葡萄孢属结皮真菌菌株及其胞外多糖快速人工促进生物结皮培育方法与流程

本发明涉及结皮真菌的胞外多糖的生产特别涉及葡萄孢属结皮真菌菌株及其胞外多糖快速人工促进生物结皮培育方法。

背景技术：

微生物、短命植物和种类丰富的地衣、苔藓和藻类植物间形成了一个良好的共生关系，再加之其固有的分泌胞外粘多糖的特性，使其整体形成了一个良好的微生态系统，微生物是生物土壤结皮的先锋物种，也是生物土壤结皮演替早期阶段的优势成分，可为植物提供一定的物质基础促进其生长发育。生物结皮田间试验证明在其它短命植物和种类丰富的地衣、苔藓和藻类植物的共同作用下，形成的结皮厚度越大，效果越好，可见该菌的生长需要周围其它生物如：地衣、苔藓和藻类植物等提供营养物质，这就使该菌更能适应陕北地区的土壤结构和地表机制，进而起到保水、固沙的作用。

微生物多糖，主要指大部分细菌、部分真菌及藻类产生的多糖，包括胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。微生物胞外多糖是一种长链的大分子聚合物，具有独特的物理性质、流变学特性以及较好的安全性，在食品工业领域倍受青睐，在日化、纺织、医药等领域的应用潜能日益引起人们的关注，它除具有大多数植物多糖和合成的高分子聚合物所特有的性质外，还具有低浓度下呈高粘度、假塑性、热稳定性，可与多种盐类配伍及形成有用的膜，同时具有生产周期短，不受气候和地理环境条件的限制，易于提取和应用面广等特性，所以在工业生产与生活的许多领域具有广阔的发展前景。为了不断开发微生物多糖的潜能，仍然需要筛选、分离新的多糖产生菌，了解多糖的生物合成，研究其结构、物理化学特性，进一步拓展其应用领域。

沙漠化已经成为当今世界极其重要的环境和社会经济问题，威胁着人类的生存与发展，而我国则是受沙漠化危害最严重的国家之一。微生物既是结皮形成的参与者，又是结皮的重要组成部分，具有增强土壤团聚稳定性、改善表层土壤水分状况、防止土壤侵蚀等作用。已有研究表明，一些低营养细菌，如枯草芽孢杆菌具有粘性夹膜或厚的果胶质外壁，能分泌大量的粘液，这些具有粘性附属物的菌体和粘液能将矿物细粒粘结，形成球状表面团聚物。

干旱、半干旱地区沙漠化的扩展越来越严重，导致土地退化，土壤肥力、生物多样性降低，极端环境和社会经济因素加剧了土地的退化。目前防沙固沙的主要方法是物理固沙、化学固沙和植被的培植，但成本相对较高，且干旱半干旱地区降水不足、蒸发强烈，植树造林的成活率较低。利用微生物结皮固沙作为新型固沙方式，具有适应性强、成本低、见效快等优势。已有研究表明土壤结皮之所以能形成，与微生物以及它所分泌的多糖类物质有着密不可分的关系，微生物在土壤结皮形成的初期，起到了重要作用，在其代谢产物中会分泌大量的胞外聚合物即胞外多糖，即胞外多糖能够胶结土壤颗粒使之形成团聚体，在团聚体的形成与稳定中起到了胶结作用。国内外对微生物结皮在各生态过程中的作用已作了大量研究,微生物因其极强的适应性和生存能力,在生物结皮形成各阶段都起着积极的作用。土壤微生物的生长和活性与土壤酶活性的变化具有良好的相关性，它的组成、分布和数量因沙丘类型和沙土层深度的不同而有所变化，也受到季节和植被的影响。土壤微生物的生理代谢活动及数量变化可以改变沙土表面理化性质，在土壤结皮的形成、植物营养的转化过程中发挥积极作用，为植物生长创造了良好的条件。但是，目前的研究主要集中在对细菌胞外代谢产物及通过添加诸如聚丙烯酰胺和海藻酸钠等化学物质的研究上。由于微生物可产生胞外代谢物，如多糖、脂类和蛋白质，可起到胶结作用以稳定团聚体，而产多糖的真菌比产多糖的细菌的胶结作用更强，不仅因为真菌的细胞比细菌的大，其产生的胞外代谢产物较多，而且真菌还可以通过菌丝体产生物理胶结作用，而且添加化学物质本身会对结皮发育产生不良影响。如何才能有效地解决上述现有技术的缺陷，开发研究出一种具有产业化前景、生产工艺简单、经济效益良好、无二次污染等特点的绿色、环境友好型的全新结皮真菌的胞外多糖的生产，从而快速人工促进生物结皮培育是一个亟待解决的问题。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种全新的结皮真菌的胞外多糖的生产制备方法，即葡萄孢属结皮真菌菌株及其胞外多糖快速人工促进生物结皮培育方法。该方法与传统的通过细菌胞外代谢产物及通过添加诸如聚丙烯酰胺和海藻酸钠等化学物质的方法相比，具有成本低，具有产业化前景、生产工艺简单、经济效益良好、无二次污染等特点，提供了一种绿色、环境友好型的全新结皮真菌的胞外多糖的生产，从而快速人工促进生物结皮培育的方法，目前尚未有类似的相关胞外多糖促进生物结皮培育的报道。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种葡萄孢属(botrytis)结皮真菌菌株，该结皮真菌菌株2012年5月17日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.3.379。

