一种细胞培养计数装置的制作方法

本发明涉及细胞培养技术领域，更进一步涉及一种细胞培养计数装置。

背景技术：

细胞培养是二十世纪初创立的一种研究动物细胞行为的方法，从体内组织取出细胞，模拟体内生长环境，在适当温度、酸碱度、无菌和一种的营养条件下使细胞生长繁殖，维持其结构和功能。细胞制备是运用细胞培养方案制作出高纯度的细胞终制品，用于科研和临床领域的过程。

细胞计数是指当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞数目，计算出细胞悬液中的细胞总数。细胞计数在细胞制备进程中是反映细胞生长增殖状况的最直接指标，是绘制细胞生长曲线必不可少的环节。细胞计数在临床研究中可用于疾病类型的确诊，是疾病鉴别诊断的依据，还能够揭示疾病的严重性或检测治疗的结果。

目前常用的细胞计数方法为显微镜观察手工计数法和自动细胞计数分析仪计数法。显微镜观察手工计数法使用血球计数板在显微镜下进行手动计数，手工计数浪费研究者大量时间，繁冗无聊的计数过程往往让人头晕眼花，影响了研究者的积极性；手工计数的主观性强，计数结果往往不准；不同操作者的计数结果一致性差，可重复性差。自动细胞计数分析仪计数法将采集的细胞样本使用细胞计数分析设备进行计数，自动细胞计数分析仪排除了操作者的主观性，结果更加准确客观，操作快速简便，节省了大量时间。

无论使用显微镜观察手工计数还是自动化细胞计数分析仪自动计数，都必须有经验的专业技术人员操作完成，细胞计数过程分为两步，采集细胞进行计数操作与细胞的培养是独立的过程，难以保证样本的均一性，采集样本后的计数过程具有时间差，不能避免在采集、运输、计数过程出现差错或被污染的风险，不能及时反映出细胞的真实生长增殖状况。对于某些珍贵的细胞种类，计数时存在污染的风险，计数完成后很难回收，只能遗弃，造成损失与浪费。计数结果需要大量的人工干预，带来污染风险的同时，计数结果还受到质量检测技术人员技术经验的积累和人为主观因素的影响。

技术实现要素：

本发明提供一种细胞培养计数装置，在无菌环境下对细胞检测计数，不与外界接触，从而防止污染，计数的精度较高，具体方案如下：

一种细胞培养计数装置，包括用于培养细胞的培养罐，所述培养罐通过蠕动泵连通于计数池，所述计数池包括连接于管路上的两片透明盖板，两片透明盖板的间隙仅容一层细胞通过；还包括用于拍摄所述计数池中细胞数量的数码显微镜，所述数码显微镜通过机械臂支撑，并将数据传输至中央数据处理器作图像处理计数分析，得到所述培养罐中的细胞总数。

可选地，所述机械臂上沿长度方向设置伸缩装置，所述数码显微镜设置在所述伸缩装置上，所述伸缩装置带动所述数码显微镜平移。

可选地，还包括用于支撑限位的支座，所述支座的壳体内设置至少两组包含所述培养罐和所述蠕动泵的培养系统，每组所述培养系统的管路上独立设置所述计数池；所述支座上设置动力装置，所述动力装置带动所述机械臂及所述数码显微镜运动，以分别检测各组所述培养系统中的所述计数池。

可选地，所述动力装置为设置于所述支座中央的行星电机，多组所述培养系统以所述行星电机为中心、呈周向均匀地环绕所述行星电机设置；所述行星电机的转动部连接所述机械臂，带动所述机械臂和所述数码显微镜周向转动。

