葡萄糖脱氢酶及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及生物领域中的葡萄糖脱氢酶及其编码基因与应用。

背景技术：

在农业生产上，增施磷肥是一种“高投入，低产出”的途径。我国每年大约消耗2100万～2200万吨磷肥，但是磷肥当季作物利用率仅为5％-25％，90％左右的磷肥施入土壤后很快被化学固定，形成溶解性极低的磷酸钙、铁、铝等化合物。磷是不可再生资源，随着磷矿储备的不断消耗，我国可能面临磷矿短缺而严重制约粮食生产。其实土壤中本不缺磷,但是它在土壤中的有效性非常低,多为难溶性的无机磷，植物很难吸收利用。因此，活化土壤中无效磷素，是农业生产急需解决的问题之一。

葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase，GDH)属于短链乙醇脱氢酶家族的一员，在辅酶存在下，能够催化D-葡萄糖转化成D-葡萄糖酸-δ-内酯，而生成的D-葡萄糖酸-δ-内酯会进一步自发地水解成葡萄糖酸。研发具有高活性的葡萄糖脱氢酶进而构建葡萄糖脱氢酶溶磷工程菌，可以显著提高溶磷细菌分解土壤无机磷的能力，在活化土壤无效磷素、提高磷肥利用率、减少磷肥投入方面具有重大价值。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有较高酶活性的葡萄糖脱氢酶。

本发明所提供的葡萄糖脱氢酶，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)由SEQ ID No.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；

d)将SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。

上述葡萄糖脱氢酶中，a)所示的蛋白质的名称为CrGDH3A；SEQ ID No.2由796个氨基酸残基组成。

上述葡萄糖脱氢酶中，b)所示的蛋白质的名称为CrGDH3A-His，SEQ ID No.2所示的CrGDH3A的N端连接MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的融合蛋白，SEQ ID No.6由817个氨基酸残基组成。

上述葡萄糖脱氢酶中，蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。

编码上述葡萄糖脱氢酶的核酸分子也属于本发明的保护范围。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述核酸分子具体可为如下1)或2)或3)所示的葡萄糖脱氢酶的编码基因：

1)编码序列(CDS)是SEQ ID No.1所示的DNA分子，其名称为CrGDH3A基因；

2)编码序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子，其名称为CrGDH3A-His基因；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述葡萄糖脱氢酶的DNA分子。

所述核酸分子中，“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

下述A1)、A2)或A3)的应用也属于本发明的保护范围：

A1)上述蛋白质在作为葡萄糖脱氢酶中的应用，

A2)上述核酸分子在制备葡萄糖脱氢酶中的应用，

A3)上述核酸分子在构建具有溶磷活性微生物中的应用。

本申请中，所述溶磷活性是指将无机磷转化为可溶性磷的能力。其中，可溶性磷指能溶解到水中或溶解到弱酸中后可被植物吸收利用的磷。可溶性磷包括水溶性磷和/或可交换性磷。所述无机磷可为难溶的磷酸盐(如磷酸三钙或磷酸铝)或磷矿粉。

本发明还提供了制备上述葡萄糖脱氢酶的方法。

本发明所提供的制备上述葡萄糖脱氢酶的方法，包括使上述葡萄糖脱氢酶的编码基因在生物中进行表达得到上述葡萄糖脱氢酶的步骤；所述生物可为微生物、植物或非人动物。

上述方法中，所述使上述葡萄糖脱氢酶的编码基因在生物中进行表达包括将上述葡萄糖脱氢酶的编码基因导入受体微生物，得到表达上述葡萄糖脱氢酶的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到上述葡萄糖脱氢酶。

上述方法中，所述受体微生物可为原核微生物。

上述方法中，所述原核微生物具体可为革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。

上述方法中，所述革兰氏阴性细菌具体可为埃希氏菌属细菌。所述革兰氏阳性细菌具体可为芽孢杆菌属细菌。

上述方法中，所述埃希氏菌属细菌具体可为大肠杆菌。所述芽孢杆菌属细菌可为巨大芽孢杆菌。

上述方法中，上述葡萄糖脱氢酶的编码基因可通过重组表达载体pET–CrGDH3A导入所述受体微生物；所述pET–CrGDH3A是用SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因替换pET-28a(+)的NdeI和Bam HI识别位点间的片段得到的重组表达载体。pET–CrGDH3A含有SEQ ID No.5所示的His标签融合蛋白CrGDH3A-His编码基因，CrGDH3A-His编码基因编码的蛋白质CrGDH3A-His的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。CrGDH3A-His是SEQ ID No.2所示的CrGDH3A的N端连接MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的融合蛋白。

上述方法中，上述葡萄糖脱氢酶的编码基因还可通过重组表达载体pWH–CrGDH3A导入所述受体微生物；所述pWH–CrGDH3A是用SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因正向替换pWH1520的2个BamHI识别位点间的片段得到的重组表达载体。pWH–CrGDH3A含有序列表中SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因，pWH–CrGDH3A表达是SEQ ID No.2所示的蛋白质CrGDH3A。