进一步的，该菌株能在生长繁殖过程中分泌出大量胞外粘多糖，室内摇瓶振荡培养3d黏度可达9860mpa﹒s，产量达19.246g/l，当发酵至第5天时该株真菌的生物量和胞外多糖产量以及发酵液的黏度均达到最高峰，分别为：0.6064g/60ml、20.22μg/ml和4.74mpa·s，并且胞外多糖含量与发酵上清液黏度在一定程度上呈正相关性。

利用上述结皮真菌的胞外多糖快速人工促进生物结皮培育方法，步骤如下：

步骤一、菌株筛选与鉴定

菌株筛选采用高倍稀释法；

菌株菌落形态观察及鉴定：在pda培养基上采用单菌丝挑取法培养出单菌落，记录菌落气生菌丝的疏密、表面形态、大小、颜色、质地、生长速度、边缘形态等；采用插片培养方法，对分离获得的真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定，根据ainsworth分类系统进行分类鉴定，鉴定到属；

步骤二、多糖的提取、纯化与鉴定

取步骤一活化后的菌株，接入装有200ml的液体发酵培养基的500ml的三角瓶中，28℃振荡培养3d，黏度的测定用ndj-79型旋转式黏度计进行，多糖含量测定采用苯酚硫酸法测定，另取200ml发酵液，8000r/min离心，取上清液加一倍体积95％乙醇沉淀出多糖，然后用甲醇和乙醚分别进行脱色，并进行真空干燥，获多糖粗品；将其用去离子水配成0.4％的溶液，8000r/min离心20min，取上清液并加入5:1,v/v的氯仿-异丙醇，离心去沉淀，上清液用去离子水透析48h后进行真空干燥，得白色纯化样品；

之后取10mg纯化多糖样品加入1mol/l硫酸2ml中，100℃下封管水解15h，水解液以氢氧化钡中和，过滤，滤液点样进行薄层层析分析，层析点间距1.0cm，与d-半乳糖、l-鼠李糖、l-阿拉伯糖、d-木糖、d-葡萄糖、d-甘露糖为参照，用正丁醇：乙酸乙酯：乙丙醇：醋酸：水：吡啶，一定体积比混合为展开剂，室温展开15cm，烘干后用苯胺-二苯胺-磷酸试剂喷雾后于85℃烘烤10min显色；

步骤三、保水试验

取已知烘干恒重的培养皿45个，每个装入50g沙子；试验组分a、b两组：a组15个，每个表面喷洒10ml菌剂；b组15个，每个表面喷洒10ml多糖提取液；对照组15个，每个表面喷洒10ml的自来水，置28℃的恒温条件下，以后每隔24h从两试验组和对照组中各取出3皿，采用烘重法测定沙子的含水量；