可选地，多组所述培养系统共用一套中央数据处理器；每组所述培养系统设置控制分系统。

可选地，所述计数池的透明盖板上划分尺寸相等的矩形计数格，两透明盖板的间距为0.1mm。

可选地，所述中央数据处理器根据细胞总数，控制所述蠕动泵将原料袋中的营养液泵送至所述培养罐。

可选地，所述培养系统还包括设置于所述培养罐出口处的颜色传感器；设置于所述原料袋出口处的气泡传感器；设置于所述蠕动泵处的压力传感器。

可选地，还包括设置于所述原料袋和目标袋之间的磁分选装置；所述目标袋的管路上并联设置废料袋。

本发明提供一种细胞培养计数装置，包括用于培养细胞的培养罐，为细胞提供生长增殖所需环境，培养罐通过蠕动泵连通于计数池，蠕动泵是动力装置，通过挤压管路的方式带动管内液体流动，与管路中的液体不发生直接接触，保证了密封的无菌环境。计数池包括连接于管路上的两片透明盖板，两片透明盖板的间隙仅容一层细胞通过，因此视野内的细胞数量即为所含全部的细胞数；通过数码显微镜拍摄计数池，数码显微镜通过机械臂支撑，并将数据传输至中央数据处理器作图像处理计数分析。根据拍摄的图像信息自动得到样本中的细胞数，并经过一系列换算得到培养罐中的细胞总数。

本申请的细胞计数方式不需要人为观察计数，降低劳动强度，结合图像处理分析技术得到的结果更为准确可靠；用于检测的细胞样本直接从培养罐中取出，不与外界接触，在检测完成后还可反向送回到培养罐内继续培养，避免浪费。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请细胞培养计数装置的一种管路结构图；

图2为显微拍照控制平台的结构示意图；

图3为本申请的细胞培养计数装置的实体装置结构图；

图4为细胞的一种生长曲线；

图5为细胞制备过程的质量监控点。

其中包括：

培养罐1、蠕动泵2、计数池3、数码显微镜4、机械臂5、伸缩装置6、行星电机7、支座8、原料袋91、颜色传感器92、气泡传感器93、目标袋94、磁分选装置95、废料袋96、压力传感器97。

具体实施方式

本发明的核心在于提供一种细胞培养计数装置，在无菌环境下对细胞检测计数，不与外界接触，从而防止污染，计数的精度较高。

使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图及具体的实施方式，对本申请的细胞培养计数装置进行详细的介绍说明。

如图1所示，为本申请细胞培养计数装置的一种管路结构图，该计数装置包括用于培养细胞的培养罐1，培养罐1为细胞提供生长系列的合适环境，包括适当的营养条件、温度及气体供应等；培养罐1通过蠕动泵2连通于计数池3，培养罐1和计数池3之间通过密封的管路连通，在两者之间设置管压阀控制管路开闭，并控制蠕动泵2的转向以改变液体的流动方向；管压阀通过挤压管路的方式为液体提供动力，可控制液体流量在2～600ml/min之间，保证内部液体不与外界接触，维持无菌的环境。

计数池3用于细胞计数，主要包括连接于管路上的两片透明盖板，两片透明盖板之间保持密封，设有一薄片状的通道，此间隙仅容一层细胞通过，通道的两端分别与管路保持密封连接，从视野内观察到的细胞数量不存在重叠阻挡的问题，观察到的细胞数量即为此样本所含的细胞数；还包括用于拍摄计数池3中细胞数量的数码显微镜4，数码显微镜4通过机械臂5支撑，使数码显微镜4靠近计数池3，将拍摄的图像数据传输至中央数据处理器作图像处理计数分析，利用计算机的图像分析技术，对拍摄图像进行处理，得到样本中的细胞数；根据样本的体积以及稀释倍数等参数作计算，最终得到培养罐1中的细胞总数。

图像测量分析技术是一项针对图像中目标或区域的特征进行测量和分析的技术，广泛应用在工业、检测、遥感、计算机、军事、生物医学等领域。本申请通过运用自动化细胞显微图像采集技术，实时获取体外细胞制备全流程的细胞图像信息(包括细胞形态、灰度、密度、荧光染色情况等)，采用图像测量分析技术方法，对细胞显微图像进行运算和智能化处理，实现对图像中细胞信息进行测量、对比分析和统计，从而建立精确、高效的细胞体外制备过程的质量检测与评价体系。

整个计数过程不需要人工操作，由中央数据处理器控制培养罐1、蠕动泵2及管路上管压阀的状态，自动进行取样检测，数码显微镜4的拍摄也由中央数据处理器发送控制指令，最终的图像信号由中央数据处理器作分析处理，可避免人工的繁琐操作，具有较高的准确度，提高细胞制备质量检测方法细胞计数的客观性、时效性，使计数检测更加真实，方便、全面、系统、科学。

