专利名称：与番茄苗期耐盐主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及农业生物技术领域。具体的说，本发明涉及一种番茄苗期耐盐主效 QTL(Quantitative Tratit Loci，数量性状位点)紧密连锁的分子标记及其获得方法和应 用的技术领域。
背景技术：
番茄(Solanum lycopersicum)属茄科番茄属，广泛栽培于世界各地，不仅可用于 鲜食，而且可加工成不同类型的番茄制品。然而，随着复种指数的提高，水、肥、农药尤其 是长期氮肥施用量的大幅度增加，无论是露地还是保护地均已出现不同程度的次生盐渍 化现象，严重影响了番茄的正常生长与发育(李廷轩，西南农业学报，2001，14(SUppl.) 103-107)。与硬粒小麦、玉米、马铃薯、甜菜和向日葵等作物相比，番茄为中度盐敏感植物 (Katerji N, Agricultural WaterManage (农业灌溉水管理)，2001，47 :1_8)，而且番茄与其 它作物一样，耐盐性受生长发育不同阶段的调控，每一个生长发育阶段的耐盐性和其它阶 段基本不相关，每一个生长发育阶段都受多基因控制，而且受环境影响较大。芽期和苗期对 盐更敏感，随着株龄的增加，耐盐性呈现增加的趋势，开花和座果期可以忍受使苗期致死的 盐浓度(Mittova V，Journal of Experimental Botany (植物试验学报)，2004，55 (3") 1105-1113)。盐害不仅影响番茄的产量和品质，严重时可导致植株死亡。目前，无论是保护 地还是露地番茄生产，主要采用育苗移栽；另外，盐胁迫下番茄植株营养生长与产量呈正相 关，良好的营养生长是后期产量形成的重要基础。因此，在盐碱含量较高的土壤栽培番茄， 幼苗期耐盐不仅可提高番茄移栽的成活率，而且是未来形成产量的重要基础。耐盐性鉴定是番茄耐盐育种的重要环节。只有对育种材料的耐盐性进行客观准 确的评价，才能进行有效的选择。目前育种工作者普遍采用的耐盐性鉴定指标有形态指 标、生理生化指标。大量前人工作(吴运荣，浙江大学学报(农业与生命科学版)，1999， 25(6) :645-649 ；费伟，上海交通大学学报(农业科学版)，2005，23 (1) 5-9 ；Foolad MR, HortSciene (园艺作物科学)，1997，32 (2) :296_300)已表明。番茄耐盐的遗传机理复杂； 常规育种实践中，对于耐盐材料的选择是十分困难的一方面选育周期长，需要经历杂交和 回交复杂的选择程序，另一方面盐害的发生受很多因素的综合影响，例如空气温度、空气 湿度和土壤含水量等，致使鉴定耐盐材料的过程不易控制。这些都是导致番茄耐盐育种进 展缓慢的重要原因。为了丰富我国番茄品种的遗传资源，改良番茄的耐盐性，选育耐盐性强、品味好的 品种一直是番茄育种的重要目标。目前番茄主要是以育苗移栽为主，因此番茄苗期耐盐就 显的尤为重要，近几年发展起来的分子标记辅助育种技术，通过构建重要番茄耐盐品种的 遗传图谱和数量性状位点(Quantitative TratitLoci, QTL)分析，对于找到与番茄耐盐主 效QTL紧密连锁(或共分离)的分子标记具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连 锁的分子标记。比现有技术在鉴定结果与田间耐盐吻合率明显提高，不受环境条件的影响， 节约了成本，提高了育种和选择效率。本发明通过以下技术方案实现的通过构建重要番茄耐盐品种的遗传图谱和数量 性状位点(Quantitative Tratit Loci, QTL)分析，找到与番茄耐盐主效QTL紧密连锁(或 共分离)的分子标记。使用与某一特定番茄耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记，实现对番茄 种质材料在幼苗期进行早代筛选，淘汰盐敏感的植株，节约生产成本，提高育种和选择效率。本发明具体提供了一种番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁分子标记的方法，包括以 下步骤(1)以野生番茄S.permellii LA716的76个渐渗系中苗期耐盐渐渗系IL7-5为 材料，此渐渗系群体是以盐敏感普通番茄S. Iycopersicum M82为遗传背景，耐盐渐渗系 IL7-5的亚渐渗系IL7-5-5与IL7-5含有相同的耐盐QTL。(2)番茄苗期盐敏感品种M82 (母本)和番茄苗期耐盐渐渗系IL7-5 (父本)杂交， 得到杂种F1。(3)由杂种F1自花授粉获得1338株F2单株，提取每个F2单株的基因组DNA。(3)苗期耐盐鉴定，盐胁迫处理12d后开始调查盐害情况，根据盐害的萎黄、坏疽、 枯萎不同程度，将盐害划分为0-10个等级，并根据耐盐分级情况，将分级数转换为耐盐成 活百分率。