实验证明，在模式细菌原核表达中(大肠杆菌为受体菌)，葡萄糖脱氢酶CrGDH3A和CrGDH3A-His均具有较高的葡萄糖脱氢酶活性，葡萄糖脱氢酶CrGDH3A-His在25℃pH7.8的条件下其葡萄糖脱氢酶的酶活力为39.47±1.03U/mg蛋白；在溶磷工程菌中(巨大芽孢杆菌WH320为受体菌)，葡萄糖脱氢酶CrGDH3A在40℃，pH7.4的条件下的葡萄糖脱氢酶的酶活力为36.53±1.16U/mg。本发明为应用基因工程手段培育磷高效农作物新品种以及高效活化土壤磷素养分的生物工程菌提供重要基因资源，有助于推动溶磷工程菌从实验室研发阶段向田间应用阶段迈进。

附图说明

图1为pET–CrGDH3A和pET–CrGDH3B的物理图谱。其中，gdh3为CrGDH3A基因或CrGDH3B基因。

图2为在大肠杆菌中诱导表达葡萄糖脱氢酶的SDS-PAGE图谱。其中，1：蛋白Marker；2：大肠杆菌BL21(DE3)；3：pET–CrGDH3A/BL21；4：pET-30a(+)/BL21；5：pET-CrGDH3B/BL21。箭头示目的条带。

图3为pWH-CrGDH3A的物理图谱。其中，gdh3gene为CrGDH3A基因。

图4为在葡萄糖脱氢酶工程菌中表达葡萄糖脱氢酶的SDS-PAGE图谱。其中，M：蛋白Marker；1：胞内沉淀；2：胞内上清；3：胞外上清。

图5为pH对葡萄糖脱氢酶工程菌中表达的葡萄糖脱氢酶的酶活性影响。

图6为温度对葡萄糖脱氢酶工程菌中表达的葡萄糖脱氢酶的酶活性影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、葡萄糖脱氢酶CrGDH3的制备及功能验证

一、重组表达载体的构建

为了提高葡萄糖脱氢酶的活性，将Genbank Accession Number WP_012904518所示的来源于柠檬酸杆菌Citrobacter rodentium萄糖脱氢酶(以下称为CrGDH3B，简称3B)进行氨基酸残基的替换得到葡萄糖脱氢酶CrGDH3A(简称3A)。CrGDH3A的氨基酸序列为SEQ ID No.2，CrGDH3B的氨基酸序列为SEQ ID No.4，CrGDH3A和CrGDH3B的差异氨基酸残基如表1和表2。

表1、CrGDH3A和CrGDH3B的差异氨基酸残基

表2、CrGDH3A和CrGDH3B的差异氨基酸残基

分别制备SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因和SEQ ID No.3所示的CrGDH3B基因。

用SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因替换pET-28a(+)(EMD Biosciences，购置于北京新经科公司，大小为5369bp)的NdeI和Bam HI识别位点间的片段，保持pET-28a(+)其他序列不变，得到重组表达载体，将其命名为pET–CrGDH3A(图1)。pET–CrGDH3A含有SEQ ID No.5所示的His标签融合蛋白CrGDH3A-His编码基因，CrGDH3A-His编码基因编码的蛋白质CrGDH3A-His的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。CrGDH3A-His是SEQ ID No.2所示的CrGDH3A的N端连接MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的融合蛋白。

用SEQ ID No.3所示的CrGDH3B基因替换pET-28a(+)(EMD Biosciences，购置于北京新经科公司，大小为5369bp)的NdeI和Bam HI识别位点间的片段，保持pET-28a(+)其他序列不变，得到重组表达载体，将其命名为pET–CrGDH3B(图1)。pET–CrGDH3B含有SEQ ID No.7所示的His标签融合蛋白CrGDH3B-His编码基因，CrGDH3B-His编码基因编码的蛋白质CrGDH3B-His的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。CrGDH3B-His是SEQ ID No.4所示的CrGDH3B的N端连接MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的融合蛋白。

二、表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌的制备

1、CrGDH3A-His的表达

将步骤一的pET–CrGDH3A用氯化钙法转化大肠杆菌BL21(DE3)(天根公司)，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆筛选培养，挑取单克隆，以P1(5′-ATGGCTATTAACAATACAGGCTC-3′)和P2(5′-TTATTTCACATCATCCGGCAGCG-3′)为引物进行PCR鉴定，将PCR鉴定得到2391bp PCR产物的阳性克隆作为基因工程菌，命名为pET–CrGDH3A/BL21。挑取pET–CrGDH3A/BL21菌株，接种于含100ug/ml卡那霉素的LB培养基(在LB培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为100μg/ml得到的培养基)中，37℃培养至0D₆₀₀值(以含100μg/ml卡那霉素的LB培养基为空白对照)达到0.6时，加入IPTG至终浓度lmM，在150r/min的转速下28℃诱导6h，收集培养液经4000r/min离心20min后，用50mM Tris-HCl(pH7.1)重悬菌体得到菌体含量为10⁸cfu/ml的菌体悬浮液，菌体悬浮液经超声破碎30min(50％功率，工作10s，间歇20s)，在破碎细胞悬浊液中加入Triton-X100至终浓度为1％，在4℃浸提过夜，12 000r/min离心10min，收集上清液(含菌体总蛋白质)，将该上清液命名为CrGDH3A-His粗酶液。

