专利名称：能防治番茄青枯病或根结线虫的拮抗菌及其微生物有机肥料的制作方法
技术领域：
本发明涉及能防治番茄青枯病或根结线虫的拮抗菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术，专用于克服和消除番茄青枯病和根结线虫病害问题。背景技术：
番茄在世界各地均有栽培，具有很高的营养价值，是世界各地人们普遍喜食的的果菜之一。在欧美国家、中国和日本有大面积温室、塑料大棚及其他保护地设施栽培。中国各地普遍种植。栽培面积仍在继续扩大。青枯病是由茄科劳尔氏菌引起的一种全世界广泛分布的细菌性土传病害，在高温、高湿、亚热带地区大量流行，是农业可持续发展的主要障碍之一。青枯菌可侵染44个科的450多种植物，造成15%-100%的产量损失。根结线虫是一类对多种农作物造成严重危害的土传植物寄生线虫，致使寄主常年减产15%-25%，有时达70%以上，全世界每年由根结线虫造成的经济损失就可达1000多亿美元。传统的化学防治方法虽然能在一定程度上控制住病害，但其选择性差，会对环境及人类造成负面影响。另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等，使大量的养分资源流失于土壤-植物系统之外，不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥生产原料的有机物资源，不利于我国农业的可持续发展。如何将从土壤中因作物收获而取走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥料再施入土壤。将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用作功能菌的载体，制成功能明确的微生物有机肥料， 具有广阔的应用前景。三
发明内容
1.技术问题
本发明目的是研制一种能防治番茄青枯病和根结线虫的微生物有机肥料，对番茄青枯病的防治率达70%以上，且能降低根结线虫发病土壤中根结线虫数80%以上，使大量的番茄青枯病或根结线虫病害土壤得到生物修复，确保集约化农业的顺利发展。技术方案
能防治番茄青枯病和根结线虫的拮抗菌菌株)(Z-173，属于解淀粉芽孢杆菌 (.Bacillusamyloliquefaciens), UM, H M 2010 年 9 月 14 日，保藏号为 CGMCC NO. 4160 ；地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC )。XZ-173的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，过氧化氢酶阳性，淀粉水解阳性，V. P.反应阴性，甲基红试验阳性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阴性，能利用柠檬酸盐、酒石酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、果糖只产酸。用上述拮抗菌TL-Yn所生产的微生物有机肥料中拮抗菌含量2X IO7CfU · g—1以上，全氮含量为5 6% (90%以上为有机氮)，总氮磷钾养分为7 10%，有机质含量为30 35%。 该肥料专用于防治番茄青枯病和根结线虫，其生产方法包括
1)将拮抗菌)(Z-173接种到改良牛肉膏液体培养基中，分别进行发酵生产，发酵生产的条件为pH 7.0 7.2，培养温度30 351，搅拌速度170 rpm，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量> IXIOki cfi^mr1。所用改良牛肉膏培养液配制方法，以配制IL培养基为例牛肉膏2g，玉米粉5g，麸皮5g，土豆淀粉5g，氯化钠5g，定容至1000 ml，pH值调至 7. 2 7. 4，121°C灭菌 20 min。2)将拮抗菌)(Z-173与腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，固体发酵温度不超过50°C，发酵5天后结束，使拮抗菌含量达到2X IO7 cfu · g—1以上，获得含有拮抗菌)(Z-173的微生物有机肥料。该微生物有机肥在温度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为防治番茄青枯病和根结线虫病的微生物有机肥料。其中
腐熟后的猪粪堆肥由江苏新天地生物肥料工程中心有限公司提供，本品发芽指数为 98%以上，有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1. 2-2%，含水量质量比25-30%。菜粕微生物酶解物的制备方法将保藏号为CGMCC NO. 1543的嗜麦芽寡养单胞 MUtenotrophomonas maltophiIia)菌株37_1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量 55-65%和pH 6. 0-7. 5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50°C共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和PH，使它们分别维持在55-65%和6. 0-7. 0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物PH调整为5. 0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕微生物酶解物；
腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制备方法将腐熟的猪粪堆肥与菜粕微生物酶解物按体积比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2 次。有益效果
