专利名称：防治番茄青枯病的真菌菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及蔬菜病害生物防治技术领域，尤其涉及一种防治番茄青枯病的真菌菌 剂及其制备方法。
背景技术：
番爺青枯病是由爺青枯拉尔氏菌[Ralatonia solanacearum(smith) Yabuuchi et al]引起的，在世界范围内广泛传播的毁灭性土传病害，热带、亚热带的国家和地区，如南 美洲、日本、印度、菲律宾，我国台湾、广东、浙江、福建、江苏、湖北、四川、重庆等地区严重发 生。该病可造成植株大面积萎蔫死亡，一般田块发病率为10% 15%，重病田发病率高达 80% 98. 5%，导致番茄产量严重下降，造成重大的经济损失。R. solanacearum是一种土壤习居菌，能够在无寄主情况下的土壤中存活很长时 间。R. solanacearum主要从根系侵入植株，也可从茎部伤口侵入并直接进入导管系统，在其 中大量繁殖并产生代谢物质，阻碍植物体内水分运输，造成植株萎蔫。目前，针对番茄青枯 病还缺少有效的化学药剂，加之青枯菌对化学农药易产生抗药性，而且大量使用化学农药 会造成环境污染和生产成本上升。休耕期撒施石灰可减轻病害发生，但易造成土壤板结。抗 病育种工作，由于缺乏理想的抗源材料，进展缓慢。水早轮作要求轮作年限较长，且只有在 附近无其它宿主存在的情况下方可起到良好的效果，因而实施起来较困难。土壤灭菌后形 成了土壤生物真空，一旦土壤受到病原菌侵染，会导致病原菌的大爆发而造成更为严重的 后果。生物防治作物病害具有可利用资源丰富、成本低廉、能够避免环境二次污染等优点， 被认为是解决土传病害的一条有希望的技术途径。其中，利用拮抗微生物进行病害防治是 生物防治中的一个重要发展方向。市场上已有一些利用病原菌拮抗菌防治植物病害的微生 物菌剂、菌肥等产品，也有一些番茄青枯病生物防治的报导，但是目前还未见一家产品田间 应用效果好、防效稳定的报导。而且微生物菌剂、菌肥使用效果受环境条件影响较大，不同 环境条件来源的菌种适应范围有限。本发明菌剂中应用的菌株从浙江丽水地区番茄种植地 分离而得，对浙江省及气候环境条件相近的省份可能具较强的适应性。
发明内容
本发明目的在于，针对番茄青枯病缺少有效的化学药剂，加之青枯菌对化学农药 易产生抗药性的缺陷，提出一种能有效防治番茄青枯病的真菌菌剂；本发明的另一目的是 提出该菌剂简易、低成本的制备方法；本发明的再一目的是提出该菌剂简单、有效的应用方法。本发明目的通过以下技术方案来实现。一种 Trichoderma gamsii 菌株 6-18 的筛选与鉴定一、2008年，从浙江嘉善、丽水、杭州等番茄种植基地采集到21个土样，利用马丁 氏培养基进行培养、分离，共分离到真菌270余株；然后进行平板拮抗试验，从中筛选到对 番茄青枯病茄青枯拉尔氏菌有较好拮抗效果的初筛真菌15株；通过盆栽试验，从浙江丽水采集的土样中进一步筛选得到对番茄青枯病茄青枯拉尔氏菌具有稳定拮抗效果的复筛菌 株6-18 ；二、菌株6-18的形态特征、培养特征及基因测序1.菌落形态、显微形态及培养特征菌株6-18在PDA培养基上菌落生长较快，黑暗条件下，25°C培养3天菌落直径为 40-50mm ；菌落呈白色，平铺，絮状；背面无色素，有明显泥土气味；菌丝有隔膜，直径2_10微 米，形成球形厚垣孢子(见图1)，壁光滑，直径6-14微米，未观察到分生孢子。2、菌株6-18的rRNA基因序列测定包括18S rRNA片段，ITSU5. 