专利名称：能防治茄子青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料的制作方法
技术领域：
本发明涉及能防治茄子青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术，专用于防治茄子青枯病问题。背景技术：
茄子青枯病是由茄科劳尔氏菌Ofehtoflia solanacearum)侵染所致，是一种细菌性土传疾病。茄子在世界各地均有栽培，茄子青枯病已成为影响茄子高产的主要障碍，在我国，主要是长江流域普遍受其为害，一般可减产20 9Γ30 %，严重时损失50 9Γ60 %。特别是近年来随着蔬菜生产集约化程度的提高，该病已成为茄子的主要病害，而且很难根除，迄今为止还没有发现有效的杀菌剂。另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等，使大量的养分资源流失于土壤-植物系统之外，不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥生产原料的有机物资源，不利于我国农业的可持续发展。如何将从土壤中因作物收获而取走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥料再施入土壤。将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用作功能菌的载体，制成功能明确的微生物有机肥料， 具有广阔的应用前景。三
发明内容
1.技术问题
本发明的目的在于研制一种能防治茄子青枯病的微生物有机肥料，对茄子青枯病的防治效率达到80%以上，使大量的茄子连作障碍土壤得到生物修复，确保集约化农业的顺利发展。技术方案
一株能克服或消除连作茄子青枯病的拮抗菌菌株II-36，属于枯草芽孢杆菌iBacillus subtilis\保藏日期2010年9月14日，保藏号分别为CGMCC NO. 4158 ；地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。菌株11-36的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，过氧化氢酶阳性，淀粉水解阳性，V. P.反应阳性，甲基红试验阴性，纤维素分解阴性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阳性，能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵L-阿拉伯糖、甘露糖只产酸。用上述能防治茄子青枯病的拮抗菌菌株11-36所生产的微生物有机肥料中拮抗菌含量达IXlO8 cfu · g—1以上，全氮含量为4 5% (90%以上为有机氮)，总氮磷钾养分为 6 10%、有机质含量为30 35%。其生产方法包括
1)将拮抗菌II-36接种到改良牛肉膏液体培养基，分别进行发酵生产，发酵生产的条件为培养温度范围3(T35°C，搅拌速度为18(T300 rpm，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量> IXIOki Cfu-HiF10所用改良牛肉膏培养液配制方法为玉米粉5g，牛肉
3膏2g，氯化钠5g，麸皮5g，土豆淀粉5g，定容至1000 ml, pH值调至7. 2-7. 4，121°C灭菌20
min。2)将拮抗菌菌株11-36与腐熟后的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50°C，一般发酵5天后结束，使拮抗菌含量达到1 X IO8 cfu .g-1以上，获得猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物的拮抗菌11-36微生物有机肥料。其中
腐熟后的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1. 2-2%，含水量质量比25-30%。菜粕的微生物酶解物制备方法为，将保藏号为CGMCC NO. 1543的嗜麦芽寡养单 rnMQStenotrophomorms maltophiIia)菌株37_1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量 55-65%和pH 6. 0-7. 5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50°C共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和PH，使它们分别维持在55-65%和6. 0-7. 0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物PH调整为5. 0，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物酶解物；
腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制备方法将腐熟的猪粪堆肥与菜粕微生物酶解物按体积比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2 次。上述微生物有机肥料可专用于防治茄子青枯病。有益效果
