本发明属于藻类生物技术领域，具体涉及一种雨生红球藻细胞的保存及复苏方法。
背景技术：
雨生红球藻(haematococcuspluvialis)是一种生产天然虾青素的绿藻，隶属于绿藻门绿藻纲团藻目红球藻科。其细胞在特定环境下生成大量的虾青素储藏于胞内，虾青素含量最高达7％。雨生红球藻中虾青素主要是酯化形态虾青素，分子结构为3s，3s’构型，因此被认为是最好的天然虾青素来源，在保健食品、着色剂、个人护理产品和高端饲料领域有广泛的应用，成为近年来藻类资源化开发利用的热点。
在雨生红球藻规模化生产过程中，特别是室外生产阶段需要大量的高活力细胞作为起始藻种。当前，主要通过多级培养获得大量起始藻种，因而需要在规模生产之前花费很多时间并占用许多培养体积生产起始藻种。在实际生产实践中，一方面，由于起始种源，特别是绿色游孢子由于污染食藻生物或无法耐受环境高光而大量死亡导致培养失败率高，产生的起始种源供应不足从而限制下一阶段的生产；另一方面，由于季节、气候的限制，在我国的部分地区不能进行连续生产，因而下一年度的生产容易受到起始种源培养时间消耗的延误，特别是气候条件不利于起始藻种培养时尤其严重。通过高活力细胞保存方法，适时、足量地提供能够迅速复壮并能快速增殖的高密度高活力起始藻种是保障成功、稳定生产的有效方法，直接关系到虾青素生产的效益，成为制约雨生红球藻虾青素开发的瓶颈问题之一。
目前，微藻保存方法包括继代保存、干燥保存、浓缩液低温保存和超低温冻存等方法。继代保存法是使用最广泛的传统方法，包括液体和固定化继代保存法，具有操作简单优点，但是存在营养盐消耗快、细胞容易老化等问题，需要每隔一个月更换培养基，频繁继代的工作量大。通过红膜转光，可以减缓雨生红球藻营养细胞的老化而延长保存时间(cn103695314a-一种雨生红球藻营养细胞的保存方法)，但是在大量保存实践时无法避免细菌和杂藻的污染。浓缩液低温保存法适用于一些单细胞藻类，实现3个月左右的高活力保存，但是容易出现细菌和杂藻污染(cn105838611a-一种小球藻浓缩液的保存方法；cn105713838a-一种假微型海链藻的高活力细胞保藏方法)。干燥保存法仅适用于一些丝状体藻类(cn105483006a-丝状蓝藻的保存方法；cn103621395a-萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法)，且复苏后存活率低。超低温冻存是新型的细胞保存方法，具有保持种质遗传稳定，可实现长达数年的长期保藏。比如，雨生红球藻在液氮低温下，通过甘油保护可实现长时间保藏(cn105779292a-一种经无菌化处理的雨生红球藻的超低温保藏方法)，但是复苏存活率仅66.13％，且需要复杂的操作技术和贵重的保存设备。由于上述方法在细胞存活率、保存时间、劳动强度以及设备需求等方面局限，限制了保存的效率和规模，从而给实际生产带来很多的困难。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种雨生红球藻细胞的保存及复苏方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种雨生红球藻细胞的保存方法，将雨生红球藻细胞浓缩液经0～10摄氏度冷驯化后，在遮光条件、冰点以下冰冻保存。
所述雨生红球藻细胞培养至厚壁孢子状态后收集，浓缩至细胞密度为10-200g/l。
所述将收集的雨生红球藻厚壁孢子状态细胞浓缩液放置于0～10摄氏度下冷冻驯化1～5天。
所述冷冻驯化温度为1～5摄氏度。
所述驯化后藻液于零下20～零下1摄氏度、遮光条件下保存3～5个月。