2、CrGDH3B-His的表达

将步骤二的pET–CrGDH3B用氯化钙法转化大肠杆菌BL21(DE3)(天根公司)，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆筛选培养，挑取单克隆，以P3(5′-ATGGCTGAAAACAATGCACG-3′)和P4(5′-TTACTTCTCGTCGTCCGGCA-3′)为引物进行PCR鉴定，将PCR鉴定得到2391bp PCR产物的阳性克隆作为基因工程菌，命名为pET–CrGDH3B/BL21。挑取pET–CrGDH3B/BL21菌株，接种于含100μg/ml卡那霉素的LB培养基(在LB培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为100μg/ml得到的培养基)中，37℃培养至0D₆₀₀值(以含100μg/ml卡那霉素的LB培养基为空白对照)达到0.6时，加入IPTG至终浓度lmM，在150r/min的转速下28℃诱导6h，收集培养液经4000r/min离心20min后，用50mM Tris-HCl(pH7.1)重悬菌体得到菌体含量为10⁸cfu/ml的菌体悬浮液，菌体悬浮液经超声破碎30min(50％功率，工作10s，间歇20s)，在破碎细胞悬浊液中加入Triton-X100至终浓度为1％，在4℃浸提过夜，12 000r/min离心10min，收集上清液(含菌体总蛋白质)，将该上清液命名为CrGDH3B-His粗酶液。

3、空载体对照菌

按照与步骤1相同的方法将pET-28a(+)转入大肠杆菌BL21(DE3)，将得到的重组大肠杆菌名为pET-28a(+)/BL21。将pET-28a(+)/BL21作为空载体对照菌按照上述步骤1的方法进行诱导表达制备菌体总蛋白。挑取pET-28a(+)/BL21菌株，接种于含100μg/ml卡那霉素的LB培养基(在LB培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为100μg/ml得到的培养基)中，37℃培养至0D₆₀₀值(以含100μg/ml卡那霉素的LB培养基为空白对照)达到0.6时，加入IPTG至终浓度lmM，在150r/min的转速下28℃诱导6h，收集培养液经4000r/min离心20min后，用50mM Tris-HCl(pH7.1)重悬菌体得到菌体含量为10⁸cfu/ml的菌体悬浮液，菌体悬浮液经超声破碎30min(50％功率，工作10s，间歇20s)，在破碎细胞悬浊液中加入Triton-X100至终浓度为1％，在4℃浸提过夜，12 000r/min离心10min，收集上清液(含菌体总蛋白质)，将该上清液命名为空载体对照菌粗酶液。

4、空白对照菌大肠杆菌BL21(DE3)

将大肠杆菌BL21(DE3)作为空白对照菌按照上述步骤1的方法进行诱导表达制备菌体总蛋白。挑取大肠杆菌BL21(DE3)菌株，接种于LB培养基中，37℃培养至0D₆₀₀值(以LB培养基为空白对照)达到0.6时，加入IPTG至终浓度lmM，在150r/min的转速下28℃诱导6h，收集培养液经4000r/min离心20min后，用50mM Tris-HCl(pH7.1)重悬菌体得到菌体含量为10⁸cfu/ml的菌体悬浮液，菌体悬浮液经超声破碎30min(50％功率，工作10s，间歇20s)，在破碎细胞悬浊液中加入Triton-X100至终浓度为1％，在4℃浸提过夜，12 000r/min离心10min，收集上清液(含菌体总蛋白质)，将该上清液命名为空白对照菌粗酶液。

取30μL CrGDH3A-His粗酶液(来自10⁸cfu/ml pET–CrGDH3A/BL21)、30μL CrGDH3B-His粗酶液(来自10⁸cfu/ml pET–CrGDH3B/BL21)、30μL空载体对照菌粗酶液(来自10⁸cfu/ml pET-28a(+)/BL21)和30μL空白对照菌粗酶液(来自10⁸cfu/ml大肠杆菌BL21(DE3))在同一块胶上进行SDS-PAGE分析(分离胶浓度为12％)，该胶上的加样孔体积和形状均一致，加样孔体积为80μL。

SDS-PAGE结果如图2所示，表明虽然CrGDH3A-His粗酶液、CrGDH3B-His粗酶液、空载体对照菌粗酶液和空白对照菌粗酶液中均有87kD的条带，但CrGDH3A-His粗酶液和CrGDH3B-His粗酶液中87kD多肽的含量明显高于空载体对照菌粗酶液和空白对照菌粗酶液中87kD多肽的含量，而且CrGDH3A-His粗酶液中的87kD多肽的含量高于CrGDH3B-His粗酶液中87kD多肽的含量。说明CrGDH3A-His和CrGDH3B-His均在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了表达，而且CrGDH3A-His在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量明显高于CrGDH3B-His在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量。

三、测定CrGDH3A-His和CrGDH3B-His的葡萄糖脱氢酶的催化活性

取步骤二的CrGDH3A-His粗酶液、CrGDH3B-His粗酶液、空载体对照菌粗酶液和空白对照菌粗酶液分别用镍柱(购自美国通用公司的high-affinity Ni-NTA Rasin产品)进行纯化，将镍柱预处理，加入粗酶液，然后加入含咪唑洗脱液(50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl，250mM imidazole，pH8.0)4℃作用10min，3000rpm离心1min收集洗脱液，重复洗脱一次，收集洗脱液，取1ml洗脱液进行SDS-PAGE分析。CrGDH3A-His的序列测定结果表明其N末端的15个氨基酸为序列表中序列2的第1-15位氨基酸，CrGDH3B-His的序列测定结果表明其N末端的15个氨基酸为序列表中序列4的第1-15位氨基酸。