本发明涉及能防治茄子青枯病拮抗菌及其微生物有机肥产品，该产品具有如下优点 1)肥料产品中含有抑制茄子青枯病病原细菌生长的专一性高效菌株(11-36)，其抑制效果显著，肥料中该高效菌株的含量达到IXlO8 cfu - g-1以上，施入土壤后能形成优势群， 并在土壤中存活下来。2)肥料产品中含有丰富的可溶性有机碳和有机氮，能给功能菌提供十分优越的生长环境，极大地提高了功能菌在土壤中的定殖和活力。3)本发明产品全磷和全氮含量较高，均达到4%。本产品原料之一为腐熟的猪粪堆肥，全磷和有效磷含量高，在制成的微生物有机肥料产品中无需添加任何含磷化肥，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。本产品原料之一为菜粕微生物酶解物，不仅全氮含量高，而且含有丰富的氨基酸和小分子多肽，确保了肥料氮素持续稳定的供应，使作物生长和抗逆能力大大增强。4)试验结果表明，在青枯病发生严重的土壤上施用本产品后，能显著降低青枯病的发病率，防治效率达80%以上。施用本肥料的土壤，茄子青枯病能够得到有效防治。四
图1拮抗菌株对病原菌(茄科劳尔氏菌)的抑菌圈图2马铃薯盆栽试验各处理的发病率图3马铃薯盆栽各处理的生物量五具体实施方式
(一)菌株的分离和鉴定拮抗菌的获得从茄子青枯病发病田块中的健康茄子植株根际土壤中分离拮抗菌。再通过盆栽试验和大田试验最终复筛出高效拮抗菌菌株11-36，鉴定到属种，菌种于30%甘油中-70°C保存。拮抗菌菌株11-36的抑菌圈如图1所示。拮抗菌菌株11-36属于枯草芽孢杆菌UaciBm subtil is )，其主要生物学特性为革兰氏染色阳性(G+)，细胞形状为杆状，过氧化氢酶阳性，淀粉水解阳性，V. P.反应阳性，甲基红试验阴性，纤维素分解阴性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阴性，能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖只产酸。(二)菌剂生产
1)将拮抗菌菌株11-36接种到改良牛肉膏液体培养基，进行发酵生产，发酵生产的条件为培养温度范围3(T35°C，搅拌速度为18(T300 rpm，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量> IXIOki cfi^mr1。所用改良牛肉膏培养液配制方法为，以配制IL培养基为例称取玉米粉5g，牛肉膏2g，氯化钠5g，麸皮5g，土豆淀粉5g，定容至1000 ml，pH值调至 7. 2-7. 4，121°C 灭菌 20 min。2)将拮抗菌菌株11-36分别与腐熟后的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50°C，一般发酵5天后结束，使拮抗菌含量达到1 X IO8 cfu .g-1以上， 获得猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物的拮抗菌Π-36微生物有机肥料。其中
腐熟后的猪粪堆肥由江苏新天地生物肥料工程中心有限公司提供，本品发芽指数为 98%以上，有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1. 2-2%，含水量质量比25-30%。菜粕的微生物酶解物制备方法为，将保藏号为CGMCC NO. 1543的嗜麦芽寡养单 rnMQStenotrophomorms maltophiIia)菌株37_1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量 55-65%和pH 6. 0-7. 5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50°C共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和PH，使它们分别维持在55-65%和6. 0-7. 0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物PH调整为5. 0，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物酶解物；
腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制备方法将腐熟的猪粪堆肥与菜粕微生物酶解物按体积比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2 次。上述生产的微生物有机肥为用于防治茄子青枯病的微生物有机肥料，其中拮抗菌菌株11-36单菌含量达IXlO8 cfu · g—1以上，全氮含量为4 5% (90%以上为有机氮)，总氮磷钾养分为6 10%，有机质含量为30 35%。(三)盆栽试验
育苗选取健康水稻土作为育苗土。营养钵采用一次性塑料杯，每钵装土 300g，拮抗菌 II-36菌液处理以108cfu/g 土均勻拌入土中，普通有机肥、微生物肥料以洲的施用量(w / w)均勻拌入土中，各处理用化肥等量补齐，设置处理如(表1)，每个处理重复30次。移栽大盆钵每钵装5 kg病原土，病原土采自江苏泰兴连作大棚内(青枯病发病率达到70%以上)。拮抗菌11-36菌液处理以108cfu/g 土均勻拌入病土中，普通有机肥、微生物肥料以0. 5%的施用量(w /V)均勻拌入病土中，各处理用化肥等量补齐，肥料与病原土充分混合均勻。待茄子幼苗长至3-4片真叶时将营养钵中的茄子幼苗移栽到装有茄子青枯病发病土壤的大盆钵中。共设置6个处理，大盆钵各处理与营养钵育苗相同(表1 )，每处理重复15次。该盆栽试验于2010年5月至8月在江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室的温室中进行。自移栽21天时发现青枯病发病植株，随后每天观察植株发病情况，记录发病率。采集各处理的植株土样带回实验室分析测定。