步骤四、结皮试验

配置液体pda培养基1000ml，平均分装于6个500ml的三角瓶中，115℃，灭菌30min；将已长满平板的该菌种，用直径为6mm的打孔器打孔，取6块菌饼接种于pda液体培养基中，28℃，180r/min摇床振荡培养12h；然后将发酵液倒入已经铺好沙粒的容器中，每个容器均装300g沙子，倒入200ml菌剂，置于室外自然环境中在35℃-38℃条件下培养观察；此过程用不接菌pda液体培养基和不结皮的苹果炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)作为对照，进行结皮试验，最终该株真菌菌剂喷洒于沙粒表面，在沙粒表面形成了约8.2mm厚的一层具有粘结沙粒、保持水分的生物结皮。

进一步的，所述步骤一中，按照质量体积比，pda培养基的组成为：2％葡萄糖，20％马铃薯，1.5％琼脂，其余为水；ph7.0～7.2，115℃灭菌25min。

进一步的，所述步骤一中，按照质量体积比，培养基的组成为：蔗糖3％，蛋白胨0.1％，k2hpo40.3％，nacl0.1％，其余为水；ph7.0～7.5，115℃灭菌25min；发酵温度28～31℃，通气量0.7-0.9:1(v:v)，搅拌速度180-190r/min，ph7.0～7.2。

进一步的，所述步骤二中，展开剂中正丁醇：乙酸乙酯：乙丙醇：醋酸：水：吡啶的体积比为7:20:12:7:6:6。

进一步的，所述葡萄孢属结皮真菌菌株在制备生物结皮，沙漠地区环境治理方面的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

从陕北毛乌素沙地中筛选得到一株真菌，经鉴定，表明该菌株属于葡萄孢属(botrytis)。它能在生长繁殖过程中分泌出大量胞外粘多糖，室内摇瓶振荡培养3d黏度可达9860mpa﹒s，产量达19.246g/l，当发酵至第5天时该株真菌的生物量和胞外多糖产量以及发酵液的黏度均达到最高峰，分别为：0.6064g/60ml、20.22μg/ml和4.74mpa·s，并且胞外多糖含量与发酵上清液黏度在一定程度上呈正相关性。用蒽酮-比色法测得提取的胞外多糖粗品的糖含量为19.58μg/ml，并用4mol/l的硫酸完全水解，硅胶g薄层层析，甲醇-氯仿(1:1)展层，苯胺-二苯胺-磷酸显色，表明其组成成分可能为d-甘露糖、d-半乳糖和d-葡萄糖。通过生物结皮试验，表明该株真菌菌剂喷洒于沙粒表面，在沙粒表面形成了约8.2mm厚的一层具有粘结沙粒、保持水分的生物结皮，同时具有明显的保水作用。表明该菌株在荒漠化治理、恢复和保护生态环境方面具有重要的应用潜力。证实了该结皮真菌的突出优势在于初始ph值达8.5时该真菌生长更好，这表明ph对其生长影响最大，而沙漠的偏碱性环境则更适合该真菌所需的生长条件。在室外结皮试验中我们也发现将该真菌与周围环境中的苔藓植物、微生物等其它生物的共培养，更有利于形成更厚的结皮。

附图说明

图1发酵液黏度和胞外多糖含量与培养时间的关系。

图2为tlc薄层层析结果。

图注:1.待测样品(灰黄色)；2.d-木糖(灰绿色)；3.d-半乳糖(灰黄色)；4.l-阿拉伯糖(灰绿色)；

5.d-甘露糖(灰黄色)；6.d-葡萄糖(灰黄色)；7.l-鼠李糖(淡黄色)

图3胞外多糖和瓜尔胶标准品的fourier变换红外光谱图

图注：3-a是胞外多糖；图3-b是瓜尔胶标准品

图4处理组和对照组的保水结果

图5结皮试验效果

图注：图5-a是对照组，无结皮形成；图5-b是处理组，形成结皮

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1菌株胞外多糖含量与发酵液黏度的关系模型

(1)菌株筛选与鉴定

菌株筛选采用高倍稀释法。

菌株菌落形态观察及鉴定：在pda培养基上采用单菌丝挑取法培养出单菌落，记录菌落气生菌丝的疏密、表面形态、大小、颜色、质地、生长速度、边缘形态等。采用插片培养方法，对分离获得的真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定，根据ainsworth分类系统进行分类鉴定，鉴定到属。

