一种高效实用淡水小球藻培养方法及其应用与流程

本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种高效实用促进淡水小球藻生长的培养方法及其应用。技术背景小球藻是最早开发的藻类，早在20世纪60年代初，日本就开始工厂化生产。小球藻经过驯化，可以在淡水、海水、半咸水中生活，有椭圆小球藻、小球藻和蛋白核小球藻3种，都可进行人工培养。近二十年来，环渤海地区乃至全国的淡水水产养殖发展迅猛，小球藻作为淡水鱼、对虾等苗期生长饲料和水质调节的开发愈显重要。很多养殖户通过应用小球藻，改进养殖方法，减少药物的使用，形成一种绿色生态养殖模式，减少养殖成本，提高产量，增加养殖户的经济收入。但是目前，限制小球藻在淡水养殖方面难以应用的原因概括起来包括：培养液配方复杂，培养过程操作繁琐，生产成本高、对水质要求高，大规模培养下藻的成活率低等技术瓶颈尚待突破。时下市售的藻种多是异养发酵培养，这种培养方式培养出来的藻种作为水质调节剂接种到水产养殖池塘中由于营养方式的巨大变化即由原来的异养发酵转变为自然条件下的光合自养，从而导致不能成活，因此不能发挥调节养殖水质的作用，限制了小球藻在水产养殖池塘中的实际推广应用。为此，本专利开发一种高效实用的淡水小球藻培养技术以克服传统小球藻配方复杂、操作繁琐及在养殖池塘不能繁殖成活等诸多缺陷，该培养方法配方简单、操作简化、可应用性强，作为藻种在养殖池塘成活率高，并且对外界条件适应性强，对养殖水源要求低，生长迅速，培养周期短，单位体积产量高、，在养殖池塘易形成优势种群，从而能有效发挥对养殖水质的调节作用。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于提供一种可高效简便实用淡水小球藻的培养方法。本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种利用上述培养基高效培养淡水小球藻的应用。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：本发明的一个目的是提供一种高效培养小球藻的培养基，主要由尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、edta2na、吲哚-3-乙酸和乙烯利混合物组成，按其重量份数计为尿素为50-80份；磷酸二氢钾为20-50份；硫酸镁为20-50份；硫酸亚铁为0.5-1.5份；edtana2为5-8份；吲哚-3-乙酸和乙烯利混合物为0.001-0.004份。优选的，上述可高效培养小球藻的培养基，按其重量份数计尿素为55-75份；磷酸二氢钾为25-35份；硫酸镁为25-35份；硫酸亚铁为0.8-1.2份；edtana2为6-8份；吲哚-3-乙酸和乙烯利混合物0.02-0.03份。优选的，上述可高效培养小球藻的培养基，按其重量份数计尿素为60份；磷酸二氢钾为30份；硫酸镁为30份；硫酸亚铁为1份；edtana2为7份；吲哚-3-乙酸和乙烯利混合物0.025份。优选的，上述可高效培养小球藻的培养基中吲哚-3-乙酸和乙烯利混合物比例为(0-3)：(0-4)。优选的，上述可高效培养小球藻的培养基中吲哚-3-乙酸和乙烯利混合物溶剂为乙醇，所述乙醇浓度为80-100％。优选的，上述高效培养小球藻的培养基配制方法为：步骤一：防爆条件下，将吲哚-3-乙酸和乙烯利混合物溶于乙醇，得溶液a；步骤二：将尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、edtana2按比例混合均匀后，得混合物b，将混合物b按照w/v为1:1000比例溶于水中，得溶液c；再将溶液a和溶液c按重量份数比混匀，得小球藻培养基d。本发明的第二个目的是提供一种利用上述培养基培养小球藻的方法，具体步骤如下：步骤一：培养液配制：将上述培养基d按照v/v为1:1000比例加入到培养小球藻用水中，摇匀后得含有培养基的小球藻培养液e；步骤二：接种：选生长旺盛、无污染、处于指数生长期小球藻接种到小球藻培养液e中，得含有小球藻(4.38×106ind/ml)的液体f；步骤三：培养条件：将液体f于20±10℃、光暗比(10-18):(14-6)、2000±500lux条件下培养；步骤四：培养方式：将液体f置于小球藻专用摇床中进行培养，该摇床振动速度为20-100rpm。