防除连作番茄青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料的制作方法

专利名称：：防除连作番茄青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种能防除连作番茄青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术，专用于克服和消除连作番茄青枯病问题。二
背景技术：
：番茄青枯病是由茄科劳尔氏菌(及a/Wom'flw/fl"acean/w)引起的细菌性维管束土传病害。1906年美国Simth学者首次发现并报道这一病害，至今全世界除南极洲外，其他国家和地区均有青枯病的存在。劳尔氏菌被分为五个生理小种和6个生化小种。各小种对番茄均有一定的致病能力，其中生理小种l对番茄的致病力最强。在我国，番茄青枯病主要发生在温暖湿润的南方，随着气候变暖和高效农业发展，青枯病逐渐向我国北方发展。青枯菌能通过土壤、流水(灌溉等)、种子等方式传播，对环境有很强的适应能力。土壤中存在青枯菌后，初期由于病菌数量少，植株生长受到限制，矮小，果实小，农民往往认为是养分问题而加大氮肥投入，导致土壤中微生物群落进一步失衡，番茄连作3季以上，病原菌在根际成优势菌，从而侵染番茄。在高温高湿的条件下，病害发展迅速，发病严重的田块发病率达100%，造成绝收。目前南方很多蔬菜基地不再适合种植番茄，对我国番茄市场的发展影响很大。目前没有防治番茄青枯病的有效手段，利用根际微生物防治病害是综合防治土传病害的重要措施之一。生物防治技术满足现代农业对环境保护，食品安全等的要求，是实现农业可持续农业发展的有效方法之一。另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥产品的原料；大量的养分资源(C、N、P、K、S及微量元素)流失于土壤-植物系统之外，明显地削弱了我国农业可持续发展的能力。如何将从土壤中因收获作物而取走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥料再施入土壤。如果将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成髙品位的有机堆肥，再用于功能菌的载体，所制成的微生物有机肥料功能明确，将会有很好的应用前景。三、
发明内容1.技术问题本发明的目的在于提供一种能防治连作番茄青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料，克服或消除连作番茄作物青枯病效率达到80%以上，使大量的设施农业土壤和露地连作障碍土壤得到生物修复，确保集约化农业的顺利发展。2.技术方案防除连作番茄青枯病的拮抗菌NJQL-18，该菌株属于解淀粉芽孢杆菌(5""7/附w>Vo//^e/ac/eAW)，2009年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCN0.3177,主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+,细胞形状为短杆状，形成芽孢，兼性厌氧生长，接触酶反应阳性、石蕊牛乳产酸胨化、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨糖、纤维二糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖产酸并产气，不能利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性。用拮抗菌NJQL-18所生产的防除连作番茄青枯病微生物有机肥料，该肥料中含有lxl0MVg以上的拮抗菌NJQL-18、全氮含量质量比为4~5%，全氮中质量比卯％以上为有机氮，总氮磷钾养分为610%、有机质含量为3035%。所述的防除连作番茄青枯病微生物有机肥料，其生产方法包括1)选用拮抗菌NJQL-18，接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，其发酵条件为pH生长范围自然，培养温度范围2530'C，搅拌速度为180300转/分钟，发酵中后期形成芽孢,发酵的拮抗菌液含菌或芽孢量^xi(T个/ml;所用PDA培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7,2-7.4，121'C灭菌20min。2)将拮抗菌分别与腐熟后的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液50L，发酵温度为30-50'C，使拮抗菌含量达到lxl()S个/g以上，获得拮抗菌NJQL-18固体菌剂；所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质含量》35%，有机氮含量为l.2-2%,含水量25-30%。3)再将猪粪堆肥NJQL-18固体菌剂与30-50。/。的菜粕微生物酶解混合物的NJQL-18固体菌剂按照50-70%:30-50%(体积比)的比例充分混合，后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60'。的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为防除连作番茄青枯病微生物有机肥料。所述微生物有机肥料可专用于防除连作番茄青枯病。3.有益效果4本发明一种能克服或消除连作番茄青枯病的微生物有机肥料及其生产方法，利用猪粪堆肥和菜粕的微生物酶解混合物，再与拮抗菌液混合后制成微生物有机肥料，其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点1)肥料产品中含有抑制番茄青枯病原细菌生长的专一性高效菌株(NJQL-18菌)，其抑制效果非常显著，肥料中该高效菌株的含量达到lxl()S个/g以上，施入土壤后能形成优势群，并在土壤中存活下来。2)肥料产品中含有丰富的可溶性有机碳和有机氮，能给功能菌提供十分优越的生长环境，极大地提高了外来功能菌在土壤中的定殖和发挥功能的能力。3)本发明产品有机磷和有机氮含量特别高，均达到4%。本产品原料之一为猪粪堆肥，总磷含量很高，而且生物有效性特别高，在做成生物有机肥产品中无需添加任何含磷化肥，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤后生物有效性较差；本产品中有机氮能达到4%以上(大部分为氨基酸和小分子多肽)，确保了氮素持续稳定的供应，使番茄的生长和抗逆能力大大增强。