(2)多糖的提取、纯化与鉴定

取活化后的菌株，接入装有200ml的液体发酵培养基的500ml的三角瓶中，28℃振荡培养3d，黏度的测定用ndj-79型旋转式黏度计进行，多糖含量测定采用苯酚硫酸法测定，另取200ml发酵液，8000r/min离心，取上清液加一倍体积95％乙醇沉淀出多糖，然后用甲醇和乙醚分别进行脱色，并进行真空干燥，获多糖粗品。将其用去离子水配成0.4％的溶液，8000r/min离心20min，取上清液并加入氯仿-异丙醇(5:1,v/v)，离心去沉淀，上清液用去离子水透析48h后进行真空干燥，得白色纯化样品。

取10mg纯化多糖样品加入1mol/l硫酸2ml中，100℃下封管水解15h，水解液以氢氧化钡中和，过滤，滤液点样进行薄层层析分析，层析点间距1.0cm，以d-半乳糖、l-鼠李糖、l-阿拉伯糖、d-木糖、d-葡萄糖、d-甘露糖为参照，用正丁醇：乙酸乙酯：乙丙醇：醋酸：水：吡啶(体积比7:20:12:7:6:6)为展开剂，室温展开15cm左右，烘干后用苯胺-二苯胺-磷酸试剂喷雾后于85℃烘烤10min显色。

附图1当菌种培养至第5d时，它的生物量和胞外多糖产量以及发酵液的黏度均达到最高峰，因此，第5d是供试真菌的最佳产糖时间。

实施例2薄层层析(tlc)检测

(1)菌株筛选与鉴定

菌株筛选采用高倍稀释法。

菌株菌落形态观察及鉴定：在pda培养基上采用单菌丝挑取法培养出单菌落，记录菌落气生菌丝的疏密、表面形态、大小、颜色、质地、生长速度、边缘形态等。采用插片培养方法，对分离获得的真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定，根据ainsworth分类系统进行分类鉴定，鉴定到属。

(2)多糖的提取、纯化与鉴定

取活化后的菌株，接入装有200ml的液体发酵培养基的500ml的三角瓶中，28℃振荡培养3d，黏度的测定用ndj-79型旋转式黏度计进行，多糖含量测定采用苯酚硫酸法测定，另取200ml发酵液，8000r/min离心，取上清液加一倍体积95％乙醇沉淀出多糖，然后用甲醇和乙醚分别进行脱色，并进行真空干燥，获多糖粗品。将其用去离子水配成0.4％的溶液，8000r/min离心20min，取上清液并加入氯仿-异丙醇(5:1,v/v)，离心去沉淀，上清液用去离子水透析48h后进行真空干燥，得白色纯化样品。

取10mg纯化多糖样品加入1mol/l硫酸2ml中，100℃下封管水解15h，水解液以氢氧化钡中和，过滤，滤液点样进行薄层层析分析层析点间距1.0cm，与d-半乳糖、l-鼠李糖、l-阿拉伯糖、d-木糖、d-葡萄糖、d-甘露糖为参照，用正丁醇：乙酸乙酯：乙丙醇：醋酸：水：吡啶(体积比7:20:12:7:6:6)为展开剂，室温展开15cm左右，烘干后用苯胺-二苯胺-磷酸试剂喷雾后于85℃烘烤10min显色。

计算得出各个样品的rf值如表1。

表1样品的rf值

由附图2与表1结果表明待测样品的颜色与3号、5号、6号较为接近，并且其rf值也与3、5、6比较接近，则说明组成多糖的单糖可能含有d-甘露糖、d-半乳糖和d-葡萄糖。

