一种快速纯化Stoffel片段Taq酶的方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速纯化Stoffel片段Taq酶的方法。

背景技术：

聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学研究中使用最广泛的DNA聚合酶，在PCR过程中，需要来源于高温下稳定的Thermus aquaticus的DNA聚合酶。基因工程菌株的发展，大大提高了Taq酶的产量。Lawyer等首次报道了全长Taq聚合酶的基因序列，其编码832个氨基酸，产生94KDa的Taq酶。随后，它们对Taq的N端进行了截短改良，使之表达544个氨基酸，61KDa的蛋白。与全长Taq聚合酶相比，缺失5’-3’内切酶活性，可以在PCR扩增中，提高保真度；此外，Stoffel片段Taq酶具有更高的耐热特性，97.5℃下半衰期为21分钟，而全长Taq仅为9分钟。这两个特性使Stoffel片段Taq酶在生物技术应用中使用更广泛。

由于Stoffel片段Taq聚合酶的广泛应用，有必要发展出一种简单、高效的纯化方式来大量获取Stoffel片段Taq酶，以满足实验室对Taq酶的需求。利用Stoffel片段的耐热特性，本申请发展了一种简单、便利的纯化方法，使用这一方法，整个纯化过程仅需1～2小时，1L菌液可以得到80mg，约1.6×10⁷个单位的Taq酶。与现有纯化技术相比，该方法不仅简单，而且省时。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种简单、快速、实用的提取纯化TaqDNA聚合酶的方法。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种快速纯化Stoffel片段Taq酶的方法，具体包括以下步骤：

1)工程菌的活化和表达：取Stoffel片段Taq DNA聚合酶工程菌接种在LB培养基中，于37℃培养过夜；

2)按照比例，取菌液接种于LB培养基中，于37℃继续培养至OD₆₀₀为0.4，加入IPTG至终浓度为0.5mM，继续培养12-16小时；

3)于4000g离心5min，收集菌体，用4×Taq storage buffer重悬菌体，菌体被置于沸水浴中，煮沸裂解；

4)裂解后在4℃下16000g离心10min除去细胞残体和变性后的蛋白，上清液采用水相/有机磷酸系统处理后备用。

本发明所述的LB培养基中含有100μg/ml的Kan。

本发明所述的菌液与LB培养基按照体积比1:100接种。

本发明所述的Taq storage buffer具体为：20mM Tris-HCl pH 8.0,10mM DTT,0.1mM EDTA,100mM KCl,0.5％Nonidet P40,0.5％Tween 20。

本发明所述的沸水浴加热条件为：每4min一个循环，共两个循环，加热8min。

本发明步骤(4)所述的上清液处理方法具体为：加入10％无菌平衡磷酸二氢钾混匀，加等体积的无水乙醇混匀，2000g离心2min，在含有Taq酶的上层有机相中加入等体积无菌甘油，贮于-20℃。

本发明的有益效果为：1)快速：在单一的贮存缓冲液，仅需1-2个小时就可完成整个纯化过程，且不需特殊设备和不使用有毒试剂；2)可靠稳定：经稀释10倍后的Taq酶于-20℃贮藏12个月后，其活性没有发生改变；经37℃到72℃的过夜保温测试，也没有发现核酸酶的活性；3)采用aqueous/organic系统来简便和高效的去除核酸污染，不会降低Taq酶的产量。

附图说明

图1是采用所纯化的Taq酶进行不同浓度稀释后对aadA基因进行PCR扩增的结果；

图2是商业化Taq酶同本技术纯化的Taq酶采用不同片段大小的基因进行扩增的结果；

图3是所纯化的Stoffel片段的SDS-PAGE电泳结果；

图4是不同处理时间所纯化的Stoffel片段SDS-PAGE电泳结果；

图5是Aqueous/Organic biphasic系统处理前后煮沸上清液中核酸污染情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1

1)材料和方法

菌株与质粒

pBio-Taq表达载体由丁雄飞博士友好赠送，其基本载体为pET-29a。其中，含有T7启动子和Taq基因序列。与Lawyer等报道相一致，该基因表达61KDa的Stoffel片段。BL21(DE3)作为载体寄主，细菌带有pLysS质粒使其更易于破碎释放出重组蛋白。

2)截短的Taq聚合酶Stoffel片段的纯化

转化BL21细菌的质粒被接种在5ml含kan(100μg/ml)的LB培养基中，于37℃培养过夜。按照1：100比例，取1ml菌液接种于100ml含Amp(100μg/ml)的LB培养基中，于37℃继续培养至OD600为0.4，加入IPTG至终浓度为0.5mM，继续培养12-16小时。于4000g离心5min，收集菌体，用5ml 4×Taq storage buffer(20mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM DTT,0.1mM EDTA,100mM KCl,0.5％Nonidet P40,0.5％Tween 20)重悬菌体，菌体被放入沸水浴不同时间(0-12min)和次数(4min per cycle)。煮沸裂解后，4℃下16,000g离心10min除去细胞残体和变性后的蛋白，然后转上清入新管。为了除去污染的核酸，上清液采用水相/有机磷酸系统，含有Taq酶的上层有机相转入新管，加入等体积无菌甘油，贮于-20℃，使用前进行适当稀释。