将上述收集的洗脱液用双蒸水透析，去盐离子，分别获得纯的CrGDH3A-His酶液、纯的CrGDH3B-His酶液、纯的空载体对照菌酶液和纯的空白对照菌酶液，作为待测酶液。待测酶液利用BCA蛋白质定量试剂盒定量测定蛋白质含量。

葡萄糖脱氢酶活性测定，以葡萄糖为底物，根据产生红色进行比色定量分析葡萄糖脱氢酶的活性。向50μL待测酶液(纯的CrGDH3A-His酶液、纯的CrGDH3B-His酶液、纯的空载体对照菌酶液或纯的空白对照菌酶液)中加入50μL pH7.8的缓冲液(向100mmol/L MOPS缓冲液中加入PQQ(吡咯喹啉醌)和CaCl₂，使PQQ含量为10μmol/L和CaCl₂含量为2mol/L得到的液体)，37℃预处理1小时以稳定酶的结构，得到预处理酶液。然后，向比色皿中加入1mL的50mmol/L的pH7.8的Tris-HCl缓冲液，然后再分别加入100μL的20mmol/L吩嗪硫酸甲酯溶液、6.7mmol/L 2,6–二氯靛酚钠(DCIP)溶液以及1mol/L葡萄糖溶液，混合均匀后加入50μL的预处理酶液，最后定容至3mL，反应温度为25℃，测定每分钟600nm下吸光值的变化。酶活力单位(U)定义为：25℃pH7.8的条件下，在1min内能够使1μ mol的葡萄糖氧化(或1μ mol DCIP还原)的酶量。葡萄糖脱氢酶比活力以每单位总蛋白中酶的活力进行计算，单位为U/mg。

实验设三次重复。结果表明纯的空载体对照菌酶液和纯的空白对照菌酶液没有葡萄糖脱氢酶活性，由pET–CrGDH3A/BL21表达的CrGDH3A–His的葡萄糖脱氢酶的酶活力为39.47±1.03U/mg蛋白，由pET–CrGDH3B/BL21表达的CrGDH3B-His的葡萄糖脱氢酶的酶活力为7.39±0.26U/mg蛋白。CrGDH3A-His的葡萄糖脱氢酶酶活力是CrGDH3B-His葡萄糖脱氢酶酶活力的5.34倍。pET–CrGDH3A/BL21的葡萄糖脱氢酶产量为25.65/10⁸cfu pET–CrGDH3A/BL21，pET–CrGDH3B/BL21的葡萄糖脱氢酶产量为5.09U/10⁸cfu pET–CrGDH3B/BL21。pET–CrGDH3A/BL21的葡萄糖脱氢酶产量是pET–CrGDH3B/BL21的5倍。

实施例2、具有溶磷活性重组微生物—葡萄糖脱氢酶溶磷工程菌的培育及其功能鉴定

1.葡萄糖脱氢酶CrGDH3A基因穿梭表达载体的构建

为了获得高效表达葡萄糖脱氢酶CrGDH3A基因的溶磷工程菌，首先需要构建能够跨宿主表达的穿梭表达载体。pWH1520表达载体(7929bp)是巨大芽孢杆菌高效的穿梭表达载体(德国MoBiTec公司产品，购置于北京拜尔迪生物技术公司)，xylA启动子下游携带BamHI酶切位点，具有氨苄和四环素抗性基因，能够稳定表达目的蛋白。

利用DNAMAN软件分析CrGDH3A基因序列，发现没有BamHI酶切位点，依据CrGDH3A基因完整编码区序列设计引物，在上下游引物均加入Bam HI酶切位点(GGATCC)。上下游引物分别为：P5：5′-ATGGATCCATGGCTATTAACAATACAGGCTC-3′和P6：5′-GCGGATCCTTATTTCACATCATCCGGCAGCG-3′)。以步骤一的pET–CrGDH3A为模板，利用上述P5和P6作为引物，利用PCR扩增的方法，在CrGDH3A基因完整编码区的5′端和3′分别引入BamHI酶识别位点，得到带有酶识别位点的CrGDH3A基因PCR产物；用BamHI酶切穿梭表达载体pWH1520和带有酶识别位点的CrGDH3A基因PCR产物，回收的酶切产物用T₄连接酶连接，连接产物转化后筛选阳性克隆，测序。由于是单酶切后再连接到表达载体，所以还需采用PCR并结合测序比对的方法筛选CrGDH3A基因正向插入穿梭表达载体pWH1520的阳性菌斑，提取重组质粒，最终获得CrGDH3A基因的穿梭表达载体。将测序结果表明是用SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因正向替换pWH1520的2个BamHI识别位点间的片段得到的重组表达载体命名为pWH–CrGDH3A(图3)。pWH–CrGDH3A含有序列表中SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因，pWH–CrGDH3A表达是SEQ ID No.2所示的蛋白质CrGDH3A。

