一种微拟球藻高密度培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种微拟球藻高密度培养方法。
【背景技术】
[0002]虾青素具有良好的着色功能和超强的抗氧化、抗肿瘤和增强免疫力等许多重要的生理和生物学功能，具有清除氧自由基的强大能力，其抗氧化活性是维生素E的550倍、类胡萝卜素的10倍，被誉为“超级抗氧化剂”。虾青素具有广泛的应用价值，对人体绝对安全，目前主要作为人类的高级保健食品、药品、化妆品，以及水产养殖动物和家禽、家畜的饲料添加剂，市场前景非常广阔。
[0003]目前，虾青素的生产工艺主要有化学合成和生物提取两种。化学合成的虾青素在结构、功能及安全性等方面都不及天然的虾青素，动物和人体试验结果表明，天然虾青素没有任何致病效应或毒副作用，对人体安全无害。微拟球藻细胞内天然虾青素的含量相对较高，在特定条件下，微拟球藻可以积累占其干重I %以上的虾青素，且所含虾青素的结构与养殖对象所需一致，被公认为天然虾青素的最好生物来源，通过培养微拟球藻来提取虾青素具有良好的应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种微拟球藻高密度培养方法，通过在光生物反应器内制备培养基，严格控制接种温度和光照培养等条件，使得微拟球藻生长速率提高，繁殖速度加快，提高了培养效率。
[0005]其技术解决方案包括:
[0006]一种微拟球藻高密度培养方法，包括以下步骤:
[0007]a、接种步骤，在封闭的光生物反应器内配制培养基，然后将生长至指数生长期的微拟球藻藻种接种到所述培养基中，所述微拟球藻藻种的接种量为5-15% ；
[0008]b、培养步骤，采用人工LED光源培养，该培养步骤依次分为两个阶段，第一阶段内培养温度为22-25°C，采用单色光白光照射3-5天，白光光照强度为500?20001x ;第二阶段内培养温度为22-25?，采用白光和红光共同照射6-11天，控制光照强度为1000?30001x，通气比0.2?1: lv/vm, 二氧化碳含量占0.05?I %。
[0009]作为本发明的一个优选方案，步骤a中，每升培养基中含有NaAc 0.5?3g, KNO30.3 ?0.6g，KH2PO40.02 ?0.lg, MgSO40.05 ?0.2g，CaCl20.03 ?0.lg, Fe-EDTA 母液1ml，微量元素母液Iml和维生素母液1ml，所述培养基的pH值为7?8。
[0010]作为本发明的另一个优选方案，步骤b中，采用白光照射4天，采用白光和红光共同照射8天。
[0011]优选的，每升Fe-EDTA母液中含有0.1?0.5g的EDTA和0.1?0.5g的FeSO4。
[0012]优选的，每升微量元素母液中含有5?15mg的H3BO3、5?13mg的MnSO4、5?12mg的 ZnSO4、2 ?8mg 的 CuSO4、0.1 ?Img 的 Na2MoO4和 0.1 ?0.8mg 的 CoCl 2。
[0013]优选的，每升维生素母液中含有0.2?Ig的维生素BI和0.025?0.05g的维生素 B12。
[0014]本发明所带来的有益技术效果:
[0015](I)培养基在封闭的光生物反应器内配制，有效阻止了空气中杂质和细菌的进入，并且光生物反应器可以更好的控制温度，保证了微拟球藻藻细胞的接种始终在适宜的温度内。
[0016](2)本发明采用人工LED光源进行光照，首先采用白光光照3-5天，再用白光和红光共同照射6-11天，由于微拟球藻的繁殖适宜在弱光下进行，用现有技术中的太阳光一方面温度不好控制，另一方面在不同的季节温度达不到微拟球藻繁殖的适宜温度，通过人工LED光源照射，较好的控制了微拟球藻繁殖所需的温度，另外，与传统的培养方法相比较，本培养方法还节省了控温的能耗，由于温度易控制，因此培养周期也相应缩短了，经过实施例的分析检测，合理控制白光以及白光和红光的混合光照时间，培养得到的微拟球藻细胞浓度可达30.4万/mL，明显高于传统培养方法得到的微拟球藻细胞浓度(120万/mL以下)。
