本发明涉及食品微生物领域，特别是涉及到一种具有淀粉酶活力的扣囊复膜孢酵母（saccharomycopsisfibuligera）cicc33077及其在芝麻香型白酒中高温大曲中的应用。
背景技术：
囊复膜孢酵母（saccharomycopsisfibuligera）属于酵母目（saccharomycetales），复膜孢酵母科（saccharomycopsidaceae），复膜孢酵母属（saccharomycopsis），是一类产子囊孢子的二形态酵母；子囊呈卵圆形，游离状，通过出芽生殖形成酵母状细胞，具有发达的菌丝体，单个营养体细胞粘附在菌丝的末端或表面。扣囊复膜孢酵母酶系丰富，能够分泌淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶等多种水解酶，广泛应用于发酵行业。
大曲是我国固态白酒酿造特有的发酵剂，其含有大量微生物和酶类，在传统白酒酿造过程中发挥重要作用，酒离不开曲，曲决定酒。中高温大曲主要以小麦为原料，含有53%-70%的淀粉，在淀粉水解酶的作用下生成糊精，寡糖，麦芽糖和葡萄糖等小分子物质。这些小分子物质为大曲中的微生物生长提供能量，同时能够与氨基酸在高温条件下经缩合、分解、脱氨、脱羧等一系列反应生成白酒中的香味前体物质。本发明筛选得到的扣囊复膜孢酵母（saccharomycopsisfibuligera）cicc33077分离于山东扳倒井中高温大曲，菌丝体发达，淀粉酶活力高，能提高原料的利用率。将其应用于中高温大曲的制备过程中，发达的菌丝体能够改善大曲的内部结构，疏松大曲质地，分泌的淀粉酶能够充分降解大曲中的淀粉颗粒，提高原料的利用率，增强大曲液化力和糖化力，提高大曲品质。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株扣囊复膜孢酵母cicc33077，其特征在该菌具有淀粉酶活力，同时具有发达的菌丝体。
本发明的另一个目的是提供一种接种上述扣囊复膜孢酵母cicc33077的质地疏松，扣囊复膜孢酵母含量显著增加，曲块表面“穿衣”较好，断面整齐，曲皮较薄，糖化力和液化力更为突出的芝麻香型白酒中高温大曲。
本发明在于克服现有技术的不足，通过接种扣囊复膜孢酵母cicc33077，提高中高温大曲原料的利用率，制备品质优良的中高温大曲，为后续芝麻香白酒的生产奠定基础。
本发明的具体技术方案如下：
扣囊复膜孢酵母cicc33077为实验室从扳倒井中高温大曲分离得到的酵母菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc14189，保藏日期为2017年5月25日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏分类命名为扣囊复膜孢酵母saccharomycopsisfibuligera。该菌株菌落乳白色，平伏，质地绒状。产生大量真菌丝，细胞椭圆形或漏滴状，芽殖，部分菌丝产生大量的椭圆形芽孢子。
扣囊复膜孢酵母cicc33077具有较强的淀粉酶活力，在麸皮培养基中培养4d，淀粉酶活力能够达到7425.7u/g。将扣囊复膜孢酵母菌剂通过喷洒和混料两种方式强化大曲后，制备的大曲曲块表面“穿衣”较好，断面整齐，曲皮较薄，内部质地疏松，扣囊复膜孢酵母含量显著增加，糖化力和液化力显著增加，有利于提高中高温大曲原料的利用率。
附图说明
图1示发明所述扣囊复膜孢酵母cicc33077扫描电镜形态。
图2示发明所述扣囊复膜孢酵母cicc3307726srrna基因系统发育树。
图3示发明所述扣囊复膜孢酵母cicc33077淀粉酶活力测定结果。
图4示发明所述中高温大曲感官特征图。
图5示发明所述中高温大曲内部结构扫描电镜图。
具体实施方案
下面结合实施例对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不
能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1菌株cicc33077的鉴定
本发明中的的菌株cicc33077是从扳倒井公司生产的芝麻香型白酒中高温大曲中分离筛选得到，利用形态学和分子生物学等方法将该菌种鉴定为扣囊复膜孢酵母。
1、形态学鉴定
参照《yeast》对菌株cicc3307进行形态特征和鉴定，并对其进行扫描电镜观察（图1）。mea培养基，28℃，培养48h，菌落乳白色，平伏，质地绒状，直径9-11μm。产生大量真菌丝，细胞椭圆形或漏滴状，芽殖，菌丝产生大量的椭圆形芽孢子。
2、分子生物学鉴定
使用酵母菌基因组dna提取试剂盒提取菌株cicc33077的基因组。利用引物nl-1(5’-gcatatcaataagcggaggaaaag-3’)和nl-4(5’-ggtccgtgtttcaagacgg-3’)对26srrna基因进行扩增。pcr反应体系为：10×pcrbuffer5μl、dntp(2.5mmol/l)4μl、模板2μl、taqdna聚合酶1μl、引物各1μl,补充去离子水至50μl。反应条件：94℃预变性1min，94℃，1min；52℃，1min；72℃，90s；36个循环72℃后延伸10min。将所得的26srrna基因序列用blast软件与ncbi数据库进行相似性比对，运用mega5.0软件采用neighbor-joining方法构建系统发育树。菌株cicc33077与扣囊复膜孢酵母处于同一个分支（图2），再结合形态学特征，鉴定为扣囊复膜孢酵母。其26srrna基因序列登录号为mf324892。