2.葡萄糖脱氢酶工程菌的获得及其表达的CrGDH3A的酶学特征

采用原生质体转化法，将重组载体pWH-CrGDH3A转入巨大芽孢杆菌(WH320，购置上海北诺生物科技公司)，获得葡萄糖脱氢酶工程菌。将葡萄糖脱氢酶工程菌接入含四环素的LB培养基(在LB培养基中加入四环素至四环素的浓度为100μg/ml得到的培养基)中，培养过夜。以2％的接种量转接到上述含四环素的LB培养基中继续培养至对数生长期，加入木糖到终浓度为0.5％，诱导培养6h，室温下4000r/min转速离心15min，收集上清作为胞外上清；收集沉淀，加2倍体积磷酸缓冲液(pH6.0)，破碎细胞，得破碎细胞悬浊液。在破碎细胞悬浊液中加入Triton-X100至终浓度为1％，在4℃浸提过夜，12000r/min离心10min，上清液为胞内上清，沉淀为胞内沉淀。分别对胞内上清、胞内沉淀和胞外上清进行SDS-PAGE电泳分析以及酶活力测定。待测酶液利用BCA蛋白质定量试剂盒定量测定蛋白质含量。

按照实施例1的方法测定葡萄糖脱氢酶CrGDH3A的活性，实验重复三次。SDS-PAGE电泳结果(图4)显示，CrGDH3A基因可以在葡萄糖脱氢酶工程菌中可以正常表达，表达产物为胞内蛋白(胞内上清泳道)，表达产物分子量约为87kD。葡萄糖脱氢酶工程菌表达的CrGDH3A的葡萄糖脱氢酶酶活力为33.85±1.53U/mg。

3、pH对葡萄糖脱氢酶工程菌的催化活性的影响

将步骤2的葡萄糖脱氢酶工程菌接入含氨苄青霉素和四环素的LB培养基(在LB培养基中加入氨苄青霉素和四环素至氨苄青霉素和四环素的浓度均为100μg/ml得到的培养基)中，培养过夜。以2％的接种量转接到上述含四环素的LB培养基中继续培养至对数生长期，加入木糖到终浓度为0.5％，诱导培养6h，室温下4000r/min转速离心15min，收集沉淀，加2倍体积磷酸缓冲液(pH7.0)，破碎细胞，得破碎细胞悬浊液。在破碎细胞悬浊液中加入Triton-X100至终浓度为1％，在4℃浸提过夜，12000r/min离心10min，上清液即为葡萄糖脱氢酶粗酶液，作为待测酶液。

采用10个pH值不同的反应体系：柠檬酸-磷酸缓冲溶液体系(pH5.4反应体系、pH5.8反应体系、pH6.2反应体系、pH6.6反应体系和pH7.0反应体系)；Tris缓冲溶液体系(pH7.4反应体系、pH7.8反应体系、pH8.2反应体系、pH8.6反应体系和pH9.0反应体系)测定葡萄糖脱氢酶工程菌催化葡萄糖脱氢的能力。

上述10个pH值不同的反应体系均由待测酶液、吩嗪硫酸甲酯、2,6–二氯靛酚钠(DCIP)、葡萄糖和相应的缓冲溶液组成。

向50μL待测酶液中加入50μL相应pH值的缓冲液(向100mmol/L MOPS缓冲液中加入PQQ(吡咯喹啉醌)和CaCl₂，使PQQ含量为10μmol/L和CaCl₂含量为2mol/L得到的液体)，37℃预处理1小时以稳定酶的结构，得到预处理酶液。

向比色皿中分别加入1mL的50mmol/L的不同pH值缓冲液，然后再分别加入20mmol/L吩嗪硫酸甲酯、6.7mmol/L 2,6–二氯靛酚钠(DCIP)以及1mol/L葡萄糖各100μL，混合均匀后加入50μL的预处理酶液，最后定容至3mL，反应温度为25℃，测定每分钟600nm下吸光值的变化。酶活力单位(U)定义为：25℃条件下，在1min内能够使1μ mol的葡萄糖氧化(或1μ mol DCIP还原)的酶量。葡萄糖脱氢酶比活力以每单位总蛋白中酶的活力进行计算，单位为U/mg，以最高酶活作为100％，折算相对活性。实验重复三次。

葡萄糖脱氢酶工程菌催化活性的最适pH为7.4，在pH 6.6-7.8范围的酶活性为最适pH酶活性的80％，当pH5.4和pH5.8时，酶活性约为最适pH酶活性的20％，当pH8.6和pH 9时，酶活性不到最适pH酶活性的15％(图5)。

4、温度对葡萄糖脱氢酶工程菌的催化活性的影响

将步骤2的葡萄糖脱氢酶工程菌接入上述含氨苄青霉素和四环素的LB培养基中，培养过夜。以2％的接种量转接到上述含四环素的LB培养基中继续培养至对数生长期，加入木糖到终浓度为0.5％，诱导培养6h，室温下4000r/min转速离心15min，收集沉淀，加2倍体积磷酸缓冲液(pH7.0)，破碎细胞，得破碎细胞悬浊液。在破碎细胞悬浊液中加入Triton-X100至终浓度为1％，在4℃浸提过夜，12000r/min离心10min，上清液即为葡萄糖脱氢酶粗酶液，作为待测酶液。向50μL待测酶液中加入50μL pH7.4的缓冲液(向100mmol/L MOPS缓冲液中加入PQQ(吡咯喹啉醌)和CaCl₂，使PQQ含量为10μmol/L和CaCl₂含量为2mol/L得到的液体)，37℃预处理1小时以稳定酶的结构，得到预处理酶液。在Tris缓冲溶液体系中(pH7.4)，在20℃-70℃温度范围内测定葡萄糖脱氢酶工程菌催化葡萄糖的能力。反应体系由待测酶液、吩嗪硫酸甲酯、2,6–二氯靛酚钠(DCIP)、葡萄糖各和Tris缓冲溶(pH7.4)液体系组成。向比色皿中分别加入1mL的50mmol/L的Tris缓冲溶液(pH7.4)，然后再分别加入20mmol/L吩嗪硫酸甲酯、6.7mmol/L 2,6–二氯靛酚钠(DCIP)以及1mol/L葡萄糖各100μL，混合均匀后加入50μL的预处理酶液，最后定容至3mL，测定每分钟600nm下吸光值的变化。酶活力单位(U)定义为：在相应温度pH7.4条件下，在1min内能够使1μ mol的葡萄糖氧化(或1μ mol DCIP还原)的酶量。葡萄糖脱氢酶比活力以每单位总蛋白中酶的活力进行计算，单位为U/mg。