[0017](3)本发明培养基的配方中，NaAc、Fe-EDTA母液、KN03、MgSO4、CaCl2等有效抑制了微拟球藻细胞内虾青素的积累，有利于微拟球藻细胞的分裂，为后期虾青素的累积总量的增加奠定物质基础；该培养基适宜微拟球藻的快速生长，藻液浓度高。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例对本发明做详细说明。
[0019]实施例1:
[0020]本发明的培养方法如下:
[0021]步骤1、在封闭光生物反应器中配制培养基，将培养至指数生长期的藻种(浓度约为8万/ml)接种到培养基中，接种量5%，反应器中培养基配方为每升培养基中含有:NaAc 3g, KNO30.6g，KH2PO40.08g，MgSO40.15g，CaCl20.lg，Fe-EDTA 母液 1ml，微量元素母液lml，维生素母液1ml，控制pH为8 ；EDTA-Fe母液配方为每升含有:EDTA 0.5g，FeSO40.4g ；微量元素母液配方为每升含有:H3B0310mg，MnS048mg，ZnS048mg，CuSO44mg, Na2MoO40.6mg，CoCl20.5mg;维生素母液配方为每升含有:维生素BI 0.2g，维生素B12 0.025g ；
[0022]步骤2、第一阶段的培养，控制温度22°C;光照时间每天12h，开始3天用白光光照，光照强度100Ix ;
[0023]步骤3、第二阶段的培养，第一阶段完成后，控制温度不变，改用白光加红光进行光照，光照6天，光照强度20001x ;通气比1:lv/vm，二氧化碳含量占0.05%，得到高密度微拟球藻培养物。
[0024]经生化检测，本实施例制备得到的微拟球藻细胞浓度为23.6万/ml。
[0025]实施例2:
[0026]本发明微拟球藻的培养方法，具体包括:
[0027]步骤1、在封闭光生物反应器中配制培养基，将培养至指数生长期的藻种(浓度约为8万/ml)接种到培养基中，接种量10%，反应器中培养基配方为每升培养基中含有:NaAc 1.5g, KNO30.5g，KH2PO40.06g，MgSO40.lg，CaCl20.06g，Fe-EDTA母液 1ml，微量元素母液lml，，维生素母液1ml，控制pH为8 ；EDTA-Fe母液配方为每升含有:EDTA 0.3g, FeSO40.2g ；微量元素母液配方为每升含有:H3B038mg，MnS048mg，ZnSO41mg, CuS045mg，Na2MoO40.6mg，CoCl20.4mg ;维生素母液配方为每升含有:维生素BI 0.5g，维生素B12 0.04g ；
[0028]步骤2、第一阶段的培养，控制温度22°C;光照时间每天12h，开始4天用白光光照，光照强度100Ix ;
[0029]步骤3、第二阶段的培养，第一阶段完成后，控制温度不变，改用白光加红光进行光照，光照8天，光照强度20001x ;通气比1:lv/vm，二氧化碳含量占0.05%，得到高密度微拟球藻培养物。
[0030]经生化检测，本实施例制备得到的微拟球藻细胞浓度为30.4万/ml。
[0031]实施例3:
[0032]本发明微拟球藻的培养方法，具体包括:
[0033]步骤1、在封闭光生物反应器中配制培养基，将培养至指数生长期的藻种(浓度约为8万/ml)接种到培养基中，接种量10%，反应器中培养基配方为每升培养基中含有:NaAc 3g, KNO30.6g，KH2PO40.08g，MgSO40.15g，CaCl20.lg, Fe-EDTA 母液 1ml，微量元素母液lml，维生素母液1ml，控制pH为8 ；EDTA-Fe母液配方为每升含有:EDTA 0.5g，FeSO40.4g ；微量元素母液配方为每升含有:H3B0310mg，MnS048mg，ZnS048mg，CuSO44mg, Na2MoO40.6mg，CoCl20.5mg;维生素母液配方为每升含有:维生素BI 0.2g，维生素B12 0.025g ；
