施例4不同乳酸浓度条件下菌株产酯能力在含有5％葡萄糖的ypd液体培养基中，分别加入不同体积的乳酸，使ypd液体培养基中乳酸的浓度为0％、2％、4％、8％、10％、12％、15％(体积浓度)的乳酸，然后将2％(毕赤酵母种子液的体积/ypd液体培养基的体积)种子液接入，30℃条件下静止培养4天后，测定发酵液中酯类物质的种类与含量。从表5中发现，该毕赤酵母菌株在乳酸浓度为4％时产酯能力最强，在乳酸浓度为15％时产酯能力受到严重抑制，表明该菌株可在0％-12％乳酸浓度下进行产酯，但不同酯类物质在不同乳酸浓度下产量差异大，如乙酸乙酯在为4％乳酸浓度时产量最高，丙酸乙酯在8％乳酸浓度时产量最高，而辛酸乙酯在0％乳酸浓度时产量最高。表5不同乳酸浓度下毕赤酵母产酯能力(×106峰面积)实施例5固态发酵产酯能力以蒸馏下甑后的酒醅(测得乳酸含量为2.43％)为基质，加入0.5％(糖化酶的质量/酒醅质量)的糖化酶，再接入2％(毕赤酵母种子液的体积/酒醅质量)的毕赤酵母种子液，搅拌均匀，30℃，静止培养4天，以加入0.5％的糖化酶但不接菌液的酒醅为空白对照。培养结束后，测定酒醅中酯类物质含量，结果见表6。从表6中可以看出，当在酒醅中接入毕赤酵母后，酒醅中酯类含量都得到了不同幅度提升，其中乙酸乙酯含量最高，其次为乙酸苯乙酯。表6固态发酵条件下产酯能力(×106峰面积)在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的进一步限定，本领域技术人员在此基础上，作出的非突出实质性特征和非显著进步的改进，仍然属于本发明的保护范畴。当前第1页12