(4)选取在耐盐亚渐渗系IL7-5-5与盐敏感品种M82之间具有扩增多态性的SSR、 CAPS和AFLP引物组合；扩增产物SSR、AFLP或经相应内切酶消化后的扩增产物CAPS，在6 % 变性聚丙烯酞胺凝胶SSR、AFLP和1. 5%琼脂糖凝胶CAPS上电泳分离后，获得多态性分子 标记。(5)以已获得的IL7-5-5上的侧翼标记SSR285筛选1338株F2单株，根据差异性 标记建立了一个255株的F2重组群体。(6)根据已获得的在IL7-5-5与M82之间具有多态性的4个特异性标记U231219、 C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49，对255个F2重组群体进行遗传分析，获得分子标记资 料。(7)将255株F2重组单株的耐盐成活率与遗传连锁图中的分子标记进行连锁 和QTL分析，以3. 0为LOD阀值，确定与番茄苗期耐盐主效QTL连锁的分子标记SSR285、 U231219、C2_At4g30580、E35/M50 和 E39/M49。本发明中，根据已获得的在IL7-5-5与M82之间具有多态性的5个特异性标记 SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49中，所述的多态性分子标记，其引物序 列为SSR285上游引物为5 5' CAATTCTCAGGCATGAAACG‘ 3 ；U231219上游引物为5 ‘ 5' TGCTGGGAATATAATCAGCAAGG‘ 3 ；C2-At4g30580 上游引物为 5
AGTGGCTCTCACCTACTGCG ‘ 3，下游引物为 AGTCTCTTGCTTGAGTCTGGAGTTG ‘ 3，下游引物为 TCAGCCGGTGCTGCTTATCCAC‘ 3，下游引物为 5' TGATGAACTTGAAGTTTCTCCCAAGAG‘ 3 ； AFLP弓丨物E35/M49组合上游引物E35为5 ‘ GACTGCGTACCAATTCACA ‘ 3，下游弓丨物 为 M49 为 5' GATGAGTCCTGAGTAACAG‘ 3 ； AFLP弓丨物E39/M50组合上游引物E39为5 ‘ GACTGCGTACCAATTCAGA ‘ 3，下游弓丨物 为 M50 为 5' GATGAGTCCTGAGTAACAT‘ 3。本发明中，由于IL7-5-5片段很短，仅为0. 9cM,在第7条染色体2. 0-2. 9cM片段之 间，在杂交组合中其发生交换的几率很小，而且构建F2临时性群体时，往往容易遗失耐盐 QTL所在的片段，所以以重叠但片段较长的耐盐渐渗系IL7-5与盐敏感遗传背景材料M82为 亲本材料。本发明中，在盐胁迫处理后进行调查盐害情况中，根据盐害的萎黄、坏疽、枯萎不 同程度，将盐害划分为0-10个等级，具体分级标准如下0级完全致死，10级植株健康， 没有任何盐害症状。根据耐盐分级情况，将分级数转换为耐盐成活百分率，即耐盐成活率％ =级数/11 X 100。耐盐成活率(SP)用于统计分析和QTL定位，为遗传分析的需要，划定 耐盐(SP彡45% )，耐敏感(SP < 45% )0本发明中，将255株的F2重组单株的耐盐成活率与遗传连锁图中的分子标记进行 连锁和QTL分析，以3. 0为LOD阀值，大于3. 0说明存在一个QTL位点，确定与番茄苗期耐 盐主效 QTL 连锁的分子标记 SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50 和 E39/M49。本发明所涉及的与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用，将分子 标记SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49用于番茄品种或品系的基因型 检测，以判断该品种或品系在苗期是否具有耐盐性，包括以下步骤(1)以耐盐渐渗系IL7-5或亚渐渗系IL7_5_5为父本或母本与其他番茄杂交并繁 衍至F2代以上；(2)对通过步骤(1)获得的番茄单个植株，分离叶片DNA，检测分离的DNA中是否 存在与耐盐主效QTL相连锁的分子标记；如有苗期耐盐主效QTL异侧的3个以上分子标记 同时出现，预测番茄苗期达到耐盐水平。本发明中，将SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50 和 E39/M49 分子标记用于 番茄种质材料的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有耐盐性。本发明中所选用的野生番茄S. pennellii LA716的76个渐渗系(IL)材料，来源 于美国番茄遗传中心(TGRC)，本领域普通技术人员可以通过引进途径可以获得。本发明中所选用的番茄S. Iycopersicum M82，来源于普通栽培番茄，本领域普通 技术人员通过购买或赠予途径可以获得。本发明中所选用的F1,来源于M82XIL7-5，本领域普通技术人员通过常规杂交途
