一种产木聚糖酶的菌株及其应用的制作方法

文档序号：11505697阅读：699来源：国知局

本发明涉及生物酶，特别是一种产木聚糖酶的菌株及其应用。

背景技术：

木聚糖酶（1,4-β-d-xylanase:ec3.2.1.8）是一种重要的工业用酶，在分解木聚糖时起生物催化作用，可以将木聚糖分解成多糖或单糖的蛋白质或rna。木聚糖酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生木聚糖酶。

木聚糖酶包括内切1.3-β-木聚糖酶（ec3.2.1.32），内切1.4-β-木聚糖酶（ec3.2.1.8），木聚糖1.3-β-木糖苷酶（ec3.2.1.72），木聚糖1.4-β-木糖苷酶（ec3.2.1.37）和乙酰木聚糖酯酶（ec3.1.1.6）五种。内切型木聚糖酶水解木聚糖生成木寡糖和木糖，外切型木聚糖酶水解木寡糖，由非还原末端切除木糖残基。木聚糖酶(1,4-β-d-xylanase；ec3.2.1.8)是一种重要的工业用酶，在造纸工业、食品、饲料和能源等领域中具有重要的应用价值。木聚糖酶在造纸工业上可作为纸浆漂白助剂，可以提高纸张的白度和强度，减少传统氯化物漂白剂的实用；在动物饲料中添加木聚糖酶，可以降解木聚糖，提高动物对饲料的利用率；在食品工业上，木聚糖酶还可以用于澄清果汁饮料，改良面包松软度。利用木聚糖酶降解木聚糖还可以得到低聚木糖，低聚木糖可以促进人体大肠中益生菌的增殖，改善肠道功能。自然界中，不同来源的木聚糖酶的酶活特性有很大的差异，有着各自特异的最适反应ph和最适作用温度。但是，多数木聚糖酶最适反应ph值在4.0～6.0，较窄的最适反应ph限制了木聚糖酶在工业上的应用。

技术实现要素：

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种产木聚糖酶的菌株及其应用，可有效解决木聚糖酶的生产，以满足工业上的需要问题。

本发明解决的技术方案是，一种产木聚糖酶的菌株分类命名为橘绿木霉（trichodermacitrinoviride）hl28-5，保藏号：cgmccno.11861，保藏日期：2015年12月11日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；该菌株有效应用于生产木聚糖酶，其应用方法包括以下步骤：

（1）、制备木聚糖酶的发酵液：

将产木聚糖酶的菌株接种于发酵产酶培养基中培养，得木聚糖酶的发酵液；

（2）、将木聚糖酶的发酵液离心，得第一次上清液；

（3）、向第一次上清液中缓慢滴加硫酸铵，盐析过夜，得盐析液；

（4）、将盐析液离心，取沉淀，用缓冲液溶解沉淀，得木聚糖酶粗酶液；

（5）、daeff凝胶过滤层析：将木聚糖酶粗酶液装柱，以缓冲液作为平衡液，进行daeff凝胶过滤层析，收集活性组分，得第一次活性成分；

（6）、cm.ff强阳离子交换层析：将第一次活性成分装柱，以缓冲液作为平衡液，用平衡缓冲液进行线性洗脱，收集活性组分，得第二次活性成分；

（7）、octylff疏水相互作用层析：将第二次活性成分中的硫酸铵质量浓度调整至40％，装柱，以硫酸铵缓冲液作为平衡液线性洗脱，收集活性组分，得第三次活性成分；

（8）、将第三次性成分透析除盐，冷冻抽干，得到干粉木聚糖酶。

本发明产木聚糖酶为新的一种菌株橘绿木霉（trichodermacitrinoviride）hl28-5，具有产生木聚糖酶的功效，有效用于制备木聚糖酶，开拓了木聚糖酶生产的新途径，可有效满足工业上对木聚糖酶的需要，有巨大的经济和社会效益。