实施例2蛋白分析和活性测定

1)实验方法

采用Bradford法测定Taq蛋白的浓度。取10μl实施例1纯化所得样品进行SDS-PAGE电泳估计蛋白成分。

将所纯化的截短Taq聚合酶稀释后，进行PCR扩增，以测定其酶活性，采用Takara公司Taq酶作为对照。纯化的截短Taq聚合酶用1×Taq storage buffer按1:5,1:10,1:20,1:50进行稀释，扩增PU C18的克隆片段。50μl体系中，采用0.2(l的Taq酶，反应体系为1×PCR reaction buffer(10mM KCl,20mM Tris-HCl(pH 8.8),10mM(NH4)2SO4,0.1％TritonX-100,0.1mg/ml BSA)，0.2mM d NTPs,2.0mM MgSO4,0.2(M引物(5’-atggcaccacaaacagagg-3’和5’-ttatttgccgactaccttgg-3’)扩增800bp的aadA基因(编码aminoglycoside 3’-adenylytransferase)，25ng模板DNA。

反应条件为:95℃总变性3min，94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸180s，共进行30个循环,PCR反应在MJ research Minicycler(美国)反应仪上进行。PCR程序完成后，分别取1μl,2μl,5μl,10μl PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析，缓冲液为TBE，分子量标准采用DL2000。为了测试Taq酶对不同大小片段的扩增能力，分别扩增了500bp的IGF-1基因,1500bpBADH基因和2.7kb的烟草叶绿体trnI-trnA基因片段，以验证Taq酶的扩增效率。

2)结果

采用商业化的Taq酶作为对照，进行梯度稀释，对所纯化的Taq 酶Stoffel片段通过PCR扩增，进行了活性测定(图1)。

使用稀释10倍的Taq酶所扩增的0.8kb的片段，取1μl PCR产物进行电泳，其产量与商业化的Taq酶2μl PCR产物相当(泳道2)，因此，使用稀释10倍的Taq酶其活性是商业化的Taq酶活性的2倍。所以，稀释10倍的Taq酶活性为10units/μl，母液浓度为100units/μl。根据这个结果，可以得出，1L的菌液可以得到1.6×10⁷units的Taq酶。此外，当Taq酶稀释至20或50倍后，仅有很少的酶活力发现。

为了验证Taq酶的稳定性，采用不同片段大小的DNA片段进行扩增，结果如图2。稀释10倍后的Taq酶与商业化的Taq酶(Takara)分别扩增0.5kb至3.0kb的DNA片段。结果表明，所纯化的Taq酶与商业化的Taq酶扩增结果一致。

实施例3纯化方法的建立

1)煮沸裂解时间的确定

为了比较不同煮沸裂解时间对Taq酶Sottfel片段纯化的影响，采用0,2,4,6,8,10和12min等7个煮沸时间来进行分析,结果如图3所示。

从图3中,预期的Stoffel fragment(61kDa)被释放到4-fold Taq storage buffer,煮沸8分钟具有较高的Taq酶产量，且没有杂蛋白污染。未煮沸对照没有Taq蛋白发现。在未采用IPTG诱导的对照中，仅有微量的Taq酶产生。

2)煮沸次数

本实验中，采用煮沸4分钟后，4℃，16,000g离心10min，来作为一个循环。结果如图4，经2个循环，共煮沸8分钟后，Taq酶被高量产生。同时，发现经三次循环，Taq酶产量有所降低。同时，从图中可以看出，很少有其它的杂蛋白污染。

3)通过Aqueous/Organic biphasic系统除去核酸污染

为了验证核酸污染，取10μl煮沸上清液进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图5。

结果显示，未经biophasic处理的样品存在有核酸污染(泳道1-3)。为了消除核酸污染，采用2个简单步骤来进行：1)加入10％无菌平衡磷酸二氢钾(pH10.3)，混匀几秒；2)加等体积的无水乙醇进入上步骤1中的溶液中，混匀几秒。2,000g离心2min，包含有Taq酶的上清液转入新管，加入等体积无菌甘油后，贮于-20℃。通过以上步骤，可以有效的去除核酸污染(泳道4)。

综上所述，与前人的报道相比，本方法有以下几个优势：在单一的贮存缓冲液，仅需1-2个小时就可完成整个纯化过程，且不需特殊设备和不使用有毒试剂。1L菌液可以得到80mg，约1.6×107个单位的Taq酶，结果与Desai和Lawyer’s等报道的相一致。经稀释10倍后的Taq酶于-20℃贮藏12个月后，其活性没有发生改变。经37℃到72℃的过夜保温测试，也没有发现核酸酶的活性。

在对纯化条件的优化过程中，还考虑到了Taq酶的产量，实验表明，煮沸时间和次数对酶的产量有一定的影响。2次循环，煮沸8分钟是最适的，在这样的条件下，大量的大肠杆菌蛋白被变性去除，同时，Taq酶释放进上清液中。煮沸时间超过8分钟，Taq酶产量有所降低。此外，离心率也对蛋白的纯化有一定影响，推荐采用4℃下16,000g离心10min来去除蛋白。

在Taq酶纯化过程中，如果采用进行RAPD等分析，有必要去除核酸的污染。在前人的研究中，几种方法被用来去除核酸污染，例如PEI制备和离子交换层析、8-methoxypsoralen处理、UV光照处理、限制内切酶消化和透析。这些方法不仅费时，且有可能降低Taq酶的产量。本文中采用了aqueous/organic系统来简便和高效的去除核酸污染。

总之，本申请提供了一种更可靠、更快和简单的纯化Taq酶的方法。使用煮沸法，可以在1-2小时完成大量高活性的Taq酶的纯化，该方法可为PCR扩增技术的广泛应用提供新的纯化技术。