径可以获得。本发明中所选用的F2，来源于F1自交产生，本领域普通技术人员通过常规自交途 径可以获得。本发明以IL7-5-5及其衍生品种或品系为父本或母本与其它番茄杂交并繁衍至F2 代以上。所述IL7-5-5及其衍生品种或品系，是指以IL7-5-5为亲本，通过常规杂交、或采 用组织培养、或采用花药培养、或用别的物理或化学方法杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加 倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的番茄品种或品系。
本发明筛选的SSR标记与CAPS标记的序列信息，都可以通过Cornell大学网站 (http//www. SRn. Cornell, edu/)免费获得。本发明筛选的AFLP标记的序列信息，可以通过一般生物网站或已公开发表的论 文文献免费获得。通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果1.本发明能克服常规育种中番茄苗期耐盐性鉴定易受环境影响，在幼苗期就可通 过检测分子标记对番茄植株的耐盐性进行预测和筛选，淘汰盐敏感植株，而利用常规耐盐 育种方法选育一个新品种或新品系，往往需要6-8年，甚至更长时间，同时每代都需要对群 体进行耐盐性鉴定，工作量很大。此外，耐盐性鉴定又往往受环境条件的影响，而分子标记 辅助选择不受环境条件的影响，在低世代就可以对耐盐性进行选择，将大大减少育种家的 工作量，提高选择的准确性和育种效率。本发明对耐盐渐渗系IL7-5和盐敏感品种M82杂 交获得的重组F2代每个单株的基因型和耐盐性表型数据进行QTL和遗传连锁分析，获得与 番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和 E39/M49。通过检测番茄种质材料的DNA中是否有分子标记，可预测其耐盐水平，从而可加 快至少50%的选择进度，减少至少80%的工作量，选择的准确率由85%提高到100%。2.本发明是一种多基因控制的耐盐性的技术，本发明使用的IL7-5是耐盐渐渗 系，在国际上已经广泛被育种家使用作为耐盐的亲本，其苗期耐盐性主效QTL相连锁的分 子标记为首次报道，利用与苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记，可以不受环境条件的 影响，番茄种质材料在早代苗期进行筛选，节约成本，提高育种和选择效率。
图1为6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M是IOObp plus DNA Ladder marker ；样 本从左到右第2、3泳道为IL7-5-5，第4、5泳道为M82。图2为1. 5%琼脂糖凝胶电泳图，M是IOObp plus DNA Ladder marker ；样本从左 到右第2、3泳道为IL7-5-5，第4、5泳道为M82。图3为1. 5%琼脂糖凝胶电泳图，M是IOObp plus DNA Ladder marker ；样本从左 到右第2、6泳道为IL7-5-5，第3、7泳道为M82。图4为6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，样本从左到右第1泳道为IL7-5-5，第2、 3泳道为M82。图5为6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，样本从左到右第1、2、3、4泳道为I L7-5-5，第 5、6、7、8 泳道为 M82。图6为番茄苗期耐盐主效QTL(Stq7b)连锁片段定位分析示意图。
具体实施例方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中设备和材料有PCR仪选用MJ PTC-200热循环仪；引物由上海生物工程责任有限公司提供；Taq酶 采用上海生工Promega进口分装；缓冲液采用上海生工Promega进口分装；dNTPs中dATP， dCTP，dGTP，dTTP各取IOmM组成混合液均购于大连宝生物责任有限公司和Promega进口原装；限制性内切酶选用 TaqI，EcoRI，EcoRV, PstI，HindIII，XbaI，DraI，HinfIII, HaeII， PvuII, BamHI, AluI, MspI, Seal, HhaI, RsaI均购于大连宝生物责任有限公司；其他试剂购 于北京鼎国生物技术发展中心。栽培种S. Iycopersicum M82及来自S. pennellii LA716的76个渐渗系。