步骤2的葡萄糖脱氢酶工程菌诱导表达的葡萄糖脱氢酶CrGDH3A的最适反应温度为40℃，酶的活性达36.53±1.16U/mg，在30℃-45℃的范围内酶的活性维持在较高水平，50℃以后酶的活性则表现出迅速下降的趋势，超过70℃则很难检测到酶活性(图6)。

5、葡萄糖脱氢酶工程菌的溶磷效果

将步骤2的葡萄糖脱氢酶工程菌及巨大芽孢杆菌WH320(受体菌)分别接种于磷矿粉液体培养基、磷酸三钙液体培养基和磷酸铝液体培养基中，使葡萄糖脱氢酶工程菌和巨大芽孢杆菌WH320的含量均为10⁸cfu/mL，在37℃培养至对数生长期，加入木糖到终浓度为0.5％，37℃160r/min摇床培养，接种的磷酸三钙培养基和磷酸铝培养基在第7天取培养液，而接种的磷矿粉培养基在第14天取培养液。4℃下10000r/min转速离心10min，收集上清液，采用钼锑抗比色法，用722型分光光度计,在波长700nm，直接测定接种葡萄糖脱氢酶工程菌及巨大芽孢杆菌WH320(受体菌)培养液中水溶性磷(也称为有效磷或速效磷)含量，设不接菌的相应对照(CK)，下面给出的有效磷含量为扣除不接菌的相应对照(CK)的值，试验重复3次。

其中，磷矿粉液体培养基的pH为7.0，配制方法如下：将溶剂是水，溶质及其浓度如下的培养液在115℃灭菌30min：葡萄糖5g/L，木糖5g/L，NaCl 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，KCl 0.2g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，酵母浸膏0.5g/L，5克磷矿粉(云南澄江东泰磷肥有限公司，30％的P₂O₅含量,13％的含磷量)，加蒸馏水至1000ml。

磷酸三钙液体培养基的pH为7.0，配制方法如下：将溶剂是水，溶质及其浓度如下的培养液在115℃灭菌30min：葡萄糖5g/L，木糖5g/L，NaCl 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，KCl 0.2g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，酵母浸膏0.5g/L，磷酸三钙5.0g/L，加蒸馏水至1000ml。

磷酸铝液体培养基的pH为7.0，配制方法如下：将溶剂是水，溶质及其浓度如下的培养液在115℃灭菌30min：葡萄糖5g/L，木糖5g/L，NaCl 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，KCl 0.2g/L，(NH₄)₂SO₄0.5g/L，酵母浸膏0.5g/L，磷酸铝5.0g/L，加蒸馏水至1000ml。

结果表明，步骤2的葡萄糖脱氢酶工程菌在磷酸三钙液体培养基中培养7天的培养液的有效磷的含量为143.15±7.16μmol/L，在磷酸铝液体培养基中培养7天的培养液的有效磷的含量为78.90±3.95μmol/L，在磷矿粉液体培养基中培养14天的培养液的有效磷的含量为34.57±2.07μmol/L；作为受体菌的巨大芽孢杆菌WH320在磷酸三钙液体培养基中培养7天的培养液的有效磷的含量为12.35±0.62μmol/L，在磷酸铝液体培养基中培养7天的培养液的有效磷的含量为4.86±0.27μmol/L，在磷矿粉液体培养基中培养14天的培养液的有效磷的含量为2.47±0.12μmol/L。可见，步骤2的葡萄糖脱氢酶工程菌对磷酸三钙的溶磷能力是作为受体菌的巨大芽孢杆菌WH320的11.59倍，对磷酸铝的溶磷能力是作为受体菌的巨大芽孢杆菌WH320的16.23倍,对磷矿粉的溶磷能力是作为受体菌的巨大芽孢杆菌WH320的14.00倍。

<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120> 葡萄糖脱氢酶及其编码基因与应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2391

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2391)