8S rRNA、ITS2的全序列及28S区序列片断(测序引 物:ITS4)5’ -TCAACATTTCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTTGTGCA AACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGGATCCCGTCTTAGGGGTTCCCGAT CCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGG GCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCT TCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAGAAA TAACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAAGAGTTTGGTTGGTCCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCA CCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTATGGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGAT CCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTAC 3’三、菌株6-18的鉴定与保藏上述资料寄中国科学院微生物研究所，根据该菌株6-18的形态特征、培养特征和 基因测序进行分类，鉴定为Trichoderma gamsii (该菌种尚未定中文名称)。Trichoderma gamsii菌株6-18已于2009年10月9日在北京由中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号=CGMCC No. 3335。一种防治番茄青枯病的真菌菌剂，该菌剂以保藏编号CGMCC No. 3335的 Trichoderma gamsii菌株6_18为菌种，马丁氏固体培养基为斜面培养基，马铃薯蔗糖液体 培养基为摇瓶菌种培养基和发酵罐培养基；经各级发酵、制备成液体真菌菌剂，或以灭菌麸 皮或灭菌草炭为吸附剂进一步制备成固体真菌菌剂而获得。一种防治番茄青枯病真菌菌剂的制备方法，该方法按以下步骤进行(1)各级培养基的配制与吸附载体的准备，其中a)斜面培养基马丁氏固体培养基，备用；b)摇瓶菌种培养基马铃薯蔗糖液体培养基，备用；c)生产发酵罐培养基同摇瓶菌种培养基，备用；(2)斜面菌种培养将CGMCC No. 3335菌株6_18接种于步骤(1)斜面培养基上， 在28-32°C的培养箱中培养3-4天，取出后直接应用或放入冰箱中冷藏，保存；(3)摇瓶菌种扩繁在无菌操作下，取一铲斜而菌种接入60ml步骤(1)马铃薯蔗 糖液体培养基中，于28-32°C，120-220转/分的摇床中，培养40-64小时，取出直接应用或 放入冰箱中冷藏，保存；(4)生产发酵罐培养将步骤(1)生产发酵罐培养基放入发酵罐中，在该罐内 温度121 V，进行30分钟蒸汽高温灭菌后，在保持罐体压力0. 02-0. 04MPa条件下，冷却步骤(3)摇瓶菌种按3-10%的接种量迅速 接入发酵罐内；在搅拌机转速120-220转/分，温度28-32 °C，通气量4m3/h，罐压保持 0. 02-0. 04MPa,pH自然，培养40-64小时，至发酵液菌丝体鲜重为0. 