渐渗系 群体是基于普通番茄S. Iycopersicum M82遗传背景，利用侧翼标记，将野生种S. pennellii LA716片段渗入构建，包括初始含有较长染色体片段的50个品系，及含有的较短片段的26 个品系，这些含有较短片断的品系与50个品系中的一些品系基本完全重叠，为精细定位提 供了基础。全套渐渗系基本覆盖了野生种LA716的整个基因组，片段平均长度约12. 3cM。 上述材料均由美国番茄遗传资源中心(Tomato Genetic Resource Center, TGRC)提供，种 子由中国农业科学院蔬菜花卉研究所繁殖。1. 5%琼脂糖凝胶采用IOOml TBE溶液中含1. 5g琼脂糖；6%变性聚丙烯酰胺凝胶 采用IOOml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含42. Og尿素、5. 7g丙烯酰胺和0. 3g甲叉双丙烯酰胺。本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实 施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。实施例一与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁分子标记的获得(1)采用耐盐渐渗系IL7-5与番茄盐敏感品种M82杂交产生F1杂种。(2)F1自交产生1338个F2单株，分离每个F2单株的基因组DNA，利用耐盐亚渐渗 系IL7-5-5上的侧翼标记SSR285筛选1338株F2单株，根据差异性标记建立了一个255株 的F2重组群体。(3)根据已有方法(宋建，上海交通大学学报(农业科学版)，2006，24(6) 524-528 ；吴玉辉，中国农学通报，2008，24(4) :80_84 ；雷娜，东北农业大学学报，2008， 39(3) :29-33)，分离亲本IL7-5-5与M82的DNA，利用微卫星(SSR)、酶切扩增多态性序列 (CAPS)和扩增片段长度多态性(AFLP)引物对俩亲本进行PCR扩增，扩增产物(SSR、AFLP) 或经相应内切酶消化后的扩增产物(CAPS)，在6%变性聚丙烯酞胺凝胶(SSR、AFLP)和 1.5%琼脂糖凝胶(CAPS)上电泳分离。结果从2对SSR引物中获得了 1对具有多态性标记 的引物，即SSR285，参见附图1。从4对CAPS引物中获得了 2对具有多态性标记的引物，即 U231219和C2_At4g30580，参见附图2和附图3，相应的消化内切酶分别为Cfo I和RsaI。 从10对AFLP引物中获得了 2对具有多态性标记的引物，即E35/M49和E39/M50，参见附图 4和附图5。利用这些在两个亲本IL7-5-5与M82之间具有扩增多态性的引物，对255个F2 重组单株进行分析，获得分子标记多态性数据。(4)基于遗传连锁交换定律，用分子标记分析资料构建番茄遗传图谱，将获得的多 态性数据采用软件Joinmap4. 0，设定LOD ^ 3.0,使用Kosambi函数构建IL7-5-5的遗传连 锁图谱。(5)苗期耐盐鉴定2009年春天在温室进行，将1338个F2单株的种子播种在按体 积比计的草炭、珍珠岩、蛭石以1 1 1的混合基质中，按常规温室管理。待幼苗长到4片 真叶时，将幼苗根部的草炭、珍珠岩和蛭石清洗干净，然后移栽到盛有1/2浓度的Hoagland 标准营养液。每一个塑料容器15株，每一个塑料容器包括至少1株M82作为对照，日补充空 气三次、每次30分钟，并每隔两天将蒸发掉的水分用无离子水补充到原体积，一周后开始 加盐。每天按50mM NaCl+5mM CaC12增加盐浓度，直至终盐浓度达到700mM NaCl+70mMCaC12为止。当盐浓度达到终浓度后第12天调查耐盐级数，根据盐害的萎黄、坏疽、枯萎不同症 状，按照耐盐程度分为0-10个等级。具体分级标准如下；0级完全致死。1级植株叶枯萎， 茎干直立。2级植株叶枯萎，茎干直立且绿色。3级植株叶一半萎黄，一半枯萎。4级植 株叶大部分萎黄，有少许萎缩绿叶。5级植株叶1/3绿色、2/3萎黄，绿叶萎缩严重。6级 植株叶一半绿，一半萎黄，绿叶有萎缩。7级植株叶2/3叶绿色、1/3萎黄，绿叶有萎缩。8 级叶全绿色，有萎缩。9级叶全绿色，有轻微萎缩。10级植株健康，没有任何盐害症状。根据耐盐分级结果，计算每个单株的耐盐成活率(SP)，其值用于统计分析和QTL 定位。耐盐成活率公式如下耐盐成活率％ (SP)=级数/IlX 100为遗传分析的需要，划定耐盐(SP彡45% )，耐敏感(SP < 45% )0(6)综合遗传图谱数据和耐盐性鉴定资料，QTL分析采用MapQTL 4. 0软件，选择单 区间作图法(Single interval mapping, SIM)找到确定的QTL及与其紧密连锁的分子标 记。