专利名称：一种防治烟草青枯病的方法
技术领域：
本技术涉及烟草的栽培，尤其涉烟草青枯病防治。
背景技术：
烟草青枯病是由Ralstonia solanacearum侵染引起的系统性病害，它是一种典型的维管束病害，最显著的症状是枯萎，一旦发病往往会造成整株死亡，给烟叶生产造成重大经济损失。在烟叶的生产过程中，烟草青枯病的防治有化学药剂防治如链霉素、合理轮作如烟草玉米轮作、种植抗病品种、提前移栽、调整土壤微生物和调整烟苗移栽期、微生物农药如金灭枯、康地蕾(见中国发明专利ZL 02151019. 9)等综合措施，但仍无法有效防止烟草青枯病的发生。涉及烟草青枯病防治最近的专利技术有200810069552. 2号《用于检测烟草青枯病菌的引物、探针及实时荧光PCR试剂盒》、200910104323. 4号《一种综合防治烟草青枯病的方法》、200910183359. 6号《防除连作烟草青枯病的拮抗菌及用其微生物有机肥料》、 201010222337. 9号《用于防除连作烟草青枯病的拮抗菌NJL_14》、201010227467. 1号《利用根特异启动子与抗病基因培育烟草抗青枯病品系方法》、201010227468. 6号《诱导型启动子携带抗病基因培育烟草抗青枯病品系的方法》等。这些技术方案均可用于防治烟草青枯病， 但技术内容比较复杂，实施比较麻烦，效果未必理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、效果理想的防治烟草青枯病的方法，为烟草种植和烟叶生产服务。发明人根据烟草青枯病是典型细菌性维管束病害的特征，寻求专一性噬菌体对烟草青枯菌侵噬作用，通过载体将其植入烟草植株茎基部，即可实现防治烟草青枯病的目的。 所述的噬菌体(英文为bacteriophage或phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称，属于微生物的一种。针对不同的青枯病发病比较重的土地，从理论上讲都能分离出其相应的噬菌体；因此，发明人通过对烟草青枯菌专一性噬菌体的筛选，噬菌体的富集，得到噬菌体的培养液；再选择通常人们使用的牙签作为载体，采用富集培养液中的噬菌体，吸附于无菌的牙签上，利用牙签插入旺长期的烟草植株茎基部防治烟草青枯病。本发明的方法包括(1)烟草青枯菌的培养与纯化取发生了青枯病症状的烟草叶脉，用无菌水浸泡，在TTC固体培养基上划线筛选， 选取粉红色流动性好的单菌落继续在TTC培养基，用平板划线法纯化青枯菌；纯化培养后的青枯菌无菌水在室温下保存；(2)专一性噬菌体的筛选取发生烟草青枯病的植烟土壤，用0. 5mm的筛子过筛，去除土壤中杂物；取过筛后的土壤小颗粒2. 0g，用5. Oml无菌水浸泡过夜，以8000r/min的转速离心IOmin后，取上清液，用0. 22 μ m的滤膜过滤，取滤液20 μ 1与青枯菌液100 μ 1涂于TTC培养基上，在下共同培养，观察噬菌斑，筛选专一性噬菌体，无菌水室温保存，备用；(3)专一性噬菌体的富集培养、收集在灭菌后的500ml三角瓶中，加入300mlTTC液体培养基和30 μ 1含青枯菌的无菌水，在下震荡培养M-30h后，再加入10 μ 1含噬菌体的无菌水，在下继续震荡培养36-4 ；之后以8000r/min的转速离心培养液lOmin，取上清液，用0. 