5g/ml以上，装瓶，即为 液体真菌菌剂；(5)固体菌剂的制备先将吸附载体麸皮或草炭进行高温灭菌后冷却至室温；再 将步骤(4)液体真菌菌剂与灭菌后吸附载体按重量1 5比例拌勻，吸附，检测其活菌量为 0. 2亿cfu/g以上、含水率控制在30%以下，装袋、封口，即为固体真菌菌剂。上述防治番茄青枯病真菌菌剂的应用方法是(1)液体菌剂番茄育苗至移栽前1星期，在育苗盘中按每株l_5ml菌剂量稀释至 1-10倍后灌根；番茄苗盆栽或地栽后，按每株I-IOml菌剂量稀释至10-100倍后灌根一次， 10天后再以相同菌剂量补灌一次；(2)固体菌剂番茄育苗至移栽前1星期，在育苗盘中按每株5_25g菌剂量撒在根 部，并洒适量水以使生防菌能渗入土中；番茄苗盆栽或地栽后，按每株5-50g菌剂量撒根， 并浇灌适量水；10天后再按相同菌剂量补用一次；(3)无论液体或固体真菌菌剂均应选择在晴天使用； (4)在使用菌剂期间均应避免在植株根部使用消毒剂、杀菌剂及抗生素类药物。本发明的有益效果是一、本发明首次采用Trichoderma gamsii菌为菌种，经发酵制备成液体或固体菌 剂后，为番茄青枯病的防治提供了一种新的有效途径；二、本菌剂通过防治番茄青枯病的盆栽试验后表明，能使番茄青枯病发病率明显 下降，在移栽后15天，本菌剂防病效果达50%以上，至试验结束时(移栽后37天)，本菌剂 仍能保持有一定的防病效果(见实施例6)。三、使用本菌剂后可以推迟番茄青枯病的发病时间，降低发病程度，可减少农药的 使用量，既减轻经济损失，又可减少农药对环境的污染；四、本发明制备菌剂所采用的土豆、麸皮和草炭等原料来源丰富，发酵工艺较简 单，生产成本较低廉，该菌剂有效保质期在半年以上。
图1菌株6-18的菌丝体及厚垣孢子显微摄影图；图2菌株6-18对番茄青枯病菌平板拮抗试验效果摄影图；图3菌株6-18液体菌剂对番茄青枯病的盆栽生防对比效果曲线图。其中，图3为摘要附图。
具体实施例方式通过以下实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明，但以下实施例仅是说 明性的，本发明并不受这些实施例的内容所限制。对所涉材料的说明番茄青枯病茄青枯拉尔氏菌浙江省农业科学院蔬菜研究所分离、保存；蛋白胨生化制剂，国产；
Yeast extract (酵母浸膏)生化试剂，国产；Casein hydrolysate (洛蛋白水解物)生化试剂，国产；琼脂生化试剂，国产；K2HPO4 分析纯，国产；葡萄糖分析纯，国产；MgS047H20 分析纯，国产；孟加拉红(Rose Bengal)分析纯，国产；链霉素分析纯，国产。实施例1 (真菌分离纯化)1培养基马丁氏(Martin)培养基=KH2PO4LOg,葡萄糖 10. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g，蛋白胨 5. 0g，琼脂15-20g，水1000ml ；此培养液IOOOml加孟加拉红水溶液3. 3ml ；112. 6°C灭菌 30分钟；临用时每IOOml培养基中加链霉素液0. 3ml (30ppm)；2试验步骤2. 1培养基制备配制马丁氏培养基，制备真菌斜面；2. 2 土壤稀释液的制备(1)称取IOg 土壤，加入IOOml带有玻璃珠的无菌水于500ml三角瓶中，振荡15分 钟，即10-1 ；(2)吸取土悬液10ml，加入90ml无菌水于500ml三角瓶中，S卩1(Γ2 ；(3)从(2)中吸取10ml，加入90ml无菌水于500ml三角瓶中，即10_3 ；2. 3真菌分离(4)从(1) (2) (3)中分别吸取0. 