一种肝素酶高产菌株及其选育方法与流程

[技术领域]

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肝素酶高产菌株raoultellasp.nx-tz-3,15及其选育方法。

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背景技术：
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肝素酶(heparinase)或肝素裂解酶是一类能够专一性地裂解肝素和硫酸类肝素糖苷键的蛋白质。肝素酶最早是从肝素黄杆菌中发现的，肝素黄杆菌是一种能够利用肝素产生寡糖的微生物，临床上主要用来预防血栓或作为体外抗凝血药物使用。

目前，从肝素黄杆菌中已经鉴定出三种肝素酶：肝素酶ⅰ(heparinase,ec4.2.2.7)，肝素酶ⅱ(heparinaseii)，和肝素酶ⅲ(heparinase,ec4.2.2.8)。肝素酶ⅰ主要裂解肝素，肝素酶ⅲ主要裂解硫酸类肝素，肝素酶ⅱ可同时裂解肝素和硫酸类肝素。肝素黄杆菌主要用于低分子肝素和超低分子肝素的生产，特别是肝素酶i和肝素酶ii。

除了从肝素黄杆菌中分离出肝素酶外，国内外学者还先后从土壤和食物研磨废物中分离出鞘氨醇杆属和芽孢杆菌属产肝素酶。此外，还有一些学者从人体肠道、人体牙周和土壤中分离出粪便拟杆、黄曲霉和不动杆菌产肝素酶。

目前产肝素酶微生物的筛选方法主要是采用肝素逐步取代微生物筛选培养基原始碳源的驯化方法，特异性富集对肝素具有裂解能力的微生物菌株，然后以天青a法监测富集培养液中肝素的含量变化，初步筛选到含有能利用肝素的菌株的样本，在对样本中各菌落涂布，挑取单菌落进行复筛，复筛主要是将初筛的菌株培养，然后制备无细胞粗提液，进行破碎，利用天青a法测定酶活力从而确定是否是产肝素酶的微生物，但这种筛选方法需要尝试多种配方培养基，浪费大量的人力和物力，因此探究一种简单快速的筛选产肝素酶微生物的方法具有极其重要的意义。

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技术实现要素：
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针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种肝素酶高产菌株及其选育方法，利用此方法能够筛选出肝素酶高产菌株。

一方面，本发明提供一种肝素酶高产菌株，菌株为：raoultellasp.nx-tz-3,15；该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2017年3月6日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.13723。

另一方面，本发明提供一种肝素酶高产菌株的选育方法：利用鱼精蛋白和肝素反应的沉淀作为指示物，肝素酶裂解肝素反应使菌体周围产生透明圈，从而起到对肝素酶源微生物菌株直接指示的作用，通过复筛、16srdna方法鉴定产肝素酶菌株raoultellasp.nx-tz-3,15；

具体包括以下步骤：

步骤一，肝素酶产生菌的富集培养：将1g采集的样品加入盛有10ml无菌生理盐水的试管中摇匀后，取5ml悬浮液，或直接取5ml水样，加入盛有25ml富集培养基的三角瓶中，200r/min，37℃摇瓶培养2天；

步骤二，肝素酶产生菌的初筛：将经富集培养的菌液用无菌生理盐水梯度稀释到适当稀释度，取适量的菌液涂布于初筛平板上，培养10～12h，待平板上的落生长到合适大小，用蒸馏水洗去菌落，加入2％的鱼精蛋白溶液，于37℃放置1h，将鱼精蛋白溶液倒掉，用蒸馏水洗净，于室温放置12h，在原菌落生长处就会有透明圈出现，选择透明圈与菌落直径比值较大的菌株转移种子培养基中，培养24h；

步骤三，肝素酶产生菌的复筛：挑取初筛平板上有透明圈的菌落接入种子培养基，200r/min，37℃，摇瓶培养24h，再按5％的接种量转入复筛培养基，200r/min，37℃，摇瓶培养72h，制备无细胞粗提液，检测酶的活力，检验及鉴定肝素酶的高产菌株。

上述步骤一所述的富集培养基组成为(％)：胰蛋白胨1.0、肝素钠0.5、nacl0.5、ph6.5；初筛培养基组成为(％)：胰蛋白胨1.0、(nh4)2so40.1、kh2po40.25；mgso4·7h2o0.05、肝素钠0.2、ph6.5；种子培养基组成为(％)：胰蛋白胨1.0、(nh4)2so40.1、kh2po40.25、mgso4·7h2o0.05、肝素钠0.2、ph6.5；初筛培养基组成为：(％)：酵母浸出膏0.3、胰蛋白胨1.0、nacl0.5、肝素钠0.2、琼脂2.0、ph7.0。

上述步骤三所述肝素酶的高产菌株菌体形态鉴定方法采用的是革兰色染色法：采用快速革兰氏染色液，在100倍油镜下进行观察，确定细菌形态，排列及某些结果特征，确定为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

上述步骤三所述肝素酶的高产菌鉴定方法是用16srdna鉴定产肝素酶高产菌，方法如下：①16srdna基因组dna的提取及电泳检测：利用omegad3350-00e.z.n.a.tm细菌基因组dna提取试剂盒来提取产细菌素乳酸菌的dna，并对提取出基因组进行琼脂糖电泳检测和od值检测，以确定达到需要的浓度和纯度；②16srdna基因的pcr扩增；③16srdna序列测定及肝素酶高产菌株种属确定：经pcr反应扩增出的16srdna基因组经琼脂糖电泳检测、pcr产物回收、t-载体连接、克隆后，送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将测序结果输入ncbi数据库的http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blastn中，与ncbi已收录的16srdna序列进行比对，根据序列比对的结果，选择和产肝素酶菌株同源性较高的20株菌株序列，利用生物信息学软件(mega4.0)将以上20株菌株构建系统发育树，进一步确证菌株的种属。