4)试验结果表明，在连作番茄的土壤上施用本产品后，能显著降低番茄青枯病的发病率，生物防治率达80%以上，连续三年施用本肥料的土壤，连作青枯病的生物防治率更高。四图l拮抗菌NJQL-18液体菌剂对番茄青枯病的防治效果图2NJQL-18有机肥对番茄青枯病防治效果CKns指育苗时不用NJQL-18有机肥，CKts指移栽后不施用NJQL-18有机肥；BIOns指育苗时用NJQL-18有机肥，BIOts指移栽时穴施NJQL-l8有机肥五具体实施例方式1.菌株的分离和鉴定采集已经发生连作障碍并出现番茄青枯病病症的植株和周围土壤，采用SMSA青枯病选择性培养基获得病原菌株并验证其致病性。采集连作番茄青枯病发病的田块健康番茄植株根际土壤，分别利用NA改良培养基、PDA改良培养基和LB改良培养基利用对峙法、牛津杯法以病原菌为指示菌进行拮抗试验，分离和初筛拮抗菌株。通过盆栽试验复筛高效拮抗菌株，最终获得高效拮抗菌株NJQL-18，并进行鉴定，菌种冻干一20'C保存。菌株NJQL-18属于解淀粉芽孢杆菌(5ad//zaw_y/o//^e/"c/e";y)，主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞形状为短杆状，形成芽孢，兼性厌氧生长，接触酶反应阳性、石蕊牛乳产酸胨化、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨糖、纤维二糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖产酸并产气，不能利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性。2.菌剂生产1)将拮抗菌NJQL-18接种至ljPDA培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为pH生长范围自然，培养温度范围2530'C，搅拌速度为180~300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵的拮抗菌液含菌或芽孢量2lxl(^个/ml;所用PDA培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4,121'C灭菌20min。2)将拮抗菌分别与腐熟后的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液50L，发酵温度为30-50'C,使拮抗菌含量达到lxl()S个/g以上，获得拮抗菌NJQL-18固体菌剂；所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质含量》35%,有机氮含量为1.2-2%,含水量25-30%。其中菜粕的微生物分解混合物制备方法为(公知公用，见发明专利ZL200610086126.0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品)，菌株37-l发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55-65。/。和pH6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50'C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-5(TC共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH,使它们分别维持在55-65%和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物分解混合物(含氨基酸的混合材料)。3)再将猪粪堆肥的NJQL-18固体菌剂与菜粕微生物酶解混合物的NJQL-18固体菌剂按照50-70%:30-50%的比例充分混合，后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60'C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30W以下，包装出厂即为防除连作番茄青枯病微生物有机肥料。该肥料产品中含有lxl0MVg以上的拮抗菌NJQL-18、全氮含量质量比为45%,全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分为6~10%、有机质含量为3035%。可专用于防除连作番茄青枯病。3.温室防效试验考察NJQL-18液体菌剂或微生物有机肥(功能菌为NJQL-18)防治番茄青枯病的能力。1)NJQL-18液体菌剂的防治效果供试土壤为青枯病发病土壤，采自南京麒麟镇后村番茄青枯病发病田块。番茄品种为合作903,为青枯病感病品种。种子表面消毒后，播种到装有400g健康土壤的小钵子里(500ml)进行育苗，30天后进行试验。在处理营养钵中加入20mlNJQL-18菌悬液(109cfii/ml)，而对照营养钵中加入20ml无菌水，三天后移栽到5公斤的盆钵中。移栽后14天开始记录发病情况，移栽21天后，对照植株的感病指数达83.3%,NJQL-18处理植株的感病指数为30。/。，防病率达64.0%,表明NJQL-18表现出较很好的防治效果。而且经NJQL-18液体菌剂处理后，番茄地上部干重增加了82.4%,表现出明显的促生作用(图l、表l)。2)微生物有机肥的防治效果供试土壤为青枯病发病土壤，采自南京麒麟镇后村番茄青枯病发病田块。供试品种为合作903，为青枯病感病品种。实验设置3个处理1)CKns+CKts;2)BIOns+CKts;3)BIOns+BIOts。CKns指育苗时不用NJQL-18有机肥，CKts指移栽后不施用NJQL-18有机肥；BIOns指育苗时用NJQL-18有机肥，BIOts指移栽时穴施NJQL-18有机肥。番茄种子表面消毒后，播种到装有400g健康土壤(拌入2%的NJQL-18有机肥或不拌入，所有处理均为等养分，氮磷钾用化肥补齐。)的小钵子里(500ml)，育苗50天(春季)后将番茄移栽到含有青枯病发病土壤的周转箱，每箱12株，每处理2重复。移栽时处理3)的每株番茄根部施用5gNJQL-18有机肥。移栽后47天的防治效果见图2。结果表明育苗时施用NJQL-18有机肥的防病率达82.7y。，育苗和移栽都施用NJQL-18有机肥的防病率高达89.6。/。(表O。施用微生物有机肥还显著促进番茄生长，地上部鲜重增加124.4%。试验结果说明，单纯使用液体菌剂在发病严重的土壤中防病率为64.0%，将生防菌制成微生物有机肥后可显著提高防病效果，达到89.6%。