<223>

<400> 1

atggctatta acaatacagg ctcgcgacga ctcctcgtgg tgttaacggc cctctttgca 60

gctctttgcg ggctgtatct tctcattggc ggaggctggt tggtcgccat tggcggctcc 120

tggtactacc cgatcgccgg tctggcgatg ctgggcgtcg cctggctgct gtggcgcagc 180

aaacgttccg cactctggct gtacgccgcc ctgctcctcg ccaccctgat ttggggcgtg 240

tgggaagttg gtttcgactt ctgggcgctg actccgcgca gcgacattct ggtcttcttc 300

ggcatctggc tgatcctgcc gtttgtctgg cgtcgcctgg tcattcctgc cagcggcgca 360

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aacgacccgc aggagatcga cggcgcgctc agcgcggagt cgacgcctgc acaggccatc 480

tcaccagtgg ctgacggcga ctggccggcg tatggccgca atcaggaagg tcaacgcttt 540

tcaccactga agcaaattca cgccgataac gtccacaagc tgaaagaagc ctgggtgttc 600

cgtactggcg atgtgaagca gccgaacgat ccgggtgaaa tcaccaatga agtgacgcca 660

attaaagtgg gcgacacgct gtatctgtgc accgctcacc agcgtctgtt cgcgctggag 720

gcggcgacgg gtaaagaaaa atggcattac gatcctgagc tgaaaaccaa cgagtctttc 780

cagcatgtaa cctgccgtgg tgtctcttat catgaagcca aagcagaaac tgcttcgccg 840

gaagtgatgg cggattgccc gcgtcgtatc attctcccgg tcaatgatgg ccgcctgatt 900

gcgattaacg ctgaaaacgg caagctgtgc gaaaccttcg ctaataaagg cgtgctcaat 960

ctgcaaagca atatgccaga caccaaaccg ggtctgtatg agccgacttc gccgccgatt 1020

atcaccgata aaacgattgt gattgctggt tcagtaacgg ataacttctc cacccgcgaa 1080

acctcgggcg tgatccgtgg ttttgacgtc aataacggta aactgctgtg ggcgttcgat 1140

ccgggtgcga aagacccgaa tgcaatccct tccgatgagc actcttttac ctttaactcg 1200

ccgaactcct gggcgccagc ggcctatgac gcgaagctgg acctcgttta cctgccgatg 1260

ggggtctcga cgccggatat ctggggcgga caccggacgc cggagcagga gcgctacgcc 1320

agttccattc tggcgctgaa cgcgaccacc ggtaaactcg cctggagcta tcagacggtt 1380

caccacgatc tgtgggatat ggacatgccg tcccagccga cgctggcgga tattaccgtc 1440

aacggtgaga aagtcccggt tatctacgcg ccagcgaaaa ccggtaacat ctttgtcctc 1500

gaccgccgta acggcgagct ggtcgttcct gcaccggaaa aaccggttcc gcagggggcc 1560

gcgaaaggcg attacgttac ccctactcaa ccgttctctg agctgagctt ccgtccgaca 1620

aaagatctaa gcggtgcgga tatgtggggt gccaccatgt ttgaccaact ggtgtgccgc 1680

gtgatgttcc accagatgcg ctatgaaggc attttcaccc caccatctga acagggtacg 1740

ctggtcttcc cgggtaacct ggggatgttc gaatggggcg gtatttcggt cgatccgaac 1800

cgtcaggtgg cgattgccaa cccgatggcg ctgccgttcg tctctaagct tattccacgc 1860

ggtccgggca acccgatgga acagccgaaa gatgcaaaag gcacaggcac cgaatccggc 1920

atccagccgc agtacggtgt accgtatggc gtcacgctca atccgttcct ctcaccgttt 1980

ggtctgccat gtaaacagcc agcatggggt tatatttcgg cgctggatct gaaaaccaat 2040

gaagtggtgt ggaagaaacg cattggtacg ccgcaggaca gcatgccgtt cccgatgccg 2100

gttccgcttc ccttcaacat ggggatgccg atgctcggcg ggcccatctc gactgccggt 2160

aacgtgctgt ttatcgccgc tacggcagat aactacctgc gcgcttacaa catgagcaac 2220

ggtgaaaaac tgtggcaggg tcgtctacca gcgggcggtc aggcaacacc gatgacctat 2280

gaggtgaacg gcaagcagta tgtcgtgatt tcagccgggg gccacggctc gtttggtacg 2340

aagatgggcg attatattgt cgcgtatgcg ctgccggatg atgtgaaata a 2391

<210> 2

<211> 796

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Ala Ile Asn Asn Thr Gly Ser Arg Arg Leu Leu Val Val Leu Thr