22 μ m的滤膜过滤， 滤液备用；(4)防治烟草青枯病牙签的制备取牙签用无菌水浸泡12 Mh，然后无菌水冲洗两次，高压灭菌后在50°C下烘干， 待冷却至室温后，置于过滤后的滤液中浸泡^h，取出后用封口袋分装好，4°C保存备用；(5)防治烟草青枯病牙签的使用烟草移栽后，在旺长时期，用青枯病牙签插于烟草植株茎基部，防治烟草青枯病。上述第1步中，所述TTC培养基的组成是蛋白胨10g、水解酪朊lg、葡萄糖5g、琼脂 15g、蒸馏水IOOOml ；酸度调节到约pH7. 0，分装，在121°C下灭菌15min ；加过滤灭菌的 2,3,5-氯化三苯基四氮唑的水溶液到灭菌冷却到55°C的培养基中，使终浓度为0. 005%所制成的培养基。上述第3步中，所述TTC培养基的组成是蛋白胨IOg ；水解酪朊Ig ；葡萄糖5g ；蒸馏水IOOOml ；酸度调节到约pH7.0，分装，在121°C下灭菌15min ；加过滤灭菌的2，3， 5-氯化三苯基四氮唑的水溶液到灭菌冷却到55°C的培养基中，使终浓度为0. 005%所制成
的培养基。本发明的一种的防治烟草青枯病的方法，采用牙签为载体，带有防治烟草青枯病的噬菌体的牙签用于直接插入移栽后的旺长时期的烟草植株茎基部，使用方便，操作简单； 青枯病的防治率达到83. M%，效果理想。适用于烟草栽培。
具体实施例方式按照以下方法配制防治烟草青枯病牙签首先，进行烟草青枯菌的培养与纯化取发生了青枯病症状的烟草叶脉，用无菌水浸泡，在TTC固体培养基上划线筛选，选取粉红色流动性好的单菌落继续在TTC培养基，用平板划线法纯化青枯菌；纯化培养后的青枯菌无菌水在室温下保存。所使用的TTC培养基的组成是蛋白胨log、水解酪朊lg、葡萄糖5g、琼脂15g、蒸馏水IOOOml ；酸度调节到约 PH7. 0，分装，在121°C下灭菌15min ；加过滤灭菌的2，3，5-氯化三苯基四氮唑的水溶液到灭菌冷却到的培养基中，使终浓度为0. 005%所制成的培养基。然后，进行专一性噬菌体的筛选取发生烟草青枯病的植烟土壤，用0. 5mm的筛子过筛，去除土壤中杂物；取过筛后的土壤小颗粒2. 0g，用5. Oml无菌水浸泡过夜，以SOOOr/ min的转速离心IOmin后，取上清液，用0. 22 μ m的滤膜过滤，取滤液20 μ 1与前面制得的青枯菌液100 μ 1涂于TTC培养基上，在下共同培养，观察噬菌斑，筛选专一性噬菌体，无菌水室温保存，备用；该噬菌体的生物体编号是RPS103-02。接着，对专一性噬菌体进行富集培养、收集在灭菌后的500ml三角瓶中，加入 300mlTTC液体培养基和30 μ 1含青枯菌的无菌水，在下震荡培养M_30h后，再加入
410 μ 1含噬菌体的无菌水，在下继续震荡培养36-4 ；之后以8000r/min的转速离心培养液lOmin，取上清液，用0. 22 μ m的滤膜过滤，滤液备用。所使用的TTC培养基的组成是蛋白胨IOg ；水解酪朊Ig ；葡萄糖5g ；蒸馏水IOOOml ；酸度调节到约pH7. 0，分装，在121°C 下灭菌15min ；加过滤灭菌的2，3，5-氯化三苯基四氮唑的水溶液到灭菌冷却到55°C的培养基中，使终浓度为0. 005%所制成的培养基。最后制备防治烟草青枯病牙签取牙签用无菌水浸泡12 Mh，然后无菌水冲洗两次，高压灭菌后在50°C下烘干，待冷却至室温后，置于过滤后的滤液中浸泡^h，取出后用封口袋分装好，4°C保存，该牙签携带有防治烟草青枯病的噬菌体，制得专用于防治烟草青枯病的牙签。所制成的防治烟草青枯病牙签，在烟草移栽后的旺长时期，用于插入烟草植株茎基部，防止烟草青枯菌的生长和蔓延，从而达到防治烟草青枯病的目的。