本发明利用拮抗菌对猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物，制成微生物有机肥料， 其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点
1)肥料产品中含有防治番茄青枯病和根结线虫危害的高效菌株(ΧΖ-173)，其防治效果非常显著，肥料中该高效菌株的含量达到2 X IO7Cfu · g-1以上，施入土壤后能形成优势群， 并在土壤中存活下来。2)肥料产品中含有丰富的可溶性有机碳和有机氮，能给功能菌提供十分优越的生长环境，极大地提高了拮抗菌在土壤中的定殖和发挥功能的能力。3)本发明产品全磷和全氮含量较高，均达到4%。本产品原料之一为腐熟的猪粪堆肥，全磷和有效磷含量高，在制成的微生物有机肥料产品中无需添加任何含磷化肥，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。本产品原料之一为菜粕微生物酶解物，不仅全氮含量高，而且含有丰富的氨基酸和小分子多肽，确保了肥料氮素持续稳定的供应，使作物生长和抗逆能力大大增强。4)试验结果表明，在番茄青枯病和根结线虫发病严重的土壤上施用本产品后，能显著降低青枯病的发病率和根结线虫的侵染率，生物防治率分别达70%和80%以上。四
图1 )(Z-173对番茄青枯病平板对峙效果图2 )(Z-173分解胶原蛋白效果五具体实施方式
(一)菌株的分离和鉴定
采集健康的番茄植株和周围土壤，样品低温保存。从植株根际土壤中分离拮抗菌，再以胶原蛋白选择性培养基筛选产蛋白酶的拮抗菌，最后通过盆栽试验复筛出高效拮抗菌株 )(Z-173，鉴定到属种，菌种于20%甘油中-70°C保存。拮抗菌株)(Z-173的抑菌圈如图1所示。)(Z-173的胶原蛋白水解圈如图2所示。拮抗菌YL-Yn属于解淀粉芽孢杆菌UaciBttsafflJ^Wi卯e/acieas)，主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，过氧化氢酶阳性，淀粉水解阳性，V. P.反应阴性， 甲基红试验阳性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阴性，能利用柠檬酸盐、酒石酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、果糖只产酸。(二)菌剂生产
1)将拮抗菌)(Z-173接种到改良牛肉膏液体培养基中，进行发酵生产，发酵生产的条件为PH 7.0 7.2，培养温度30 351，搅拌速度170 rpm，发酵中后期形成芽孢，获得拮抗菌液中含菌或芽孢量> IX 101° cfu .HiF10所用改良牛肉膏液体培养基配制方法为，以配制IL 培养基为例牛肉膏2g，玉米粉5g，麸皮5g，土豆淀粉5g，氯化钠5g，定容至1000 ml, PH 值调至 7. 2 7. 4，121°C 灭菌 20 min。2)将拮抗菌\τ-νη与腐熟后的猪粪堆肥和菜粕的微生物酶解混合物分别进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50°C，一般发酵5天后结束，使拮抗菌含量达到2 X IO7Cfu · g-1以上，获得拮抗菌 XZ-173的猪粪堆肥固体菌剂和菜粕微生物酶解混合物(江苏新天地生物肥料工程中心有限公司生产)固体菌剂。所用腐熟后的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量彡35%，有机氮质量比含量为1. 2-2%，含水量质量比25-30%。其中
腐熟后的猪粪堆肥江苏新天地生物肥料工程中心有限公司生产，产品有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1. 2 2%，含水量质量比25 30%。菜粕微生物酶解物制备方法(公知公用，见发明专利ZL200610086U6. 0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品)将保藏号为CGMCC NO. 1543的嗜麦芽寡养单胞 iQStenotrophomorms maltophiIia)菌株37_1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量 55-65%和pH 6. 0-7. 5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50°C共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和PH，使它们分别维持在55-65%和6. 0-7. 0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物PH调整为5. 0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕微生物酶解物；
腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制备方法将腐熟的猪粪堆肥与菜粕微生物酶解物按体积比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2 次。
上述生产的微生物有机肥(防治番茄青枯病或根结线虫病的微生物有机肥料)，其中含有2X IO7Cfu · g—1以上的拮抗菌)(Z-173、全氮含量为5 6% (90%以上为有机氮)，总氮磷钾养分为7 10%、有机质含量为30 35%。(三)盆栽试验
1.拮抗菌)(Z-173发酵的微生物有机肥料对番茄青枯病的防治作用
选取青枯菌病严重发病地块土壤为盆栽用土，以育苗盘中添加蛭石培育番茄幼苗。盆钵每盆装5 kg青枯病发病土壤，盆钵中微生物有机肥施用量为0. 5%，即每盆加入250 g微生物有机肥，将其与土混合均勻。待番茄幼苗长出3片真叶时移入盆钵中。试验设置2个处理，每处理重复14次。试验处理如下