1 5 10 15

Ala Leu Phe Ala Ala Leu Cys Gly Leu Tyr Leu Leu Ile Gly Gly Gly

20 25 30

Trp Leu Val Ala Ile Gly Gly Ser Trp Tyr Tyr Pro Ile Ala Gly Leu

35 40 45

Ala Met Leu Gly Val Ala Trp Leu Leu Trp Arg Ser Lys Arg Ser Ala

50 55 60

Leu Trp Leu Tyr Ala Ala Leu Leu Leu Ala Thr Leu Ile Trp Gly Val

65 70 75 80

Trp Glu Val Gly Phe Asp Phe Trp Ala Leu Thr Pro Arg Ser Asp Ile

85 90 95

Leu Val Phe Phe Gly Ile Trp Leu Ile Leu Pro Phe Val Trp Arg Arg

100 105 110

Leu Val Ile Pro Ala Ser Gly Ala Val Ala Ala Leu Val Val Ala Leu

115 120 125

Leu Ile Ser Gly Gly Ile Leu Thr Trp Ala Gly Phe Asn Asp Pro Gln

130 135 140

Glu Ile Asp Gly Ala Leu Ser Ala Glu Ser Thr Pro Ala Gln Ala Ile

145 150 155 160

Ser Pro Val Ala Asp Gly Asp Trp Pro Ala Tyr Gly Arg Asn Gln Glu

165 170 175

Gly Gln Arg Phe Ser Pro Leu Lys Gln Ile His Ala Asp Asn Val His

180 185 190

Lys Leu Lys Glu Ala Trp Val Phe Arg Thr Gly Asp Val Lys Gln Pro

195 200 205

Asn Asp Pro Gly Glu Ile Thr Asn Glu Val Thr Pro Ile Lys Val Gly

210 215 220

Asp Thr Leu Tyr Leu Cys Thr Ala His Gln Arg Leu Phe Ala Leu Glu

225 230 235 240

Ala Ala Thr Gly Lys Glu Lys Trp His Tyr Asp Pro Glu Leu Lys Thr

245 250 255

Asn Glu Ser Phe Gln His Val Thr Cys Arg Gly Val Ser Tyr His Glu

260 265 270

Ala Lys Ala Glu Thr Ala Ser Pro Glu Val Met Ala Asp Cys Pro Arg

275 280 285

Arg Ile Ile Leu Pro Val Asn Asp Gly Arg Leu Ile Ala Ile Asn Ala

290 295 300

Glu Asn Gly Lys Leu Cys Glu Thr Phe Ala Asn Lys Gly Val Leu Asn

305 310 315 320

Leu Gln Ser Asn Met Pro Asp Thr Lys Pro Gly Leu Tyr Glu Pro Thr

325 330 335

Ser Pro Pro Ile Ile Thr Asp Lys Thr Ile Val Ile Ala Gly Ser Val

340 345 350

Thr Asp Asn Phe Ser Thr Arg Glu Thr Ser Gly Val Ile Arg Gly Phe

355 360 365

Asp Val Asn Asn Gly Lys Leu Leu Trp Ala Phe Asp Pro Gly Ala Lys

370 375 380

Asp Pro Asn Ala Ile Pro Ser Asp Glu His Ser Phe Thr Phe Asn Ser

385 390 395 400

Pro Asn Ser Trp Ala Pro Ala Ala Tyr Asp Ala Lys Leu Asp Leu Val

405 410 415

Tyr Leu Pro Met Gly Val Ser Thr Pro Asp Ile Trp Gly Gly His Arg

420 425 430

Thr Pro Glu Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ser Ile Leu Ala Leu Asn Ala

435 440 445

Thr Thr Gly Lys Leu Ala Trp Ser Tyr Gln Thr Val His His Asp Leu

450 455 460

Trp Asp Met Asp Met Pro Ser Gln Pro Thr Leu Ala Asp Ile Thr Val

465 470 475 480

Asn Gly Glu Lys Val Pro Val Ile Tyr Ala Pro Ala Lys Thr Gly Asn

485 490 495

Ile Phe Val Leu Asp Arg Arg Asn Gly Glu Leu Val Val Pro Ala Pro

500 505 510

Glu Lys Pro Val Pro Gln Gly Ala Ala Lys Gly Asp Tyr Val Thr Pro

515 520 525

Thr Gln Pro Phe Ser Glu Leu Ser Phe Arg Pro Thr Lys Asp Leu Ser

530 535 540

Gly Ala Asp Met Trp Gly Ala Thr Met Phe Asp Gln Leu Val Cys Arg

545 550 555 560

Val Met Phe His Gln Met Arg Tyr Glu Gly Ile Phe Thr Pro Pro Ser

565 570 575

Glu Gln Gly Thr Leu Val Phe Pro Gly Asn Leu Gly Met Phe Glu Trp

580 585 590

Gly Gly Ile Ser Val Asp Pro Asn Arg Gln Val Ala Ile Ala Asn Pro

595 600 605

Met Ala Leu Pro Phe Val Ser Lys Leu Ile Pro Arg Gly Pro Gly Asn

610 615 620

Pro Met Glu Gln Pro Lys Asp Ala Lys Gly Thr Gly Thr Glu Ser Gly

625 630 635 640

Ile Gln Pro Gln Tyr Gly Val Pro Tyr Gly Val Thr Leu Asn Pro Phe

645 650 655

Leu Ser Pro Phe Gly Leu Pro Cys Lys Gln Pro Ala Trp Gly Tyr Ile

660 665 670

Ser Ala Leu Asp Leu Lys Thr Asn Glu Val Val Trp Lys Lys Arg Ile

675 680 685

Gly Thr Pro Gln Asp Ser Met Pro Phe Pro Met Pro Val Pro Leu Pro

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Phe Asn Met Gly Met Pro Met Leu Gly Gly Pro Ile Ser Thr Ala Gly

705 710 715 720

Asn Val Leu Phe Ile Ala Ala Thr Ala Asp Asn Tyr Leu Arg Ala Tyr

725 730 735

Asn Met Ser Asn Gly Glu Lys Leu Trp Gln Gly Arg Leu Pro Ala Gly

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Gly Gln Ala Thr Pro Met Thr Tyr Glu Val Asn Gly Lys Gln Tyr Val

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Val Ile Ser Ala Gly Gly His Gly Ser Phe Gly Thr Lys Met Gly Asp

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<210> 3

<211> 2391

<212> DNA

<213> 柠檬酸杆菌Citrobacter rodentium

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2391)

<223>

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<210> 4

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<220>

<223>

<400> 4

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Val Ile Ser Ala Gly Gly His Gly Ser Phe Gly Thr Lys Met Gly Asp

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