附图说明

图1为本发明的生产工艺流程图。

图2为本发明筛选到的trichodermacitrinoviridehl28-5和其18srrna序列最相近的10个菌种构建的系统进化树图。

图3本发明中的trichodermacitrinoviridehl28-5生长及产酶曲图。

图4本发明的高产木聚糖酶的最适作用温度图。

图5本发明的高产木聚糖酶的温度稳定性图。

图6本发明的高产木聚糖酶最适作用ph图。

图7本发明的高产木聚糖酶ph稳定性图。

具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，一种产木聚糖酶的菌株，其筛选是：

（1）、富集培养：

取0.1g朽木，加入到10ml无菌水中振荡混匀，然后吸取1ml菌悬液接入到5ml富集培养基中，30℃水浴振荡培养48h；

所述的富集培养基是酵母粉1g、蛋白胨2g、木聚糖2g和水1l混匀制成；

（2）、透明圈法初筛：

将富集培养的培养物10倍逐级稀释，分别取稀释倍数为10^-3、10^-5和10^-7的菌悬液各0.5ml涂布于平板筛选培养基，37℃培养24h，挑取透明圈相对较大的单菌落进行分离纯化，接入斜面保藏培养基保存原始菌株；

所述的平板筛选培养基是木聚糖10g、kno31g、mgso40.2g、nacl0.5g、k2hpo40.5g、琼脂20g和水1l混匀制成；

所述的斜面保藏培养基是马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g和水1l混匀制成；

（3）、摇瓶发酵复筛：

将初筛选到的原始菌株接入100ml基础产酶培养基中，每组3个重复，于30℃，180r/min下培养2-3d，发酵液离心取上清液，dns分别测量发酵液木聚糖酶酶活；

所述的基础产酶培养基是麸皮4.0g，蛋白胨0.5g，k2hpo40.5g和水1l混匀制成；

（4）、菌种鉴定：

根据其18srdna序列比对，选出与其序列最相近的13株已知菌种，构建系统进化树（图2），鉴定该产木聚糖酶酶活力最高的菌种为橘绿木霉trichodermacitrinoviridehl28-5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmccno.11861），保藏日期：2015年12月11日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

该菌株有效应用于生产木聚糖酶，其应用方法包括以下步骤：

（1）、制备木聚糖酶的发酵液：

按质量2%的接种量将产木聚糖酶的菌株接种于发酵产酶培养基中，30℃、180rpm摇瓶培养48h，得木聚糖酶的发酵液；

所述的发酵产酶培养基是由重量计的：麸皮10g，木聚糖2g，蛋白胨6g，酵母粉1.5g，(nh4)2so41.5g，cacl20.3g，mgso40.3g，kh2po40.3g和feso40.005g和水1000ml混匀制成；

（2）、将木聚糖酶的发酵液4℃下、8000rpm、离心10min，取上清液；

（3）、向上清液中缓慢滴加硫酸铵，使硫酸铵的质量含量达到80%，4℃下，盐析过夜8-12h，得盐析液；

（4）、将盐析液4℃下、8000rpm离心10min，取沉淀，用ph7.0的tris-hcl缓冲液溶解沉淀，得到木聚糖酶粗酶液；

（5）、daeff凝胶过滤层析：将木聚糖酶粗酶液装柱，柱型1ml，将ph8.0的0.02mol/ltris-hcl缓冲液作为平衡液，流速：1ml/min进行daeff凝胶过滤层析，收集活性组分，得第一次活性成分；

（6）、cm.ff强阳离子交换层析：将第一次活性成分装柱，柱型1ml，将ph8.0的0.02mol/ltris-hcl缓冲液作为平衡液，流速：1ml/min，用1.0mnacl的平衡缓冲液进行线性洗脱，收集活性组分，得第二次活性成分；

（7）、octylff疏水相互作用层析：将第二次活性成分中的硫酸铵质量浓度调整至40％，装柱，进行疏水相互作用层析，柱型1ml，ph8.0、含40％饱和度硫酸铵的0.02mol/l硫酸铵缓冲液作为平衡液，流速：1ml/min，用1m的硫酸铵线性洗脱，收集活性组分，得第三次活性成分；

（8）、透析除盐：将第三次性成分转入装有20mmol/ltris-hcl缓冲液1l的透析袋中，透析过夜除盐，透析袋截留分子量为3500u，然后冷冻抽干，得干粉木聚糖酶。

本发明菌株是一种新的菌株，具有高产木聚糖酶之功效，有效用于生产木聚糖酶，并经实验取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：