处理1 盆钵施用等量不含菌株)(Z-173的“田娘”牌普通有机肥(即对照)； 处理2 盆钵施用含菌株)(Z-173的微生物有机肥。自移栽20天时发现青枯病发病植株，随后每天观察植株发病情况，记录发病率。 采集各处理的植株样和土样带回实验室分析测定。结果表明(表1)，处理1和处理2的番茄植株发病率分别为60. 7%和25%，说明施用微生物有机肥能够显著降低番茄青枯病的发病率，对番茄青枯病的防治率达7596，相对防效为58. 8
权利要求
1.能防治番茄青枯病或根结线虫的拮抗菌，该菌株)(Z-173，属于解淀粉芽孢杆菌 (.Bacillus amyloliquefaciens ), 1 H M 2010 年 9 月 14 日，保藏号 CGMCC NO. 4160 ；XZ-173的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，过氧化氢酶阳性、淀粉水解阳性、V. P.反应阴性，甲基红试验阳性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阴性，能利用柠檬酸盐、酒石酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、果糖只产酸。
2.用权利要求1所述拮抗菌生产的微生物有机肥料。
3.根据权利要求2所述的微生物有机肥料，其特征在于该肥料中含有2X IO7 cfu .g-1 以上的拮抗菌)(Z-173、全氮质量比含量为5 6%，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为7 10%，有机质质量比含量为30 35%。
4.权利要求2或3所述微生物有机肥料的生产方法，包括1)将拮抗菌TL-Y^接种到改良牛肉膏液体培养基中，进行发酵生产；发酵生产的条件为pH 7. (Γ7. 2，培养温度30 35°C，搅拌速度170 rpm，发酵中后期形成芽孢，获得拮抗菌液中含菌或芽孢量> IXlO10 cfu · πιΓ1 ；2)将拮抗菌)(Z-173与腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物进行固体发酵， 每吨固体有机物料中加入拮抗菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，固体发酵温度不超过50°C，发酵5天后结束，使拮抗菌含量达到2 X IO7 cfu .g-1以上，获得含有拮抗菌)(Z-173 的微生物有机肥料，该微生物有机肥在温度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为防治番茄青枯病和根结线虫病的微生物有机肥料。
5.根据权利要求4所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤1)所用改良牛肉膏液体培养基配制方法，以配制IL培养基为例牛肉膏2g，玉米粉5g，麸皮5g，土豆淀粉5g， 氯化钠10g，定容至1000 1111，？!1值调至7.2 7.4，1211灭菌20 min。
6.根据权利要求4或5所述生物有机肥料的生产方法，其中步骤2)所用腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制备方法为将腐熟的猪粪堆肥与菜粕微生物酶解物按体积比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，即得腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物；其中腐熟后的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1. 2-2%，含水量质量比25-30% ；菜粕微生物酶解物的制备方法将保藏号为CGMCC NO. 1543的嗜麦芽寡养单胞菌 QSteno trophomonas mal tophilia )菌株37_1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量 55-65%和pH 6. 0-7. 5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50°C共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和PH，使它们分别维持在55-65%和6. 0-7. 0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物PH调整为5. 0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕微生物酶解物。
7.权利要求2或3所述微生物有机肥料在防治番茄青枯病或根结线虫病中的应用。
全文摘要
本发明涉及能防治番茄青枯病和根结线虫病害的拮抗菌及利用其生产的微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了一株对番茄青枯病病原细菌和根结线虫有显著拮抗作用的拮抗菌(解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensXZ-173)。将拮抗菌与有机堆肥制成微生物有机肥料，肥料中含有2×107cfu·g-1以上的拮抗菌、全氮含量为5～6%，总氮磷钾养分为7～10%、有机质含量为30～35%。试验表明，该微生物有机肥料施入土壤后能够使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成优势群，对番茄青枯病的防治率达70%以上，且能降低根结线虫发病土壤中根结线虫数80%以上。
文档编号C12N1/20GK102154156SQ201010608579
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者冉炜, 朱震, 李 荣, 杨兴明, 沈其荣 申请人:南京农业大学, 江苏新天地生物肥料工程中心有限公司