1ml，加入到马丁氏(Martin)培养基平板中进行 涂布培养(28-30 °C、3-5天)，各3个重复；(5)选择20-200菌落数的培养皿，挑取菌落进行斜面培养(28_30°C，3_5天)；2. 4 多个土样(6)共21个土样，每个土样重复上述2. 1 2. 3步骤；2. 5结果分离到真菌270多株。实施例2 (分离真菌对番茄青枯病茄青枯拉尔氏菌平板拮抗试验)1.培养基1. 1固体培养基青枯病菌培养基配制MgS047H200. 3g，K2HP042. 0g，酵母浸膏4. 0g，洛蛋白水解物 8. 0g，蔗糖 10. 0g，琼脂 18g，蒸馏水 1000ml ；马丁氏培养基配制同实施例1中2. 11. 2液体培养基
0074]番茄青枯病菌液体摇瓶培养基；青枯病菌培养基不加琼脂即可；2、试验步骤2. 1培养基制备配制青枯病菌培养基(固体、液体)，制备病原菌茄青枯拉尔氏菌斜面；配制马丁氏培养基(固体)，制备真菌斜面；
2. 2平板拮抗试验2. 2. 1菌种活化将番茄青枯病菌和真菌(实施例1的分离菌)进行菌种活化；2. 2. 2制备青枯病菌平板活化青枯病菌接入液体培养基中进行摇瓶培养， 28-30200转/分，隔天以青枯病菌培养基倒平板，凝固后每个平板中加入0. Iml青枯病 菌发酵液(发酵约40小时)，涂布，28-30°C培养过夜，备用；2. 2. 3准备分离真菌斜面活化分离真菌接入斜面进行培养，28-30°C，培养3-5天，备用；2. 2. 4平板拮抗试验用灭菌接种铲挖一块带分离真菌的琼脂块放入青枯病菌平 板，每个平板放5株不同拮抗真菌，3个重复；24h左右观察实验结果，主要考察抑菌圈有无 及大小；3、结果通过平板拮抗试验得到拮抗效果较好的真菌共15株，其中，菌株6-18的 拮抗效果最优(图2菌株6-18拮抗效果)，故选菌株6-18作为制备菌剂的出发菌株。实施例3 (菌株6-18发酵固体菌剂制备1)按以下步骤进行(1)各级培养基的配制，其中a)斜面培养基马丁氏固体培养基(同实施例1)，备用；b)摇瓶菌种培养基马铃薯蔗糖液体培养基，备用；c)生产发酵罐培养基同摇瓶菌种培养基，备用；马铃薯蔗糖液体培养基20%马铃薯浸出液IOOOml+蔗糖20g ；其中，20%马铃薯 浸出液的制备称取去皮马铃薯块200g，加水IOOOml煮至马铃薯块能被玻棒戳破为止，过 滤，补足原来的水量。(2)斜面菌种培养将CGMCC No. 3335菌株6_18接种于步骤(1)斜面培养基上， 在28-32°C的培养箱中培养3-4天，取出后直接应用或放入4-7°C冰箱中冷藏，保存；(3)摇瓶菌种扩繁在无菌操作下，取一铲斜面菌种接入60ml步骤(1)马铃薯蔗 糖液体培养基中，于28-32 °C，120转/分的摇床中，培养40小时，取出直接应用或放入冰箱 中冷藏，保存；(4)生产发酵罐培养将步骤(1)生产发酵罐培养基放入发酵罐中，在罐内温度 121°C，进行30分钟蒸汽高温灭菌后，在保压0. 02-0. 04MPa下冷却至28_32°C ；在火焰保护 下通过接种阀门将步骤(3)摇瓶菌种按3%的接种量迅速接入发酵罐内；在搅拌机转速220 转/分，温度28-32°C，通气量4m3/h，罐压0. 02-0. 04MPa, pH自然下，培养64小时，发酵液 菌丝体鲜重为O. 5g/ml以上，装瓶，即为液体真菌菌剂；(5)固体菌剂的制备先将吸附载体麸皮在121°C、0. IMPa，灭菌30分钟后冷却至 室温；再将步骤(4)液体真菌菌剂与灭菌后麸皮按重量1 5比例拌勻，吸附，检测其活菌 量为0. 2亿cfu/g以上、含水率控制在30%以下，装袋、封口，即为固体真菌菌剂。