权利要求
1.能防治茄子青枯病的拮抗菌，该菌株11-36，属于枯草芽孢杆菌OfeciBm 仰Mi^s)，保藏日期2010年9月14日，保藏号分别为CGMCC NO. 4158 ；菌株11-36的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，过氧化氢酶阳性， 淀粉水解阳性，V. P.反应阳性，甲基红试验阴性，纤维素分解阴性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阳性，能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵L-阿拉伯糖、 甘露糖只产酸。
2.用权利要求1所述拮抗菌生产的防治茄子青枯病微生物有机肥料。
3.根据权利要求2所述的微生物有机肥料，其特征在于该肥料中拮抗菌菌株含量在 IXlO8 cfu - g-1以上、全氮质量比含量为4飞％，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6 10%，有机质质量比含量为30 35%。
4.权利要求2或3所述微生物有机肥料的生产方法，包括1)将拮抗菌菌株II-36分别接种到改良的牛肉膏液体培养基进行发酵生产，发酵生产的条件为培养温度范围3(T35°C，搅拌速度为18(T300 rpm，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量彡IXlO10 cfu · ml—1 ；2)将拮抗菌菌株11-36与腐熟后的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50°C，一般发酵5天后结束，使拮抗菌含量达到1 X IO8 cfu .g-1以上，获得猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物的拮抗菌II-36微生物有机肥料，其中腐熟后的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1. 2-2%，含水量质量比25-30% ；菜粕的微生物酶解物制备方法为，将保藏号为CGMCC NO. 1543的嗜麦芽寡养单胞 MUtenotrophomonas maltophiIia)菌株37_1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量 55-65%和pH 6. 0-7. 5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50°C共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和PH，使它们分别维持在55-65%和6. 0-7. 0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物PH调整为5.0，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物酶解物；腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制备方法将腐熟的猪粪堆肥与菜粕微生物酶解物按体积比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2 次。
5.根据权利要求4所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤1)所用改良牛肉膏培养液配制方法为玉米粉5g，牛肉膏2g，氯化钠5g，麸皮5g，土豆淀粉5g，定容至1000 ml，pH 值调至 7. 2-7. 4，121°C灭菌 20 min。
6.根据权利要求4或5所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤2)所用腐熟后的猪粪堆肥其发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1. 2-2%，含水量质量比25-30%。
7.权利要求2或3所述微生物有机肥料在防治连作茄子青枯病中的应用。
全文摘要
本发明涉及能防治茄子青枯病的拮抗菌及利用其生产的微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了一株对茄子青枯病病原细菌有显著拮抗作用的拮抗菌(枯草芽孢杆菌II-36)，拮抗菌与有机堆肥制成微生物有机肥料，肥料中拮抗菌含量1×108cfu·g-1以上,全氮含量为4~5%，总氮磷钾养分为6~10%，有机质含量为30~35%。试验表明，这种微生物有机肥料施入土壤后能够使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成优势群，在茄子青枯病严重的连作土壤中对茄子青枯病的防治率达80%以上。施用本微生物有机肥料能有效防治茄子青枯病的发生。
文档编号C12N1/20GK102168046SQ20101060857
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者丁传雨, 乔焕英, 冉炜, 杨兴明, 沈其荣, 陈巍 申请人:南京农业大学, 江苏新天地生物肥料工程中心有限公司