一株高耐铜、高耐铁的嗜铁钩端螺旋菌BYL及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及一株高耐铜、高耐铁的嗜铁钩端螺旋菌byl(leptospirillumferriphiliumbyl)及其在硫化矿浸矿和硫化氢脱除中的应用。该菌现已于2015年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，电话：(027)68754052，传真：(027)68754833，e-mail：cctcc@whu.edu.cn，其保藏号为cctccno：m2015242。

背景技术：

生物浸矿是一种用低品位矿和难溶矿回收金属的技术，该技术环境污染小，能耗低。在此过程中，最重要的就是高效的微生物浸矿菌株。氧化亚铁硫杆菌和嗜铁钩端螺旋菌是目前认为最具有潜力的微生物菌株，能够将二价铁离子氧化为高价铁离子，耐低ph，常温下能够生长。但是，随着浸出的进行，浸出液中金属离子浓度逐渐升高，而高浓度的金属离子对微生物的生长具有很强的抑制作用，从而影响金属的浸出。

在中国专利cn201410373597中公开了一株耐镍离子的嗜铁钩端螺旋菌，该菌株能够在高浓度的镍离子溶液中生长，但是该菌没有表现出对高浓度铁离子和铜离子的耐受性。在中国专利cn200510127741中公开了一株耐氟离子的嗜铁钩端螺旋菌，该菌株能够在1.2-1.4g/l氟离子浓度的环境中正常生长，但是该菌也未表现出对高浓度铜离子和铁离子的耐受。

国际上适合生物浸矿技术应用的大型金属硫化矿多为多种金属复合矿藏，往往伴生高浓度的铁离子、铜离子等，因此，筛选出能够在高浓度的铜离子和铁离子环境中生长嗜铁钩端螺旋菌byl对于生物浸矿以及硫化氢的微生物脱除具有重要意义。

本发明公开了的嗜铁钩端螺旋菌byl(leptospirillumferriphiliumbyl)，具有高浓度铁离子的耐受和氧化性质以及高浓度铜离子的耐受性，可以广泛的应用于硫化矿浸矿和硫化氢脱除过程。

技术实现要素：

本发明涉及一株高耐铜、高耐铁的嗜铁钩端螺旋菌byl(leptospirillumferriphiliumbyl)及其在硫化矿浸矿和硫化氢脱除中的应用。该菌现已于2015年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctccno：m2015242，名称为嗜铁钩端螺旋菌byl(leptospirillumferriphiliumbyl)。

本发明是针对目前铁氧化微生物的局限性，并根据微生物浸矿和脱硫中的实际生产需求从生长在高浓度铜离子和铁离子的环境中分离铁氧化微生物。本发明分离到一株高耐铜、高耐铁的嗜铁钩端螺旋菌byl(leptospirillumferriphiliumbyl),能够广泛应用于硫化矿浸矿与硫化氢脱除等工业中。

上述嗜铁钩端螺旋菌byl(leptospirillumferriphiliumbyl)分离自高浓度铜离子和高浓度铁离子的废弃矿山废水池中，并采用高浓度铜离子和高浓度铁离子进行富集。分离纯化嗜铁钩端螺旋菌采用的方法为ph梯度分离与稀释分离。

本发明所分离得到的嗜铁钩端螺旋菌byl(leptospirillumferriphiliumbyl)最适ph为1.4，可以在ph1.0-3.0的范围中生长。

本发明所述的嗜铁钩端螺旋菌byl(leptospirillumferriphiliumbyl)，其最适生长温度为35-40℃，在45℃仍然具有60％的氧化活性。

本发明所述的嗜铁钩端螺旋菌byl(leptospirillumferriphiliumbyl)，能够在10g/l的铜离子环境下正常生长，其铁氧化速率不受影响。

本发明所述的嗜铁钩端螺旋菌byl(leptospirillumferriphiliumbyl)，能够快速氧化40g/l的二价铁离子，在100g/l的二价铁离子环境中能够存活，保持40％的铁氧化能力。

本发明公开了的嗜铁钩端螺旋菌byl(leptospirillumferriphiliumbyl)，具有高浓度铁离子的耐受和氧化性质以及高浓度铜离子的耐受性，可以广泛的应用于硫化矿浸矿和硫化氢脱除过程。