实施例4 (菌株6-18发酵液体菌剂制备2)本例中，步骤(3)摇瓶菌种扩繁中于28_32°C，170转/分的摇床中，培养52小 时；步骤(4)生产发酵罐培养中在保压0. 02-0. 04MPa下冷却至28_32°C ；按6%的接种量 迅速接入发酵罐内；在转速170转/分，温度28-32 °C，通气量4m3/h，罐压0. 02-0. 04MPa,培养52小时，发酵液菌丝体鲜重为0. 5g/ml以上，装瓶，即为本例的最终产品-液体真菌菌 剂；其余步骤、工艺同实施例1。实施例5 (菌株6-18发酵固体菌剂制备3)本例中，步骤(3)摇瓶菌种扩繁中于28_32°C，220转/分的摇床中，培养64小时； 步骤(4)生产发酵罐培养中在保压0. 02-0. 04MPa下冷却至28_32°C ；按10%的接种量迅 速接入发酵罐内；在转速120转/分，温度28-32°C，通气量4m3/h，罐压0. 02-0. 04MPa,培养 40小时，发酵液菌丝体鲜重为0. 5g/ml以上；步骤(5)固体菌剂的制备将步骤(4)液体真 菌菌剂与灭菌后草炭按重量1 5比例拌勻，吸附，即为固体真菌菌剂；其余步骤、工艺同实 施例1。实施例6 (菌株6-18液体菌剂对番茄青枯病的盆栽生防效果对比试验)1、育苗1. 1育苗基质、马铃薯蔗糖液体培养基和青枯病原菌液体培养基准备育苗基质草炭蛭石珍珠岩=7 1 0.5，然后用自来水调节含水率至 60% 70%，备用；马铃薯蔗糖液体培养基同实施例3青枯病原菌液体培养基同实施例2中的1. 2，备用；1.2播种在育苗穴盘(规格90 X 60)中装入四分之三高左右的1. 1制备基质，用 手轻压，然后每穴中均勻撒入50颗蕃茄种子，再铺上一层薄薄的基质，并用塑料膜盖住穴 盘，防止水分蒸发，备用；1. 3出苗把1. 2准备好的播种穴盘放入人工气候箱培养，温度25°C，放入大盆水 保湿，打开日光灯，18点以后关掉，并保证日夜温差在10°C以上；4 5天后出苗，掀掉塑料 膜，培养至两子叶平展，备用；2、苗移入穴盘中培养2.1苗移栽在穴盘(规格45X45)每穴中装满按1. 1制备基质(略压紧)，然后每穴中移入 1株1. 3准备好的两子叶平展苗，两指在根部略压紧，在大棚中培养；培养至3 4片真叶 (大约3 4周)；2. 2番茄青枯病菌和菌株6-18发酵液的准备番茄青枯病菌和菌株6-18的活化，然后每株接液体摇瓶培养，28 30°C，200转/ 分钟，约培养40小时后，备用；2. 3预用菌株6-18发酵液苗移栽入盆前1个礼拜，每穴中加入5ml菌株6-18发酵液；3、盆栽3.1盆栽土准备年前从浙江丽水番茄种植基地青枯病发病严重的地块挖2 4吨土，备用；3. 2 土装盆称取适量的3. 1准备土，混入2%有机肥，每盆(规格280X220)中装入4. 5公斤 混土，备用；3. 3 移栽每盆中移栽5株番茄苗，根据需要补充水分；本试验设3个处理，即CKl和CK2及
8处理1，每个处理6盆，每盆5株苗，均勻分布；其中，CKl 移栽时不加任何菌；CK2 移栽时每株只浇50ml番茄青枯病菌稀释发酵液 (稀释1000倍)；处理1 移栽时每株根部先浇50ml番茄青枯病菌稀释发酵液(稀释1000 倍)，然后再浇50ml拮抗菌-菌株6-18稀释发酵液(稀释10倍)；3. 4记录每天记录每盆发病株数；4、结果由表1与图3可以看出，CKl自始至终无发病株；CK2从2009年5月21日开始发 病，到2009年5月21日发病株数达到24株；处理1从2009年5月21日开始发病，到2009 年5月31日发病株数只有11株，说明菌株6-18对番茄青枯病具一定防效，虽然到观察结 束，处理1仍比CK2发病株少，但到后期其防效已不明显，可能随着番茄青枯病菌的大量繁 殖，菌株6-18的拮抗效果已逐步转弱，无法防控。因此使用本菌株6-18进行青枯病防治时， 后期应补用菌株6-18制品效果会更好。表1番茄青枯病菌拮抗效果试验记录(发病株数)(试验时间2009年5月17日至2009年6月22日) 注CK1_不加任何菌，CK2-只加青枯病原菌，处理1-加青枯病原菌及6-18菌。
