一株具有稻瘟病拮抗作用的黑曲霉及其应用的制作方法

本发明涉及一株对稻瘟病具有强抑制作用的黑曲霉及其应用，主要应用于稻瘟病生物防治的研究。
背景技术：
：生物防治(biologicalcontrol)，指利用有益生物或者其他生物来抑制或者消灭有害生物的一种防治方法。常见的生物防治方法包括微生物源农药、植物源农药。水稻稻瘟病是世界性的稻病，同纹枯病、白叶枯病一起被列为水稻三大病害。由稻瘟病引起的粮食损失，严重制约了水稻的发展。目前防治稻瘟病和纹枯病的方法主要包括化学防治、生物防治和栽培管理。化学防治见效快、成本低，但是容易导致环境污染、人畜中毒、病原菌产生抗性。生物防治对人畜无毒、不污染环境、效果持久，具有防治病害的新前景。黑曲霉，子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科中的一个常见种。自中伸出，直径15～20pm，长约1～3mm，黑曲霉壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状,直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。顶囊球形，双层小梗。分生孢子褐色球形。广泛分布于世界各地的、性产品和中。是重要的发酵工业菌种。本发明在疏花水柏枝内生真菌分离过程中得到一株黑曲霉，它具有很强的稻瘟病抑制作用，而且其发酵液对稻瘟病菌也有很强的抑制作用，可用于制备稻瘟病杀菌剂，为开发新的稻瘟病生防菌和杀菌剂提供了新选择。技术实现要素：本发明的目的之一是提供一种黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌株，该黑曲霉具有很强的稻瘟病拮抗作用，而且其发酵液对稻瘟病也有很强的抑制作用，可用于制备稻瘟病杀菌剂，为开发新的稻瘟病生防菌和杀菌剂提供了新选择。所述黑曲霉(aspergillusniger)js-1是在疏花水柏枝(myricarialaxiflora)的内生真菌分离过程中得到，于2017年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为，cctccm2017024。保藏地址为中国，武汉，武汉大学。本发明黑曲霉(aspergillusniger)js-1在马铃薯葡萄糖培养基上具有以下微生物学特性：10-12小时有白色菌丝，20-24小时白色菌丝产黑色孢子，5天后基本都是黑色的孢子，看不到菌丝，孢子表面较干燥，在马铃薯葡萄糖液体培养基上具有以下微生物学特性：3天左右，为白色菌团，4天左右培养基液面有少量黑色孢子生成。本发明目的是提供一种用于生物防治植物病害的菌剂和生物农药，其活性成分为黑曲霉(aspergillusniger)js-1。其中所述植物病害为水稻稻瘟病。抑菌试验表明，黑曲霉js-1对稻瘟病病原菌具有抑制效果。本领域技术人员很容易想到将本发明菌株的发酵液或菌悬液作为农药的有效成分用于植物病害的生物防治，或者将本发明菌株制备成菌剂用于植物病害的生物防治。因而，本发明还包括含有所述菌株或者其发酵液的生物农药，以及含有所述菌株的微生物菌剂。本发明以黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌株为模板，使用通用上游引物its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和通用下游引物its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′进行pcr扩增获得750bp的18srdna部分序列。通过blast与genbank收录的序列进行比对，发现js-1与黑曲霉的同源性为99％。用mega4.1进化树(图4)，鉴定菌株(js-1)与一株黑曲霉(aspergillusnigerkf768466)的同源性达99％。附图说明图1为本发明的黑曲霉(aspergillusniger)js-1的菌落形态，a为黑曲霉(aspergillusniger)js-1pda平板正面照片；b为黑曲霉(aspergillusniger)js-1pda平板背面照片。图2为本发明的黑曲霉(aspergillusniger)js-1的显微形态。图3为本发明的黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌体的稻瘟病抑菌活性的照片，在pda平板中央接种7mm稻瘟病菌种，培养5天后，在距平板中央3cm处用7mm打孔器打孔并接入黑曲霉(aspergillusniger)js-1孢子悬液，再培养4天。a为正面照片；b为背面照片。图4为黑曲霉(aspergillusniger)js-1发酵液粗提物在pda平板上对稻瘟病菌抑制图，c为正面照片；d为背面照片，图中上牛津杯为清水空白对照，下为发酵液粗提物。图5为正常生长7天稻瘟病菌在pda平板上的照片，e为正面照片；f为背面照片。图6为本发明的黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌株的18srdna系统发育树。具体实施方式实施例一：黑曲霉(aspergillusniger)js-1的分离和保存2012年在三峡流域湖北宜昌境内胭脂坝采集疏花水柏枝叶片，消毒后进行分离纯化过程中获得；分离纯化：将处理好的样品接种到pda(新鲜土豆200g/l，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，其余为水，ph7.2-7.5，121℃灭菌20min)固体培养基(加浓度为25μg/ml的青霉素抑制细菌和放线菌生长)上，置于28℃恒温培养箱中培养，当样品周围明显长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌株，转入到pda固体培养基中，连续接代几次，得到纯化菌株。