图2薄层层析(tlc)检测结果

实施例3胞外多糖的红外光谱分析

(1)菌株筛选与鉴定

菌株筛选采用高倍稀释法。

菌株菌落形态观察及鉴定：在pda培养基上采用单菌丝挑取法培养出单菌落，记录菌落气生菌丝的疏密、表面形态、大小、颜色、质地、生长速度、边缘形态等。采用插片培养方法，对分离获得的真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定，根据ainsworth分类系统进行分类鉴定，鉴定到属。

(2)多糖的提取、纯化与鉴定

取活化后的菌株，接入装有200ml的液体发酵培养基的500ml的三角瓶中，28℃振荡培养3d，黏度的测定用ndj-79型旋转式黏度计进行，多糖含量测定采用苯酚硫酸法测定，另取200ml发酵液，8000r/min离心，取上清液加一倍体积95％乙醇沉淀出多糖，然后用甲醇和乙醚分别进行脱色，并进行真空干燥，获多糖粗品。将其用去离子水配成0.4％的溶液，8000r/min离心20min，取上清液并加入氯仿-异丙醇(5:1,v/v)，离心去沉淀，上清液用去离子水透析48h后进行真空干燥，得白色纯化样品。

取10mg纯化多糖样品加入1mol/l硫酸2ml中，100℃下封管水解15h，水解液以氢氧化钡中和，过滤，滤液点样进行薄层层析分析层析点间距1.0cm，与d-半乳糖、l-鼠李糖、l-阿拉伯糖、d-木糖、d-葡萄糖、d-甘露糖为参照，用正丁醇：乙酸乙酯：乙丙醇：醋酸：水：吡啶(体积比7:20:12:7:6:6)为展开剂，室温展开15cm左右，烘干后用苯胺-二苯胺-磷酸试剂喷雾后于85℃烘烤10min显色。

胞外多糖的红外光谱分析图如图3b所示，由图所示的结果表明：在3421cm^-1处的吸收峰是羟基伸缩振动的特征峰，说明多糖中含有羟基基团。在2919cm^-1处存在一个中强吸收峰，在2850cm^-1处存在一个弱峰，归属于多糖中的-ch2基团的c-h伸缩振动，为多糖的特征性吸收峰。在1648cm^-1处存在一个强吸收峰，与多糖环状结构中的c＝o伸缩振动有关。在1415cm^-1处存在一个中强的宽吸收峰，与c＝c伸缩振动有关。在1199cm^-1和1022cm^-1处各存在一个弱吸收峰，与多糖环状结构中的c-oh和c-o-c伸缩振动有关，在781cm^-1处存在的弱吸收峰存在对称环的伸缩振动。

另外，通过与瓜尔胶标准品的对照，结果表明二者极为相似。

图3胞外多糖和瓜尔胶标准品的fourier变换红外光谱图

注：a是胞外多糖，b是瓜尔胶标准品

实施例4结皮试验

(1)菌株筛选与鉴定

菌株筛选采用高倍稀释法：

具体样品采集方法：在从在毛乌素沙地研究区周边选择生物结皮采集发育良好的区域，在结皮分布较集中的垄间低地随机采集苔藓结皮样品(0-10cm深度)6份，装入密封采样袋中，迅速运回实验室4℃下保存，用于真菌的分离和纯化。称取10g，混合后的苔藓结皮样品，放入装有90ml无菌水锥形瓶中，130r·min-1震荡混匀40min，并依次稀释成梯度为10-2、10-3、10-4的悬液，每个稀释度取0.2ml涂布于马铃薯葡萄糖(pda)、高盐察氏和马丁氏－孟加拉红3种培养基平板上，28℃下恒温培养4～5d。对分离菌株进行统计、编号、纯化，将纯化菌株接种pda斜面上，所述葡萄孢属(botrytiscinerea)已于2012年5月17日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.3.379。

菌株菌落形态观察及鉴定：在pda培养基上采用单菌丝挑取法培养出单菌落，记录菌落气生菌丝的疏密、表面形态、大小、颜色、质地、生长速度、边缘形态等。采用插片培养方法，对分离获得的真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定，根据ainsworth分类系统进行分类鉴定，鉴定到属。