利用“Permutation Test”命令，估计连锁片段在α = 0. 05水平上的LOD阈值。以连 锁片段上LOD值最高的位置作为QTL的位置。估计QTL的贡献率和可解释的表型变异率。 分析发现在连锁片段上标记U231219和SSR285之间存在一个QTL位点，与标记U231219、 Ε35/Μ49、Ε39/Μ50 和 SSR285 之间的连锁距离分别为 0. 36cM、0. 46cM、0. 48cM 和 0. 54cM，而 与标记C2_At4g30580共分离，参见附图6。其LOD值为8. 1，解释了 22%的遗传变异率，见 表1，表明SSR285、U231219、E35/M50和E39/M49标记与IL7-5-5的苗期主效耐盐QTL紧密 连锁，且C2_At4g30580标记与IL7-5-5的苗期主效耐盐QTL共分离。可用于番茄苗期耐盐 品种和品系的耐盐性预测。表1 IL7-5-5片段上苗期耐盐主效QTL分析
染色体QTL片段LOD连锁区间贡献率％Stq7b7-5-58.1U231219- SSR28522.0实施例二 根据现有技术，采用宋建，上海交通大学学报(农业科学版)，2006，24(6) 524-528 ；吴玉辉，中国农学通报，2008，24 (4) :80_84 ；雷娜，东北农业大学学报，2008， 39(3) :29-33，选取在两个亲本IL7-5-5与M82之间具有扩增多态性的SSR、CAPS和AFLP引 物组合。经PCR扩增后，扩增产物在1. 5%琼脂糖凝胶和6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分 离后，获得的多态性标记，分别获得的多态性标记为SSR引物SSR285，CAPS标记U231219和 C2-At4g30580, AFLP 标记 E35/M49 和 E39/M50。采用的引物序列分别为SSR285 上游引物为 5 ‘ AGTGGCTCTCACCTACTGCG ‘ 3，下游引物为 5' CAATTCTCAGGCATGAAACG‘ 3 ；U231219 上游引物为 5 ‘ AGTCTCTTGCTTGAGTCTGGAGTTG ‘ 3，下游引物为5' TGCTGGGAATATAATCAGCAAGG‘ 3 ；C2-At4g30580 上游引物为 5' TCAGCCGGTGCTGCTTATCCAC‘ 3，下游引物为 5' TGA TGAACTTGAAGTTTCTCCCAAGAG‘ 3 ；AFLP 引物 E35/M49 组合上游引物 E35 为 5' GACTGCGTACCAATTCACA‘ 3，下游引物 为 M49 为 5' GATGAGTCCTGAGTAACAG‘ 3 ；E39/M50 组合上游引物 E39 为 5 ‘ GACTGCGTACCAATTCAGA‘ 3，下游引物为 M50 为 5' GATGAGTCCTGAGTAACAT‘ 3。扩增产物SSR和AFLP或经相应内切酶消化后的扩增产物CAPS，在6%变性聚丙烯 酞胺凝胶SSR、AFLP和1. 5%琼脂糖凝胶CAPS上电泳分离后，获得分子标记多态性数据。结 果从2对SSR引物中获得了 1对具有多态性标记的引物，即SSR285。从4对CAPS引物中 获得了 2对具有多态性标记的引物，即U231219和C2_At4g30580，相应的消化内切酶分别 为Cfo I和Rsa I。从10对AFLP引物中获得了 2对具有多态性标记的引物，即E35/M49和 E39/M50。实施例三与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记在F2分离群体中的验证将获得的与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记，在IL7-5-5与M82杂 交的F2代的部分植株进行了苗期耐盐性预测，先从它们的叶片中分离DNA，然后利用标记 SSR285、C2_At4g30580、U231219、E35/M49 和 E39/M50 的引物对这些 DNA 进行 PCR 扩增，并 通过评判图谱来确定是否存在相应的标记，存在耐盐主效QTL异侧的3个以上分子标记，说 明该株系是属于苗期耐盐的株系，不存在则是盐敏感的材料。然后基于这些判断准则对每 个番茄植株的苗期耐盐性进行预测。随后利用加盐水培的方法测定受测样品的苗期实际耐 盐性并与预测结果进行对比。结果见表2，预测结果与实测结果吻合度达到100%。表2 用与苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记预测分离后代(F2)的苗期耐盐 性
林系 名称
ST-03 ST-07
预测结果
SSR285
ST IQ
C2_At4g 30580
U231219
E35/M49
E39/M50