上述步骤三所述制备无细胞粗提液，是将细菌复筛培养液离心(6000rpm，15min)收集菌体，用30mlph7.0cacl2-tris-hcl缓冲液洗涤，离心(6000rpm，15min)，重复两次，按每毫升0.2g湿菌体的比例加入ph7.0cacl2-tris-hcl缓冲液中，在冰浴中超声波破碎10次，每次5s，间隔5s，将破碎液冷冻离心，8000rpm，20min，上清夜即为无细胞粗提液。

上述cacl2-tris-hcl缓冲液配制方法：取5ml10mm/lcacl2与25ml1mtris-hcl缓冲液混匀，定容至1000ml，调节ph至7.0待用；(①1mhcl溶液：量取8.5mlhcl于100ml容量瓶中定容(通风橱中进行)；②1mtris溶液：称取12.2gtris，用蒸馏水使其完全溶解后定容至100ml；③10mm/lcacl2：称取0.11099g无水cacl2，用蒸馏水使其完全溶解，定容至100ml；④1mtris-hcl缓冲液：取45.7ml1mhcl溶液，与50ml1mtris溶液混匀待用。)

上述步骤三所述检测酶活力的方法是取250μl无细胞粗提液，加入50μl4％的肝素钠(150iu/mg)和200μl0.2mol/lph7.0cacl2-tris-hcl缓冲液，37℃水浴保温，测酶活，取出5μl反应液，加入5ml0.002％的天青a溶液，测a505，根据标准曲线确定反应液中未降解肝素的浓度从而得出肝素的降解量，酶活单位定义为37℃ph7.0的条件下每小时降解lmg肝素所需的酶量为一个单位；

计算：x＝a×10^-3×0.4×10⁶×1/t

x—样品中的肝素酶活力，u/l；

a—单位时间内降解的肝素的量，μl；

t—反应作用的时间，h；

0.4×10⁶—稀释倍数。

上述标准曲线制定方法：准确称取一定量的肝素钠，用蒸馏水配制成0.8％的肝素钠溶液，将其进行不同梯度的稀释，配成0.1～0.8％的肝素溶液；取9支试管，一支加入5μl蒸馏水作空白对照,其它试管依次加入5μl0.1％～0.8％的肝素钠标准溶液；最后，每支试管加入5ml0.002％天青a溶液，混匀后于酶标仪上测a505，每支试管做三个平行实验。

上述测酶活的时间，应从放入37℃水浴保温起每隔30min测一次酶活，在1.5h后停止，计算酶活时以1.5h时间为单位来计算。

本发明提供的肝素酶高产菌株以及选育方法，解决了肝素酶源微生物原有筛选方法耗时、耗力、耗材的弊端，利用鱼精蛋白和肝素反应生成的沉淀作为指示物，大大的节省人力、物力和时间，同时提高了肝素酶的产量。

[附图说明]

图1为肝素酶高产菌株选育方法的流程图。

图2为菌落透明圈出现。图中1为透明圈。

图3为产肝素酶菌株16srdnapcr扩增琼脂糖电泳图。

图4为raoultellasp.nx-tz-3,1516srdna序列ncbi比对结果。

图5为不同产肝素酶菌株发酵液的酶活比较。

[具体实施方式]

为了使本发明实现的技术手段清晰明了，下面进一步阐述本发明。

实施例：将1.0g采集的土壤样品加入盛有10ml无菌生理盐水的试管中摇匀后，取5ml悬浮液，加入盛有25ml富集培养基的三角瓶中，200r/min，37℃摇瓶培养2天。将经富集培养的菌液用无菌生理盐水梯度稀释到合适的稀释度，取适量的菌液涂布于初筛平板上。待平板上的菌株长到一定大小后，用蒸馏水洗去菌落，加入2％的鱼精蛋白溶液，于37℃放置1h。将鱼精蛋白溶液倒掉，用蒸馏水洗净，于室温放置一段时间，在原菌落生长处就会有透明圈出现。选择透明圈与菌落直径比值较大的菌株转移种子培养基中。挑取初筛平板上有透明圈的菌落接入种子培养基，200r/min，37℃，摇瓶培养24h，再按5％的接种量转入复筛培养基，200r/min，37℃，摇瓶培养72h。制备无细胞粗提液，于a505测酶活，获得产肝素酶菌株1株，经16srdna菌株鉴定为raoultellasp.nx-tz-3,15。

如图5所示，通过实验数据比较，不同产肝素酶菌株发酵液的酶活中，raoultellasp.nx-tz-3,15能够产生347.99iu/l，而xc-1酶活为127.46iu/l，xc-2酶活为233.24iu/l，xc-3酶活为49.17iu/l，xc-4酶活为25.89iu/l，可以看出raoultellasp.nx-tz-3,15菌株远高于其它产肝素酶菌株。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施方式，凡是属于本发明原理的技术方案均属于本发明的保护范围。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明的原理的前提下进行的若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。