由于管压阀和蠕动泵2均不与管路内部的液体接触，因此可以避免内部的液体受污染，在计数操作完成后可通过蠕动泵2反向转动重新送回培养罐1中。

如图2所示，为显微拍照控制平台的结构示意图，机械臂5呈横向延伸的长条形结构，其上沿机械臂5的长度方向设置伸缩装置6，数码显微镜4设置在伸缩装置6上，伸缩装置6可带动数码显微镜4沿机械臂5的长度方向作往复平移运动，以调整到与计数池3对应的合适的位置。具体地，伸缩装置6可为数控丝杆，由中央数据处理器控制，丝杆的调节方式可精确地调节数码显微镜4对应的位置。除了此结构之外，伸缩装置6还可采用其他的设置方式，这个具体的方案都应包含在本申请的保护范围之内。

如图3所示，为本申请的细胞培养计数装置的实体装置结构图，还包括用于支撑限位的支座8，支座8用于提供限位支撑，是整个装置的外壳结构。支座8的壳体内设置至少两组包含培养罐1和蠕动泵2的培养系统，图3所示的结构包含六组培养系统，各组培养系统的管路相互独立，以分别进行控制，可同时完成多组不同的细胞培养过程，每组培养系统的管路上独立设置计数池3，每组培养系统的计数池3均独立地密封连接在各自的管路上。由于设置多组培养系统，多组培养系统可由同一个数码显微镜4拍摄检测，因此在支座8上设置动力装置，动力装置带动机械臂5及数码显微镜4运动，可分别运动到各组计数池3所在的位置，以分别检测各组培养系统中的计数池3，简化整体的结构。动力装置的运动轨道按各计数池3所处的位置设定，若计数池3一字排列则带动机械臂5及数码显微镜4往复平移。

图3实施例所提供的培养系统为环绕排列，动力装置为设置于支座8中央的行星电机7，多组培养系统以行星电机7为中心、呈周向均匀地环绕行星电机7设置；行星电机7的转动部连接机械臂5，两者相互固定连接，带动机械臂5和数码显微镜4周向转动，可分别停止在各组培养系统的计数池3处，以数码显微镜4在伸缩装置6上的运动极限为半径，数码显微镜4能够覆盖一个环状的区域。

多组培养系统共用一套中央数据处理器，为图3中的a；每组培养系统设置控制分系统，为图3所示的b。中央数据处理器通过总控线向各控制分系统发送控制信号，再经控制分系统控制各装置的运动及操作，控制分系统将图像信号传递至中央数据处理器作相应分析处理。各控制分系统独立工作，当需要进行图像识别采集时，控制分系统发送请求指令到中央数据处理器，以申请图像采集系统的资源，同时暂停自己的工作，等待中央数据处理器回复图像采集识别结果。当多个工位中均需要图像采集操作时，中央数据处理器根据请求的先后次序，依次旋转图像采集平台至相应的工位。

具体地，本申请中计数池3的透明盖板上划分尺寸相等的矩形计数格，两透明盖板的间距为0.1mm。计数完成后，需换算出每毫升悬液中的细胞数。以血细胞计数板为例，计数板中每一方格的面积为0.01cm²，高为0.01cm，这样它的体积为0.0001cm³，即0.1mm³。由于1ml＝1000mm³，所以每一大方格内细胞数×10000＝细胞数/ml，也即每毫升的细胞数，计数区体积换算比为10000，

计算式为：

细胞悬液细胞数/ml＝数次计数平均值×计数区体积换算比×稀释倍数；

细胞总数(个)＝细胞悬液细胞数/ml×细胞悬液体积(ml)；

所需给料体积(ml)＝细胞总数(个)÷细胞最适生长密度(个/ml)。

在上述任一技术方案及其相互组合的基础上，本申请的中央数据处理器根据计数检测结果得到细胞总数，同时通过细胞种类的不同，控制蠕动泵2将原料袋91中的营养液泵送至培养罐1，为细胞生长繁殖提供合适的营养供给。