所述的高产木聚糖酶的菌株是从腐朽的木头里面分离得到的，通过考察其形态特征、生理生化特征和18srrna序列特征对比，筛选出与其序列最接近的13株已知菌株，构建系统进化树，如图2所示，鉴定为橘绿木霉（trichodermacitrinoviride），命名为hl28-5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.11861。其制备的木聚糖酶的相对分子量为34.8kda，木聚糖酶的最适作用温度为50℃，木聚糖酶的最适作用ph7.0。

18srrna序列：

gagaatccggggttcactccaacccaatgtgaacgttaccaatctgttgcctcggcggga60

ttctctgccccgggcgcgtcgcagccccggatcccatggcgcccgccggaggaccaactc120

aaactcttttttctctccgtcgcggcctacgtcgcggctctgttttatttttgctctgag180

cctttctcggcgaccctagcgggcgtctcgaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatc240

tcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcaga300

attcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcat360

gcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcggcgttggggatcgg420

cccctcaccgggccgcccccgaaatacagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcag480

tagtttgcacactcgcaccgggagcgcggcgcggccacagccgtaaaacaccccaaactc540

tgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaaaaggcg600

gaggaa606

实验1

木聚糖酶酶活测定：180μl含1％木聚糖的底物，加入20μl适当稀释的酶液，50℃准确反应10min后加入200μl3，5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylicacid，dns）试剂溶液终止反应，沸水煮5min显色，迅速冷却至室温后补加2.1ml水，然后于540nm波长处测定od值。根据木糖标准曲线的回归方程计算出反应体系的含糖量。

试验中对木聚糖酶活力单位的定义为：在50℃，ph7.0条件下，每分钟水解木聚糖酶1μmol还原糖（以木糖计）所需要的酶量定义为1个酶活力单位（1u）。

iu＝d×r/10min×0.1ml

式中：d为酶液稀释倍数；r为回归方程计算出的木糖含量。

将木聚糖酶进行sds-page分析，得到单一条带，并经酶谱分析确定其具有木聚糖酶活性，达到电泳纯。

实验2：木聚糖酶的酶学性质

该木聚糖酶相对分子量的确定

将发酵得到的粗酶液及纯化后的木聚糖酶分别进行sds-page，分析得到其相对分子量约为34.8kda。

实验3：温度对酶活力的影响

(1)分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，ph7.0条件下测定该纯化后木聚糖酶的酶活力，重复3次，取平均值,计算不同温度下的相对酶活力。

结果如图4所示，其最适作用温度为50℃。

(2)该木聚糖酶的温度稳定性测定：将该纯化后木聚糖酶酶液分别置于不同温度

(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)、ph为7.0的条件下，保温2h，每隔30min取样测酶活，计算各自的残余酶活力，将最初酶液的酶活力定为100％。结果如图5，在低于50℃的范围内，该酶的温度稳定性都较好，其相对木聚糖酶活力变化不大，而当温度超过50℃时，该酶的温度稳定性变差，其相对酶活力迅速下降。

实验4：ph对酶活力的影响

(1)、该木聚糖酶最适作用ph的测定：在不同ph(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)，温度为50℃的条件下测定该纯化后木聚糖酶的酶活力，以最高酶活力为100％，计算不同ph下的相对酶活力。

结果如图6所示，其最适作用ph为7.0。

(2)、该木聚糖酶的ph稳定性测定：将该纯化后木聚糖酶酶液分别调至不同ph(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)、温度50℃条件下，保温2h后，测定各自的残余酶活力，将其中最高酶活力定为100％。结果如图7所示，该酶在ph5.0-10.0内稳定性较好。

由上述可以看出，本发明提供了产木聚糖酶的菌株，经菌种鉴定后，命名为橘绿木霉hl28-5，用于生产木聚糖酶，并对纯化后的木聚糖酶进行了酶学性质试验测定，相对分子量为34.8kda，最适作用温度及ph分别为50℃和7.0；在30℃～50℃和ph5.0-11.0范围内酶活保持相对稳定，质量好，可有效用于造纸、食品和饲料等多个工业领域，应用范围广，是木聚糖酶生产上的创新，经济和社会效益巨大。

sequencelisting

<110>河南省科学院生物研究所有限责任公司

<120>一种产木聚糖酶的菌株及其应用

<130>2017.5

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>606

<212>dna

<400>1