_表lNJQL-18温室防治番茄青枯病效果_处理移栽后天数(天)感病指数(％)防病率(％)干(鲜)重增加(％)液体菌剂CKNJQL-18CK+CK21214783.330.096.464.082.4(干)微生物有机肥BIO+CK4716.782.7%92.5(鲜)BIO+BIO4710.089.6%124.4(鲜)注:番茄青枯病发病等级分5级:0级表示植株正常；1级表示植株叶片萎蔫比例￡25%:2级表示26%^植株叶片萎蔫比例^50%:3级表示51%植株叶片萎蔫比例^75%;4级表示76°/<^植株叶片萎蔫比例<100%;纟级表示植株全部萎蔫或死亡。防病率=100><(对照感病指数-处理感病指数)/对照感病指数4.田间试验为验证本发明的微生物有机肥在田间的防治效果，在南京麒麟镇后村番茄青枯病发病大棚进行了田间试验。番茄品种为合作903。实验处理如下1)对照(CK)，育苗时不施用有机肥；2)普通有机肥(OF)(不含功能微生物)，即育苗时施用2%普通有机肥；3)NJQL-18有机肥(BIO)，即育苗时施用2WNJQL-18有机肥。所有处理均为等养分，氮磷钾用化肥补齐。移栽后108天后(收获后期)的结果见(表2)。用NJQL-18有机肥育苗后番茄青枯病的生物防治率达到86.8%，番茄增产30%。表2大田发病率、防病率和产:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明专利从改善土壤微生物区系这一关键问题着手，研制出一种能显著降低连作番茄青枯病发生的微生物有机肥料产品，防治率达80%以上。本肥料产品的作用机制在于本肥料产品中的有效碳和有效氮源给产品中的功能菌的培育提供了很好的条件，使之迅速建立外源有益功能菌微生物的生态及其食物链；另一方面，本肥料产品中含有较高含量的有机氮和有机磷，这些营养物质对连作障碍土壤中作物的生长十分有利，大大提高了作物的立苗率和抗逆能力。权利要求1、一种防除连作番茄青枯病的拮抗菌，该菌株NJQL-18属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，2009年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.3177，主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞形状为短杆状，形成芽孢，兼性厌氧生长，接触酶反应阳性、石蕊牛乳产酸胨化、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨糖、纤维二糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖产酸并产气，不能利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性。2、用权利要求1所述拮抗菌NJQL-18所生产的防除连作番茄青枯病微生物有机肥料。3、根据权利要求2所述的防除连作番茄青枯病微生物有机肥料，其特征在于该肥料中含有lxl()8个/g以上的拮抗菌NJQL-18、全氮含量质量比为45%，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分为610%、有机质含量为3035%。4、权利要求2或3所述防除连作番茄青枯病微生物有机肥料的生产方法，包括1)将拮抗0NJQL-18接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，其发酵条件为pH生长范围自然，培养温度范围2530'C，搅拌速度为180300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵的拮抗菌液含菌或芽孢量^lxl(^个/ml;2)将拮抗菌分别与猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液50L,发酵温度为30-50'C,使抬抗菌含量达到lxl0MVg以上，获得拮抗菌NJQL-18固体菌剂；3)再将猪粪堆肥的NJQL-18固体菌剂与菜粕微生物酶解混合物的NJQL-18固体菌剂按照体积比50-70%:30-50%的比例充分混合，后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60'C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30。/。以下，包装出厂即为防除连作番茄青枯病微生物有机肥料。5、根据权利要求4所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤(1)所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min,接着用四层医用纱布过滤，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7,2-7.4，121'C灭菌20min。6、根据权利要求4或5所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤(2)所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量》35%，有机氮质量比含量为1.2-2%,含水量质量比25-30%。7、权利要求2或3所述微生物有机肥料的应用。全文摘要本发明涉及防除连作番茄青枯病的拮抗菌及其生产的微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了对番茄青枯病病原细菌有显著拮抗作用的拮抗菌NJQL-18，该拮抗菌与有机物料再进行固体发酵制成微生物有机肥料，肥料中含有1×10⁸个/g以上的NJQL-18、全氮含量为4～5％(90％以上为有机氮)，总氮磷钾养分为6～10％、有机质含量为30～35％。试验表明，这种微生物有机肥料施入土壤后能够使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成优势群，在发病严重的番茄青枯病土壤中生防效率达80％以上。在还没有形成连作障碍的土壤上长期施用本微生物有机肥料能在很大程度上防止连作番茄青枯病的发生。文档编号C12N1/20GK101659933SQ200910183360公开日2010年3月3日申请日期2009年9月18日优先权日2009年9月18日发明者徐阳春,杨兴明,标沈,沈其荣,中韦申请人:南京农业大学被以下专利引用(3),