苗期耐
盐性
盐敏感 盐敏感
盐敏感
实际结果
耐盐成
活率
9.09 18.18
权利要求
一种与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记的获得方法，其特征在于，所述的获得方法包括以下步骤(1)以野生番茄S.pennellii LA716的76个渐渗系中苗期耐盐渐渗系IL7 5为材料，此渐渗系群体是以盐敏感普通番茄S.lycopersicum M82为遗传背景，耐盐渐渗系IL7 5的亚渐渗系IL7 5 5与IL7 5含有相同的耐盐QTL；(2)番茄苗期盐敏感品种M82(母本)和番茄苗期耐盐渐渗系IL7 5(父本)杂交，得到杂种F1；(3)由杂种F1自花授粉获得1338株F2单株，提取每个F2单株的基因组DNA；(3)苗期耐盐鉴定，盐胁迫处理12d后开始调查盐害情况，根据盐害的萎黄、坏疽、枯萎不同程度，将盐害划分为0 10个等级，并根据耐盐分级情况，将分级数转换为耐盐成活百分率；(4)选取在耐盐亚渐渗系IL7 5 5与盐敏感品种M82之间具有扩增多态性的SSR、CAPS和AFLP引物组合；扩增产物SSR、AFLP或经相应内切酶消化后的扩增产物CAPS，在6％变性聚丙烯酞胺凝胶SSR、AFLP和1.5％琼脂糖凝胶CAPS上电泳分离后，获得多态性分子标记；(5)以已获得的IL7 5 5上的侧翼标记SSR285筛选1338株F2单株，根据差异性标记建立了一个255株的F2重组群体；(6)根据已获得的在IL7 5 5与M82之间具有多态性的4个特异性标记U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49，对255个F2重组群体进行遗传分析，获得分子标记资料；(7)将255株的F2重组单株的耐盐成活率与番茄遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，以3.0为LOD阀值，确定与番茄苗期耐盐主效QTL连锁的分子标记SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49。
2.如权利要求1所述的与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记的获得方法，其 特征在于，所述的多态性分子标记中，引物序列分别为SSR285 上游引物为 5' AGTGGCTCTCACCTACTGCG‘ 3，下游引物为 5' CAATTCTCAGGCATGAAACG‘ 3 ；U231219 上游引物为 5' AGTCTCTTGCTTGAGTCTGGAGTTG‘ 3，下游引物为 5' TGCTGGGAATATAATCAGCAAGG‘ 3 ；C2_At4g30580 上游引物为 5' TCAGCCGGTGCTGCTTATCCAC‘ 3，下游引物为 5' TGATGAACTTGAAGTTTCTCCCAAGAG‘ 3 ；AFLP 引物 E35/M49 组合上游引物 E35 为 5' GACTGCGTACCAATTCACA‘ 3，下游引物为 M49 为 5 ‘ GATGAGTCCTGAGTAACAG ‘ 3 ；E39/M50 组合上游引物 E39 为 5 ‘ GACTGCGTACCAATTCAGA ‘ 3，下游引物为 M50 为 5 ‘ GATGAGTCCTGAGTAACAT ‘ 3。
3.如权利要求1所述的与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记的获得方法，其 特征在于，所述的多态性分子标记中，CAPS标记U231219和C2_At4g30580相应的消化内切 酶分别为Cfo I和Rsa I。
全文摘要
本发明公开了与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记的获得方法。通过番茄苗期耐盐主效QTL定位；选择番茄苗期的M82和耐盐渐渗系IL7-5杂交，得到杂种F1自花授粉获得群体F2，通过盐胁迫处理，筛选耐盐亚渐渗系7-5-5和盐敏感品种M82之间具有多态性的分子标记；利用已筛选的IL7-5-5上的侧翼标记对F2群体进行筛选，建立重组F2群体和遗传分析；通过耐盐成活率与遗传连锁图中的标记检测，确定了与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记。本发明不受环境条件的影响，对特定苗期耐盐材料的后代及衍生品系在早代进行筛选，节约成本，提高育种和选择效率。
文档编号C12N15/10GK101974511SQ20101027444
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者余庆辉, 帕提古丽, 杨涛, 杨生保, 王柏柯 申请人:新疆农业科学院园艺作物研究所