[0034]步骤2、第一阶段的培养，控制温度22°C;光照时间每天12h，开始5天用白光光照，光照强度100Ix ;
[0035]步骤3、第二阶段的培养，第一阶段完成后，控制温度不变，改用白光加红光进行光照，光照9天，光照强度20001x ;通气比1:lv/vm，二氧化碳含量占0.05%，得到高密度微拟球藻培养物。
[0036]经生化检测，本实施例制备得到的微拟球藻细胞浓度为28.4万/ml。
[0037]对比例1:
[0038]对比例I与实施例1不同之处在于，步骤I中在开放式的反应器内配制培养基，其加热方式为普通光照来控制。
[0039]经生化检测，对比例I制备得到的微拟球藻细胞浓度为14.3万/ml。
[0040]本
【发明内容】
不仅限于实施例所述内容，实施例仅为实验过程具体操作举例，所举实例外的其他数据均在本发明权利范围之内。
【主权项】
1.一种微拟球藻高密度培养方法，其特征在于:包括以下步骤: a、接种步骤，在封闭的光生物反应器内配制培养基，然后将生长至指数生长期的微拟球藻藻种接种到所述培养基中，所述微拟球藻藻种的接种量为5-15% ； b、培养步骤，采用人工LED光源培养，该培养步骤依次分为两个阶段，第一阶段内培养温度为22-25°C，采用单色光白光照射3-5天，白光光照强度为500?20001x ;第二阶段内培养温度为22-25°C，采用白光和红光共同照射6-11天，控制光照强度为1000?30001x，通气比0.2?1:lv/vm，二氧化碳含量占0.05?1%，即得微拟球藻。2.根据权利要求1所述的微拟球藻高密度培养方法，其特征在于:步骤a中，每升培养基中含有 NaAc 0.5 ?3g、KN03 0.3 ?0.6g,KH2PO4 0.02 ?0.lg、MgS04 0.05 ?0.2g,CaCl20.03?0.lg,Fe-EDTA母液1ml、微量元素母液Iml和维生素母液1ml，所述培养基的pH值为7?8。3.根据权利要求2所述的微拟球藻高密度培养方法，其特征在于:步骤b中，采用白光照射4天，采用白光和红光共同照射8天。4.根据权利要求3所述的微拟球藻高密度培养方法，其特征在于:每升Fe-EDTA母液中含有0.1?0.5g的EDTA和0.1?0.5g的FeSO4。5.根据权利要求3所述的微拟球藻高密度培养方法，其特征在于:每升微量元素母液中含有 5 ?15mg 的 H3BO3>5 ?13mg 的 MnSO4>5 ?12mg 的 ZnSO4>2 ?8mg 的 CuS04、0.1 ?Img 的 Na2MoO4和 0.1 ?0.8mg 的 CoCl 2。6.根据权利要求3所述的微拟球藻高密度培养方法，其特征在于:每升维生素母液中含有0.2?Ig的维生素BI和0.025?0.05g的维生素B12。
【专利摘要】本发明公开了一种微拟球藻高密度培养方法，其首先在封闭的光生物反应器内配制培养基，然后将生长至指数生长期的微拟球藻藻种接种到培养基中；采用人工LED光源培养，分为两个阶段进行培养，第一阶段内培养温度为22-25℃，采用单色光白光照射3-5天，白光光照强度为500～2000lx；第二阶段内培养温度为22-25℃，采用白光和红光共同照射6-11天，控制光照强度为1000～3000lx，通气比0.2～1：1v/vm，二氧化碳含量占0.05～1％。由于微拟球藻的繁殖适宜在弱光下进行，本发明通过人工LED光源照射，较好的控制了微拟球藻繁殖所需的温度，另外，本发明还节省了控温的能耗，经分析检测，合理控制白光以及白光和红光的混合光照时间，培养得到的微拟球藻细胞浓度可达30.4万/mL。
【IPC分类】C12N1/12, C12R1/89
【公开号】CN104988066
【申请号】CN201510395733
【发明人】李悦明, 徐建春, 曲文强, 李霞, 王道会
【申请人】青岛科海生物有限公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月8日