培养系统还包括设置于培养罐1出口处的颜色传感器92，可以判断培养罐1中输出的细胞种类，培养罐1可作高速旋转，不同种类的细胞在离心力作用下处于不同层次，培养罐1的顶部为圆锥形，锥顶设置出口，转动出料时最内层的液体先排出，越靠外的液体越晚排出，根据颜色传感器92判断细胞种类，如红细胞为红色，白细胞为白色，血浆为黄色，盐水和分离液为透明色；培养系统还包括设置于原料袋91出口处的气泡传感器93，用于判定管路中流动的是液体还是空气。蠕动泵2处设置压力传感器97，在蠕动泵2运转时根据管路内液体压力变化判断各管压阀是否开启正确。

培养系统还包括设置于原料袋91和目标袋94之间的磁分选装置95，磁分选装置95通过电磁感应的方式产生磁场，对于某些具有磁性的细胞，可以被磁化的磁分选装置95吸附，使其他细胞通过，当洁净无其他细胞后解除磁场，将带有磁性的细胞单独收集；目标袋94的管路上并联设置废料袋96，可以盛放从培养罐1中排出的废料。

如图4所示，为细胞的一种生长曲线，绘制细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期，在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期、斜率较大的指数生长期、呈平台状的平顶期及退化衰亡四个部分。以存活细胞数(万/ml)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。

本申请在检测时运用过程检验的方法，在细胞制备全过程中设置多个质量监控点，如图5所示，为细胞制备过程的质量监控点，根据时间的不同，每一个质量监控点都设置在细胞制备培养过程的关键操作步骤，第一时间采集少量质量监控点的样本进行计数，确保细胞制备的整个过程都是处于实时的质量监控下进行，确保细胞样本采集的均一性和计数的准确性；细胞样本采集后通过密闭管路输送到检测功能部件第一时间完成，结果出来后及时反馈以调整细胞制备的下一步操作；某些比较珍贵的细胞种类的细胞计数完后可以立即回收，避免损失和浪费；不影响细胞制备培养过程的其他操作，避免了样本需要取出来计数的污染风险；大大降低了人工干预操作，实现细胞制备过程细胞计数的自动标准化操作。

设置的每一个质量监控点都是细胞制备技术工艺流程最关键的环节，只有将这几个环节的质控做好，才能生产出高质量标准的细胞制品，所以这些质量监控点既是对前面操作步骤的总结，还对下一步操作步骤的调整具有指导性意义。而细胞计数是细胞质量控制标准最基础最直观的体现，通过获得细胞数量数据，按照细胞最适生长密度来计算添加细胞培养液的体积，这样既能满足细胞生长所需的营养物质的供给，也能避免浪费细胞培养液。最重要的是能够保证传代过程中每一次的接种密度都是最适合细胞生长增殖的，因为接种密度过高或过低都不利于细胞的生长增殖。

每到达一个质量监控点，由中央数据处理器和控制分系统发出指令，培养罐1旋转将待检样品充分混匀后，通过蠕动泵2采集一定量的细胞，并送至计数池3。由于计数池3的缝隙很小，只允许单层细胞通过，通过读取计数池固定视野中的细胞个数，便可计算培养罐中的细胞总量，通过将拍摄的细胞高清显微照片进行图像处理和分析比对，在互联网云端技术下对检测数据远程实时传输、分析、存储，运用数据库、专家系统实时出具检测报告并存档，检测结果反馈到中央数据处理器，从而指导和调整细胞制备的下一步动作。具体工作过程如下：

a、培养罐旋转将待检样品充分混匀；

b、开启计数池管路对应的管压阀，蠕动泵转动采集混匀好的细胞样品，并送至计数池管路；

c、控制机械臂指向需要检测的工位，伸出数控丝杆，让数码显微镜停留在计数池下；

d、由中央数据处理器发送拍照指令，让数码显微镜拍取当前计数池的细胞显微照片；通过图像分析处理，获得细胞数量数据，创建样品专属文件夹电子档案并保存；

e、检测结果反馈到中央数据处理器，指导和调整细胞制备的下一步动作；

f、检测完毕，将计数池中的细胞样品转移到废料袋，并控制蠕动泵和管压阀，对计数池管路进行清洗，避免影响下次检测结果；

g、细胞样品如果比较珍贵，也可以进行回收继续培养，将计数池中检测完毕的细胞样品通过蠕动泵和管压阀作用进行回收。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理，可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。