步骤五：连续培养5天后，镜检小球藻密度达到35.26×106ind/ml，即可加入饲料进行投喂或加入养殖水体改良水质。优选的，所述步骤一中培养小球藻用水为曝气自来水或者天然养殖池塘水。优选的，所述步骤三中培养条件为在夏秋季池塘、背阴处自然条件下进行现场培养，培养后直接投入池塘或者拌喂饲料，所述光照条件可为室内人造光下或室外自然光。优选的，所述步骤四中培养方式可采用密封塑料袋于摇床上培养或敞口塑料箱充气静置培养。有益效果：1、微藻培养液，传统培养基含有常量元素、微量元素、维生素以及部分生长调节剂等20余种化学药品，操作麻烦，工作量大，特别是一些微量成分和元素，用量极少，称量麻烦，误差大，且不便运输和商品化、市场化运作。本发明公开的一种小球藻培养液，该培养液只含有6种营养元素，使用方便，工作量小，储存、运输方便，便于培养液的工厂化、标准化、市场化、商品化、专业化生产，微量成分和元素定量准确，误差小。2、本培养基配方中调节剂所用溶剂被优化，采用乙醇作为助溶剂溶解吲哚-3-乙酸和乙烯利混合物，使营养元素溶解更加充分，利于藻细胞吸收，成分更加科学、合理、均衡，有利于微藻快速生长。3、本技术培养出的小球藻不仅能作为淡水鱼、虾的开口饵料使用，而且由于采用光合培养在养殖池塘成活率高，更能发挥调节养殖水质的功效，从而有益养殖动物的生长和成活。4、传统小球藻多采用开放水泥池粗放养殖，成本高，易污染，工艺复杂，操作麻烦，基建投资大，产量低，本技术能采用密封塑料袋摇床培养、敞口塑料箱充气静置培养，操作方便，灵活掌握，可实现自动化、工厂化、程序化、规模化生产，成本低，效益高，淡水小球藻生长速度和产量大幅提高，培养周期缩短，产量提高6倍。5、本发明在培养基中加入吲哚-3-乙酸和乙烯利混合物，该混合物是促进成熟的植物生长调节剂，在酸介质中十分稳定，而在ph4以上，则分解释放出乙烯。一般绿藻门细胞体液的ph皆在4以上，该混合物经由藻细胞的细胞壁进入细胞体内，然后传导到起作用的部位，便释放出乙烯，能起内源激素乙烯所起的生理功能，能促进细胞分裂、分化形成，提高蛋白质合成效率，提高光合作用，增强抗逆性和抗衰老。一般，单一的植物生长调节剂对作物的促进生长作用也较为单一，本发明采用两种植物调节剂具有明显的协同增效作用，表现在增强了酶的活性，增强光合强度，提高叶绿素含量，促进小球藻对营养原料的有效吸收，辅助生长劣势小球藻细胞良好生长，起到增强藻细胞对水、营养元素的吸收，调节藻细胞体内水分平衡。附图说明图1为20倍显微镜下初始小球藻图片，图2为实施例6小球藻图片，图3为实施例7小球藻图片，图4为实施例8小球藻图片，图5为实施例9小球藻图片，图6为实施例10小球藻图片，图7为实施例11小球藻图片。具体实施方式实施例1-5一种可规模化培养小球藻的培养基，主要尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、edtana2、吲哚-3-乙酸和乙烯利混合物组成，各组成分成分浓度见表1。表1主培养基主要组成成分表将上述表1中实施例1-5成分1-5混匀后，按照1g:1000ml比例溶于蒸馏水/曝气自来水中，混合均匀后得溶液a、b、c、d、e；将上述表1中实施例1-5中成分6和7混匀后，按照20mg:1ml-10ml比例溶于95％乙醇中，混合均匀后按重量比例加入a、b、c、d、e溶液，得小球藻培养溶液a1、b1、c1、d1、e1。将上述表中实施例1种组分6和7按照1mg:1ml比例溶于蒸馏水中，混合均匀后按重量比例加入a溶液中，得小球藻培养溶液a2。