附图说明

图1分离菌株的扫描电镜图

图2菌株的最适ph，ior：铁离子氧化速率

图3菌株的最适温度

图4菌株的铁离子耐受浓度和铁氧化速率，ior：铁离子氧化速率

图5菌株的铜离子耐受浓度，●：ior；○：cfu。

具体实施方式

实施例1本发明菌株的分离和鉴定

(1)取来自白银深部铜矿矿坑水的水样1ml，接种至含有20g/lfeso4·7h2o，ph2.5-2.8的9k培养基中，30℃富集培养5d。将上述富集培养得到的菌液接种至含有60g/lfeso4·7h2o，ph2.5-2.8的9k培养基中，在40℃培养，ph1.8，时间3d传代一次，获得含有钩端螺旋菌的菌液。再将上述菌液转至ph1.6的含有60g/lfeso4·7h2o，28g/l硫酸铁，ph2.5-2.8的9k传代培养基中培养3天，梯度稀释传代3次(传代梯度为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8)，再将最后生长的菌转至ph0.8的9k传代培养基中，稀释传代1次，再转至ph1.4的9k传代培养基中，稀释传代1次。镜检得到钩端螺旋菌后再转至ph1.0的9k传代培养基中，稀释传代1次，去除氧化亚铁硫杆菌(氧化亚铁硫杆菌生长的ph大于1.40)。镜检得到钩端螺旋菌后再转至ph1.6的9k传代培养基中，稀释传代1次，去除低ph生长菌(生长的ph小于1.20)、铁质菌等。镜检得到钩端螺旋菌后再将其转至ph1.2的9k传代培养基中，稀释传代1次，去除氧化亚铁硫杆菌。再转至ph1.3的培养基1中，稀释传代1次,同时去除低ph菌和氧化亚铁硫杆菌等高ph菌。镜检得到钩端螺旋菌后，再转至ph1.4的培养基2中，稀释传代三次后，进行鉴定。

(2)富集分离培养基

培养基1：nh4so43g/l，mgso4·7h2o0.5g/l,无水k2hpo40.5g/l,kcl0.1g/l,ca(no3)20.01g/l,al2so40.5g/l,feso4·7h2o60g/l,fe2(so4)312g/l,1000mlh2o,用浓h2so4调节ph值至1.3；

培养基2：nh4so43g/l，mgso4·7h2o0.5g/l,无水k2hpo40.5g/l,kcl0.1g/l,ca(no3)20.01g/l,al2so40.5g/l,feso4·7h2o60g/l,fe2(so4)330g/l,1000mlh2o,用浓h2so4调节ph值至1.3

(3)16srdna的pcr扩增与测序

取培养基2下生长的对数期菌液，9000rpm离心获得菌体，提取细菌dna，以16s通用引物(27f：5’-cagagtttgatcgtggctcag-3’；1506f：5’-cgggtaccttgttacgactt-3’)pcr扩增，切胶回收，将回收得到的pcr扩增片段测序，测序得到的结果在ncbi中的genbank数据库比对，与嗜铁钩端螺旋菌的相似度达99％，鉴定属于嗜铁钩端螺旋菌属。该菌现已于2015年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctccno：m2015242，名称为嗜铁钩端螺旋菌byl(leptospirillumferriphiliumbyl)。

实施例2本发明菌株的生长特性

(1)以培养基2为菌生长培养基，在250ml三角瓶中加入50ml培养基，嗜铁钩端螺旋菌byl的接种量为10％，调ph为1.0、1.2、1.4、1.6、1.8，2.0；180rpm，40℃培养36h，重铬酸钾滴定法测定铁氧化速率。铁氧化速率ior(铁氧化速率)如图2所示，最适ph为1.4。

(2)以培养基2为菌生长培养基，在250ml三角瓶中加入50ml培养基，嗜铁钩端螺旋菌byl的接种量为10％，调ph1.4，在温度为30℃、35℃、40℃、45℃下培养，测定其铁氧化速率。结果如图3所示，该菌的最适生长温度范围为35-40℃，在45℃具有氧化能力。

实施例3本发明菌株对高浓度铁离子的氧化与耐受性

将培养基2中的硫酸亚铁浓度改变为如下梯度(g/l)：10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400，ph值调节至1.3，取10ml各浓度梯度的培养基按接种量10％(v/v)接种嗜铁钩端螺旋菌byl，40℃振荡培养，氧化36h后测定培养物中二价铁离子浓度。得到如图4所示的结果，在硫酸亚铁浓度范围为10-220g/l的培养基中生长时，随着铁离子浓度的升高铁氧化效率也随之升高；在硫酸亚铁浓度范围为240-320g/l的培养基中生长时，随着铁离子浓度的升高，铁氧化效率有明显的降低，在硫酸亚铁浓度达到340g/l后，铁氧化效率不再随着铁离子浓度的升高而降低，而是达到一个恒定值，为0.20g/l·h

实施例4本发明菌株对高浓度铜离子的氧化与耐受性

在培养基2中按1g/l，2g/l，3g/l，4g/l，5g/l，6g/l，7g/l，8g/l，9g/l，10g/l的浓度加入硫酸铜，培养基ph值调节到1.3，取10ml这样的培养基接种1ml的菌液，40℃振荡培养；氧化36h后测定培养物种的二价铁离子浓度，取少量样品通过显微技术法计数。其结果如图5所示，10g/l铜离子对菌的生长没有影响。

实验结果证明，本发明公开的嗜铁钩端螺旋菌byl(leptospirillumferriphiliumbyl)，具有高浓度铁离子的耐受和氧化性质以及高浓度铜离子的耐受性，可以广泛的在微生物浸矿和硫化氢脱除过程中应用。