权利要求
1.一种防治烟草青枯病的方法，其特征包括(1)烟草青枯菌的培养与纯化取发生了青枯病症状的烟草叶脉，用无菌水浸泡，在TTC固体培养基上划线筛选，选取粉红色流动性好的单菌落继续在TTC培养基，用平板划线法纯化青枯菌；纯化培养后的青枯菌无菌水在室温下保存；(2)专一性噬菌体的筛选取发生烟草青枯病的植烟土壤，用0. 5mm的筛子过筛，去除土壤中杂物；取过筛后的土壤小颗粒2. Og,用5. Oml无菌水浸泡过夜，以8000r/min的转速离心IOmin后，取上清液，用 0.22 um的滤膜过滤，取滤液20 μ 1与青枯菌液100 μ 1涂于TTC培养基上，在下共同培养，观察噬菌斑，筛选专一性噬菌体，无菌水室温保存，备用；(3)专一性噬菌体的富集培养、收集在灭菌后的500ml三角瓶中，加入300mlTTC液体培养基和30 μ 1含青枯菌的无菌水， 在下震荡培养M_30h后，再加入10 μ 1含噬菌体的无菌水，在下继续震荡培养 36-48h ；之后以8000r/min的转速离心培养液lOmin，取上清液，用0. 22 μ m的滤膜过滤，滤液备用；(4)防治烟草青枯病牙签的制备取牙签用无菌水浸泡12 Mh，然后无菌水冲洗两次，高压灭菌后在50°C下烘干，待冷却至室温后，置于过滤后的滤液中浸泡^h，取出后用封口袋分装好，4°C保存备用；(5)防治烟草青枯病牙签的使用烟草移栽后，在旺长时期，用青枯病牙签插于烟草植株茎基部，防治烟草青枯病。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述第1步中，所述TTC培养基的组成是蛋白胨10g、水解酪朊lg、葡萄糖5g、琼脂15g、蒸馏水IOOOml ；酸度调节到约pH7. 0，分装，在 121°C下灭菌15min ；加过滤灭菌的2，3，5-氯化三苯基四氮唑的水溶液到灭菌冷却到 55°C的培养基中，使终浓度为0. 005%所制成的培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述第3步中，所述TTC培养基的组成是蛋白胨IOg ；水解酪朊Ig ；葡萄糖5g ；蒸馏水IOOOml ；酸度调节到约pH7. 0，分装，在121°C下灭菌15min ；加过滤灭菌的2，3，5-氯化三苯基四氮唑的水溶液到灭菌冷却到55°C的培养基中，使终浓度为0. 005%所制成的培养基。
全文摘要
本发明公开了一种防治烟草青枯病的方法，包括青枯菌的培养与纯化取青枯病烟草叶脉，用无菌水浸泡，在培养基上筛选，选取流动性好的单菌落继续培养，保存纯化的青枯菌；噬菌体的筛选取发生烟草青枯病的植烟土壤，过筛，去杂；取小颗粒用无菌水浸泡，离心后取上清液过滤，取滤液与青枯菌液共同培养，保存筛选的噬菌体；噬菌体富集培养、收集在三角瓶中加入培养基和含青枯菌的无菌水，震荡培养后，再加入含噬菌体的无菌水，继续培养；离心培养液，取上清液，过滤，滤液备用；牙签用无菌水浸泡，冲洗、灭菌后烘干，冷却至室温，置于滤液中浸泡，取出后分装保存备用；烟草移栽后，用该牙签插于旺长时期烟草植株茎基部，防治烟草青枯病。
文档编号A01G7/06GK102165901SQ20101059575
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月20日 优先权日2010年12月20日
发明者石俊雄, 胡重怡, 蔡刘体 申请人:贵州省烟草科学研究所