一种保存方法保存的雨生红球藻细胞的复苏方法，所述经冷驯化处理、经冰冻后低温避光保存的雨生红球藻厚壁孢子细胞在5～35摄氏度下解冻，然后加入含氮培养基稀释，再置于照光条件下培养，即得到细胞的复苏。
所述含氮培养基中氮元素含量为0～200mg/l。
所述含氮培养基中氮元素含量为50～100mg/l。
所述稀释的细胞浓度为0.2～1.0g/l。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过将浓缩藻液经短时冷驯化后冰冻保存，而实现雨生红球藻细胞的高存活率的中长期保存方法；同时对保存细胞的复苏方法；具体为：
1.本发明方法的复苏存活率高，在保存75天复苏后细胞存活率达到95％以上，复苏后生长迅速；
2.有效避免细菌和杂藻繁殖，在长期保存阶段无明显的细菌和杂藻生长，复苏后细胞快速生长，抑制细菌和杂藻增殖；
3.本发明方法简单，不需要借助专业设备；
4.本发明方法易于大量藻种的保存，很容易在生产实践中实施。
具体实施方式
下面结合部分实施例对本发明的技术方案进行详细描述。所描述的实施例仅仅是本发明的一部分，而非全部的实施例。
实施例1
雨生红球藻nies-144藻株(市购)，分别在：1)在全氮bbm培养基(市购)中以50μe/m2/s光照下培养藻株5天得到的绿色游孢子；
2)在无氮bbm培养基中以300μe/m2/s光照下培养藻株10天得到的厚壁孢子；
将上述获得的绿色游孢子和厚壁孢子静置沉降浓缩，而后分别置于冰箱保鲜室5摄氏度中冷驯化24小时；而后转移至冷藏室-20摄氏度冻结成冰并继续冻存60天；冻存之后取出置于室温下融化。
之后以含4mmol/l硝酸钠的bbm培养基分别稀释上述融化的浓缩藻液至细胞密度为0.449g/l，稀释后置于200μe/m2/s光照，并通入1％co2的空气培养。光照培养48小时后，利用荧光显微镜观察并统计可激发出红色叶绿素荧光细胞的比例，统计得出绿色游孢子和厚壁孢子的存活率分别为51.3％和97.5％；而后再以上述条件继续培养8天，绿色游孢子和厚壁孢子的细胞密度分别达到0.668和2.768g/l，计算得出绿色游孢子和厚壁孢子的比生长速率分别为0.05和0.227。
对比例1
雨生红球藻nies-144藻株，分别在：1)在全氮bbm培养基中以50μe/m2/s光照下培养藻株5天得到绿色游孢子；
2)在无氮bbm培养基中以300μe/m2/s光照下培养藻株10天得到厚壁孢子；
上述获得的绿色游孢子和厚壁孢子分别置于冰箱冷藏室-20摄氏度冻结成冰并继续冻存60天；而后取出置于室温下融化。
之后以含4mmol/l硝酸钠的bbm培养基分别稀释上述融化的浓缩藻液至细胞密度为0.471g/l，稀释后置于200μe/m2/s光照，并通入1％co2的空气培养。照光培养48小时后，利用荧光显微镜观察并统计可激发出红色叶绿素荧光细胞的比例，统计得出绿色游孢子和厚壁孢子的存活率分别为0.2％和4.6％；而后再以上述条件继续培养8天，绿色游孢子和厚壁孢子的细胞密度分别达到0.512和0.891g/l，计算得出绿色游孢子和厚壁孢子的比生长速率分别为0.01和0.079。
对比例2
雨生红球藻nies-144藻株，分别在：1)在全氮bbm培养基中以50μe/m2/s光照下培养藻株5天得到绿色游孢子；
2)在无氮bbm培养基中以300μe/m2/s光照下培养藻株10天得到厚壁孢子；