实施例6-11(1)配制：将实施例1-5中配制好小球藻培养液a1、b1、c1、d1、e1、a2按照体积比1:1000比例加入到曝气40h自来水中，摇匀后得含有小球藻生长所需营养元素的培养用水a1-1、b1-1、c1-1、d1-1、e1-1、a2-1；(2)接种：选生长旺盛、无污染、处于指数生长期小球藻分别接种到上述含有营养盐的小球藻用水a1-1、b1-1、c1-1、d1-1、e1-1、a2-1中，得含有初始密度为4.38×106ind/ml(吸光度a680为0.203)小球藻液f、g、h、i、j、k；(3)将上述接种好的小球藻液f、g、h、i、j、k分别置于密封塑料袋中于25℃、70μmol/m2·s(光暗比为12h:12h)光照条件下培养。所述密封塑料袋置于小球藻专用摇床上，定时振荡，振荡速度为50rpm。(4)连续培养5天后，镜检小球藻密度，结果见表2，图1-6。表25d后实施例6-10小球藻密度(106ind/ml)项目接种值实施例6实施例7实施例8实施例9实施例10实施例11密度4.38135.25533.81831.08628.83223.64812.494需要特别说明的是，实施例11中培养的小球藻表面形成一层藻膜，附壁现象严重，镜检藻细胞粘结很严重，胞体多分解死亡。实施例12投喂试验将实施例6培养的小球藻按照30％的质量比加入粉碎过筛后的鲫鱼饲料原料，混匀后利用制粒机制成颗粒饲料，70℃条件下干燥后投喂鲫鱼，日投喂量为鱼体重的3％-5％。试验鲫鱼分别放养于容积为300l水族缸中，每个水族缸中放养20尾鱼。每种饲料设三个重复，未用小球藻培养液b制备的颗粒饲料设为对照组。养殖8周后，实验鱼禁食一天后称量体重，解剖后取肌肉样品进行常规营养成分分析，取肝脏样品进行非特异性免疫指标和抗氧化指标测定，结果见表3-5。表3小球藻对鲫鱼生长性能和饲料利用的影响组别初体重(g)末体重(g)增重率(％)饵料系数对照组5.75±0.038.12±0.2341.23±3.952.78±0.19实施例组5.64±0.0313.41±0.41137.81±6.022.09±0.18表4小球藻对鲫鱼肌肉营养成分的影响组别水分(％)蛋白质(干重％)粗脂肪(干重％)对照组78.77±0.9875.42±0.1818.01±0.78实施例组77.88±1.5676.27±0.2117.65±0.92表5小球藻对鲫鱼肝脏非特异性免疫力和抗氧化能力的影响实施例13调水试验按照1:1700体积比向虾塘水内接种实施例6小球藻，分别置于250l塑料箱中，不接种小球藻培养液b的塑料箱做对照组。每塑料箱内放置15尾体长约8cm健康南美白对虾后浸入虾塘。试验期间箱内虾正常投喂配合饲料。5日后检测水体氨氮、亚硝酸盐和溶解氧浓度变化，并计数箱内水体中小球藻和蓝藻数量变化。表6小球藻对南美白对虾养殖水质和浮游植物的影响实施例14大量培养试验(1)配制：将实施例1中配制好小球藻培养液a1按照1:1000比例加入到池塘养殖水中，摇匀后得含有小球藻生长所需营养元素的培养用水a3；(2)接种：选生长旺盛、无污染、处于指数生长期小球藻接种到上述含有营养盐的小球藻用水a3中，得含有初始密度为4.42×106ind/ml(吸光度a680为0.203)小球藻液f1；(3)将上述接种好的小球藻液f1置于敞口塑料箱(10m×10m×10m)中于池塘边进行静置充气培养，所述培养季节为夏季。(4)连续培养5天后，镜检小球藻密度，结果镜检小球藻密度分别为34.255×106ind/ml、35.121×106ind/ml。实施例15(1)配制：将实施例1中配制好小球藻培养液a1按照1:1000比例加入到池塘养殖水中，摇匀后得含有小球藻生长所需营养元素的培养用水a3，将传统f/2小球藻培养液按照1:1000比例加入到池塘养殖水中，摇匀后得含有小球藻生长所需营养元素的培养用水a4；(2)接种：选生长旺盛、无污染、处于指数生长期小球藻分别接种到上述含有营养盐的小球藻用水a3、a4中，得含有初始密度为4.38×106ind/ml(吸光度a680为0.203)小球藻液f1、f2；(3)将上述接种好的小球藻液f1、f2分别置于敞口塑料箱(10m×10m×10m)中于池塘边进行充气培养，所述锥形瓶上封有过滤纸，所述培养季节为夏季。(4)连续培养5天后，镜检小球藻密度，结果镜检小球藻密度分别为35.121×106ind/ml，5.618×106ind/ml，且f2藻液中含有少量蓝细菌和纤毛虫。当前第1页12