(2)多糖的提取、纯化与鉴定

取活化后的菌株，接入装有200ml的液体发酵培养基的500ml的三角瓶中，28℃振荡培养3d，黏度的测定用ndj-79型旋转式黏度计进行，多糖含量测定采用苯酚硫酸法测定，另取200ml发酵液，8000r/min离心，取上清液加一倍体积95％乙醇沉淀出多糖，然后用甲醇和乙醚分别进行脱色，并进行真空干燥，获多糖粗品。将其用去离子水配成0.4％的溶液，8000r/min离心20min，取上清液并加入氯仿-异丙醇(5:1,v/v)，离心去沉淀，上清液用去离子水透析48h后进行真空干燥，得白色纯化样品。

取10mg纯化多糖样品加入1mol/l硫酸2ml中，100℃下封管水解15h，水解液以氢氧化钡中和，过滤，滤液点样进行薄层层析分析层析点间距1.0cm，与d-半乳糖、l-鼠李糖、l-阿拉伯糖、d-木糖、d-葡萄糖、d-甘露糖为参照，用正丁醇：乙酸乙酯：乙丙醇：醋酸：水：吡啶(体积比7:20:12:7:6:6)为展开剂，室温展开15cm左右，烘干后用苯胺-二苯胺-磷酸试剂喷雾后于85℃烘烤10min显色。

(3)保水试验

取已知烘干恒重的培养皿45个，每个装入50g沙子。试验组分a、b两组：a组15个，每个表面喷洒10ml菌剂；b组15个，每个表面喷洒10ml多糖提取液；对照组15个，每个表面喷洒10ml的自来水，置28℃的恒温条件下，以后每隔24h从两试验组和对照组中各取出3皿，采用烘重法测定沙子的含水量。

(4)结皮试验

配置液体pda培养基1000ml，平均分装于6个500ml的三角瓶中，115℃，灭菌30min。将已长满平板的待测菌种，用直径为6mm的打孔器打孔，取6块菌饼接种于pda液体培养基中，28℃，180r/min摇床振荡培养12h。然后将发酵液倒入已经铺好沙粒的容器中，每个容器均装300g沙子，倒入200ml菌剂，置于室外自然环境中培养观察。此过程用不接菌pda液体培养基和不结皮的苹果炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)作为对照，进行结皮试验。

图4处理组和对照组的保水结果

图5结皮试验效果

如图5所示，可以看出5天后，不接菌的pda液体培养基和不结皮的苹果炭疽病菌对照组在试验前后无明显变化，也没有形成任何结皮，且表面沙粒稀松、易脱落(图5a)。试验组沙粒表面形成一层结皮，表面形成了约8.2mm厚的结皮层(图5b)。将结皮置于显微镜下观察，结皮层由该株真菌的菌丝体、胞外黏性物质和沙粒形成网状的混合结构，可见结皮主要由该菌菌丝体、胞外多糖和沙粒组成，同时，大量的菌丝所组成的菌丝体本身对沙粒就具有很大的缠绕和包埋作用，这在提高固沙、防沙的效果方面，比仅仅依靠聚丙烯酰胺和海藻酸钠等黏性物质的黏着作用要优异很多，且因无化学成分添加，对结皮生物的发育无不良影响，也不会造成环境的二次污染，因此更具有环境亲和性，应用前景好。

通过分析可以证明本发明在室外结皮试验中将该结皮真菌与周围环境中的植物、微生物等其它生物共培养，更有利于形成更厚的结皮。究其原因可能是微生物、短命植物和种类丰富的地衣、苔藓和藻类植物间形成了一个良好的共生关系，再加之该菌这种固有分泌胞外粘多糖的特性，使其整体形成了一个良好的微生态系统，微生物是生物土壤结皮的先锋物种，也是生物土壤结皮演替早期阶段的优势成分，可为植物提供一定的物质基础促进其生长发育。生物结皮田间试验证明在其它短命植物和种类丰富的地衣、苔藓和藻类植物的共同作用下，形成的结皮厚度越大、效果越好，可见该菌的生长需要周围其它生物如地衣、苔藓和藻类植物等提供保水、固沙的作用。

上面对本发明提供的结皮真菌的胞外多糖快速人工促进生物结皮培育方法进行了详细的叙述，应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。