培养：取纯化好的菌株，接种到pda固体平板培养基上，恒温箱内28℃培养，4天左右即可长满平板。采用石蜡保藏法，在灭菌的试管中倒入pda固体培养基制成斜面，接种菌落单一的js-1，恒温箱内28℃培养，待斜面长满后，加入灭菌的石蜡使之淹没斜面的高度即可，于4℃冰箱保存。将该菌株黑曲霉(aspergillusniger)进行保藏，保藏名称为js-1；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2017.1.11；保藏编号为，cctccm2017024。实施例二：黑曲霉(aspergillusniger)js-1鉴定18srdna序列分析：采用通用引物进行pcr扩增18srdna序列。上游引物its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和通用下游引物its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′。反应体系如下：反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，55-58℃退火30s，72℃延伸1.5min，33个循环，最后72℃延伸10min。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑取750bp左右的条带进行凝胶回收，送上海生工测序。将测得的序列提交至genbank，并获得登录号kx822145。将此序列在genbank中进行blast比对，并选取同源性较高的菌株的序列用mega4.1软件构建18srdna系统发育树。实施例三：黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌体的制备菌种活化：取保存4℃冰箱的黑曲霉(aspergillusniger)js-1，挑起少许菌体接种于pda固体平板培养基中，28℃下，培养4天。实施例四：黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌体对稻瘟病的抑菌作用研究1、菌体抑菌作用研究将稻瘟病菌7mm菌饼放置在pda平板中心，27℃倒置培养5天；再将黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌株孢子悬液打入平板上对峙三点，清水为对照，置于恒温培养箱27℃培养.2、发酵液对稻瘟病在pda平板上抑菌作用研究通过真空抽滤装置过滤菌悬液，弃去菌体，把发酵液上清液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，将萃取液于40℃条件下减压浓缩获得浓缩液，之后将浓缩液冷冻干燥获得粗提取物。将黑曲霉(aspergillusniger)js-1的发酵液粗提取物稀释4倍配成溶液，将稻瘟病菌7mm菌饼放置在pda平板中心，再将黑曲霉(aspergillusniger)js-1的发酵液粗提取物溶液打入50μl溶液于平板上一侧牛津杯中，另一侧牛津杯中加入清水作为空白对照，重复3次。3、发酵液粗提物对稻瘟病在土豆液体培养基上抑菌作用研究将稻瘟病菌接种在装有200ml液体土豆培养基的摇瓶中连续发酵一周，制成种子培养基。再摇匀种子培养基后，取5ml接种到装有200ml液体土豆培养基的摇瓶中，接种6瓶，标号为1,2,3,4,5,6瓶；1、2号瓶中分别加入清水0.5ml、1.0ml为空白对照；3、4号瓶中分别加入黑曲霉(aspergillusniger)js-1的发酵液粗提取物0.5ml为实验组一；5、6号瓶中分别加入黑曲霉(aspergillusniger)js-1的发酵液粗提取物1.0ml为实验组二。在27℃，摇床转速120r/min下连续培养8天，过滤菌体，放入烘箱中105℃过夜，测稻瘟病菌干重。黑曲霉(aspergillusniger)js-1发酵液粗提物对稻瘟病在土豆液体培养基上抑菌作用数据如下表：粗提物加入量/ml00.51稻瘟病菌干重/g1.1060.7330.841序列表seqidno：1js1544bpaspergillusniger黑曲霉菌cttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaccgagtgcgggtcctttgggcccaacctcccatccgtgtctattataccctgttgcttcggcgggcccgccgcttgtcggccgccgggggggcgcctttgccccccgggcccgtgcccgccggagaccccaacacgaacactgtctgaaagcgtgcagtctgagttgattgaatgcaatcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcccggcttgtgtgttgggtcgccgtccccctctccggggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccgatcctcgagcgtatggggctttgtcacatgctctgtaggattggccggcgcctgccgacgttttccaaccattttttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaacat。当前第1页12