权利要求
一种Trichoderma gamsii菌株6 18，其菌株保藏号为CGMCC NO.3335。
2.一种防治番茄青枯病的真菌菌剂，其特征在于该菌剂以保藏编号为CGMCCNo. 3335 的Trichoderma gamsii菌株6_18为菌种，马丁氏固体培养基为斜面培养基，马铃薯蔗糖液 体培养基为摇瓶菌种培养基和发酵罐培养基；经各级发酵、制备成液体真菌菌剂，或以灭菌 麸皮或灭菌草炭为吸附剂进一步制备成固体真菌菌剂而获得。
3.一种防治番茄青枯病真菌菌剂的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行(1)各级培养基的配制与吸附载体的准备，其中a)斜面培养基马丁氏固体培养基，备用；b)摇瓶菌种培养基马铃薯蔗糖液体培养基，备用；c)生产发酵罐培养基同摇瓶菌种培养基，备用；(2)斜面菌种培养将CGMCCNo. 3335菌株6_18接种于步骤(1)斜面培养基上，在 28-32°C的培养箱中培养3-4天，取出后直接应用或放入冰箱中冷藏，保存；(3)摇瓶菌种扩繁在无菌操作下，取一铲斜面菌种接入60ml步骤(1)马铃薯蔗糖液 体培养基中，于28-32°C，120-220转/分的摇床中，培养40-64小时，取出直接应用或放入 冰箱中冷藏，保存；(4)生产发酵罐培养将步骤(1)生产发酵罐培养基放入发酵罐中，在该罐内温 度121 °C，进行30分钟蒸汽高温灭菌后，在保持罐体压力0. 02-0. 04MPa条件下，冷却 至28-32°C ；在火焰保护下通过接种阀门将步骤(3)摇瓶菌种按3-10%的接种量迅速 接入发酵罐内；在搅拌机转速120-220转/分，温度28-32 °C，通气量4m3/h，罐压保持 0. 02-0. 04MPa,pH自然，培养40-64小时，至发酵液菌丝体鲜重为0. 5g/ml以上，装瓶，即为 液体真菌菌剂；(5)固体菌剂的制备先将吸附载体麸皮或草炭进行高温灭菌并冷却至室温；再将步 骤(4)液体真菌菌剂与灭菌后吸附载体按重量1 5比例拌勻，吸附，检测其活菌量为0.2 亿cfu/g以上、含水率控制在30 %以下，装袋、封口，即为固体真菌菌剂。
全文摘要
本发明公开了防治番茄青枯病的真菌菌剂及其制备方法，属于蔬菜病害生物防治技术领域。该菌剂以CGMCC No.3335的Trichoderma gamsii菌株6-18为菌种，马丁氏固体培养基为斜面培养基，马铃薯蔗糖液体培养基为摇瓶菌种培养基和发酵罐培养基；经各级发酵、制备成液体或固体真菌菌剂而获得。本发明首次采用Trichoderma gamsii菌为菌种，经发酵制备成菌剂后，为番茄青枯病的生物防治提供了一种新的有效途径；其防病效果达50％以上，既可减少常规农药的使用量，又可减少对环境的污染，且其原料丰富，发酵工艺简单，生产成本低廉。本发明可在番茄种植地区及农药制造企业推广应用。
文档编号C12R1/885GK101914449SQ20101010707
公开日2010年12月15日 申请日期2010年2月8日 优先权日2010年2月8日
发明者吴传珍, 奚辉, 朱凤香, 杨友坤, 洪春来, 王卫平, 薛智勇, 陈晓旸 申请人:浙江省农业科学院