上述获得的绿色游孢子和厚壁孢子分别置于室温下保存60天；之后以含4mmol/l硝酸钠的bbm培养基分别稀释上述室温保存的浓缩藻液至细胞密度为0.510g/l，稀释后置于200μe/m2/s光照，并通入1％co2的空气培养。照光培养48小时后，利用荧光显微镜观察并统计可激发出红色叶绿素荧光细胞的比例，统计得出绿色游孢子和厚壁孢子的存活率分别为57.3％和75.2％；而后再以上述条件继续培养8天，绿色游孢子和厚壁孢子的细胞密度分别达到1.730和1.323g/l，计算得出绿色游孢子和厚壁孢子的比生长速率分别为0.15和0.11。
比较实施例1与两个对比例中细胞保存复苏后的细胞存活率和比生长速率，细胞形态差异对存活率和比生长速率以及细胞培养物中细菌浓度的影响如表1所示：
表1
由上述数据可见经冷驯化处理后冰冻保存的雨生红球藻细胞，在复苏之后的存活率显著高于直接冰冻保存的，生长速度和比生长速率均明显高于后者。镜检观察发现不论是否经冷驯化处理，冷冻保存细胞复苏后培养染菌概率都很低。而在室温下保存的，绿色游孢子的细胞存活率与实施例1相当，但是厚壁孢子的细胞存活率显著降低；最重要的是室温保存细胞出现细胞结块不易分散，且有异臭味，镜检可观察到大量的细菌，复苏后生长速率也显著降低。
实施例2
雨生红球藻sccapk-0084藻株(市购)，在无氮bbm培养基中以300μe/m2/s光照下培养藻株10天得到厚壁孢子，静置沉降后得到细胞密度为60g/l的浓缩藻液，浓缩藻液置于冰箱保鲜室5摄氏度中冷驯化24小时；之后分装于多个样品袋中，分装后分别置于-5、-20、-80摄氏度冰箱中冻结成冰，并继续冻存60天。之后取出置于室温下融化，融化后以含4mmol/l硝酸钠的bbm培养基稀释融化后浓缩藻液至细胞密度为0.5g/l，置于200μe/m2/s光照，并通入1％co2的空气培养。照光培养48小时后，利用荧光显微镜观察并统计可激发出红色叶绿素荧光细胞的比例，统计得出在-5、-20、-80摄氏度的存活率分别为98％、96％和16％。
实施例3
在无氮bbm培养基中以300μe/m2/s光照下培养藻株10天得到厚壁孢子藻液，静置沉降后得到细胞密度为40g/l的浓缩藻液，置于冰箱保鲜室5摄氏度中冷驯化24小时；之后分装于多个样品袋中，转移至冷藏室-5摄氏度冻结成冰。分别在冻存3、38和75天后取出一袋冻存藻，置于室温下融化；之后以含4mmol/l硝酸钠的bbm培养基稀释上述融化后浓缩藻液至细胞密度为0.5g/l，置于200μe/m2/s光照，并通入1％co2的空气培养。定时采样，监测细胞生长情况。以仅经过冷驯化处理而没有冰冻的细胞作为接种材料的实验为对照。结果表明冻存3、38和75天后复苏的细胞存活率分别为100％、98％和96％；以上述培养条件继续培养8天的细胞密度分别为3.61、2.86和2.64g/l。
实施例4
雨生红球藻在室外1000l柱式光反应器中,在无氮条件下培养10天得到厚壁孢子藻液，经重力沉降后得到细胞密度为40g/l的浓缩藻液，置于冰箱保鲜室5摄氏度中冷驯化24小时；之后在-5摄氏度下冻结成冰并继续冻存75天。之后置于室温下融化，而后以含4mmol/l硝酸钠的bbm培养基稀释上述融化后浓缩藻液至细胞密度为0.3g/l，接种于1000l柱式光反应器中置于室外自然光照射下培养，培养过程中持续通入1％co2的空气培养。每两天采样，监测细胞生长情况。培养12天后的细胞密度为2.04g/l。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现，未予以详细说明和局部放大呈现的部分，为现有技术，在此不进行赘述。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和特点相一致的最宽的范围。