实施例2扣囊复膜孢酵母cicc33077产淀粉酶活力研究
采用二硝基水杨酸法（dns法）测定扣囊复膜孢酵母cicc33077淀粉酶活力。将活化的菌株接种在麸皮培养基中，取发酵后的麸皮培养基1g，稀释250倍后，3500rpm离心20min后上清液为粗酶液。酶活测定体系：1ml粗酶液，9ml底物（1.1%淀粉缓冲液），在不同温度和ph值条件下反应20min，dns法测定还原糖含量（图3）。酶活定义：1g固体发酵物在最适温度和最适ph值下，每小时生成1μmol葡萄糖为1个酶活力单位。
测定结果表明，扣囊复膜孢酵母cicc33077产生的淀粉酶的最适温度为50℃，最适ph值为4，最高酶活力达到7425.7u/g。扣囊复膜孢酵母cicc33077通过产生淀粉酶，能够降解中高温大曲原料中的淀粉颗粒，提高中高温大曲原料的利用率。
实施例3扣囊复膜孢酵母cicc33077强化中高温大曲特性研究
将扣囊复膜孢酵母菌剂通过喷洒和混料两种方式强化大曲，共制备三房大曲，一房对照大曲，一房喷洒强化大曲，一房混料强化大曲，每房约1800块；进行大曲强化的曲房每块大曲加入7-8ml终浓度为6*105cfu/ml的菌液，对照曲房大曲不加扣囊复膜孢酵母菌剂。扣囊复膜孢酵母菌能够高效降解大曲原料，是大曲制备前期的优势菌，因此，选取第一次翻曲前为本研究的采样点。具体的采样方式：在曲房的四角和中间5个位置各取1块长势良好的曲块，混合均匀后，四分法进行采样，测定感官指标、微生物指标和理化指标。
1、中高温大曲感官指标测定
按照扳倒井股份有限公司的企业标准《大曲评分标准》（bdj/jw-wsw-06），从大曲的外观，断面以及曲皮厚度方面，对扣囊复膜孢酵母强化的中高温大曲和对照大曲感官进行评价。
对照大曲曲皮已干，曲块表面灰白色，穿衣一般，喷水面有少许深褐色，断面较整齐，周边干燥区域近1.0cm，曲皮较薄，有轻微水圈出现。喷洒方式强化的中高温大曲曲块表面长满白色菌斑（扣囊覆膜孢酵母）且分布均匀，粗糙面菌斑比光面密集，断面整齐，一侧有1.0cm白色干燥区域，曲皮较薄。混料方式强化的中高温大曲曲块光面穿衣较好且均匀，粗糙面白色菌斑（扣囊覆膜孢酵母）较密集，光面断面外围有大于0.5cm白色干燥区域，粗糙面曲皮较薄（图4）。因此，扣囊复膜孢酵母cicc33077强化后的大曲在感官指标方面明显优于对照大曲。
利用扫描电镜对扣囊复膜孢酵母强化的中高温大曲和对照大曲的内部结果进行观察。10g大曲样品在60℃温箱过夜干燥后，制备成2mm×2mm×2mm小曲块放置在样品台上使用喷金-离子溅射仪（bal-tecscd005）进行喷金后，使用扫描电镜hitachisu8010进行大曲内部结果的观察。实验结果表明，对照大曲较为致密，淀粉颗粒排列整齐，微生物数量较少，因此淀粉降解较少（图5a和d）；表面喷洒和内部混料接种扣囊复膜孢酵母cicc33077的大曲疏松，淀粉颗粒排列松散，微生物数量较多，大量菌丝体生长，通过微生物分泌淀粉酶水解原料中的淀粉颗粒，提高了原料的利用率，同时大曲内部的缝隙变大，有利于曲心的水分运输，避免水圈的生成（图5b、c、e和f）。
2、中高温大曲微生物指标测定
使用稀释涂布平板法对接种扣囊复膜孢酵母的中高温大曲和对照大曲中的酵母菌进行计数，再结合形态学和分子生物学技术鉴定酵母菌的分类学地位。计数结果如下表所示，扣囊复膜孢酵母强化的大曲中扣囊复膜孢酵母数量显著增加，数量能够达到107cfu/g，比对照大曲高一个数量级（106cfu/g），这与感官评价的结果是一致的，大量的扣囊复膜孢酵母能够产生更多的淀粉酶，水解原料中的淀粉颗粒，使得中高温大曲内部更为疏松，有利于曲心的水分运输，避免水圈的生成。
表1中高温大曲中扣囊复膜孢酵母计数结果
3、中高温大曲理化指标测定
按照扳倒井股份有限公司的企业标准《大曲评分标准》（bdj/jw-wsw-06），从水分含量、酸度、糖化力、发酵力及液化力方面对扣囊复膜孢酵母强化的中高温大曲和对照大曲进行评价。测定结果表明，喷洒方式强化大曲的糖化力和液化力分别为1361mg•g/g•h和5.6g•淀粉/g•h；混料方式强化大曲的糖化力和液化力分别为1301mg•g/g•h和4.6g•淀粉/g•h；均显著高于对照大曲（表2）。此外，大曲发酵力、酸度和水分在强化大曲和对照大曲间无明显变化。大曲理化指标测定表明添加扣囊复膜孢酵母cicc33077的大曲淀粉降解能力较强，能够充分利用原料，提高大曲中原料的利用率，有利于芝麻香型白酒中生产。
表2中高温大曲理化指标测定
测定结果表明，扣囊复膜孢酵母强化的中高温大曲在感官指标、微生物含量、糖化力与液化力方面均优于对照大曲。通过比较两种不同的强化方式，发现喷洒方式强化的大曲作用效果更为突出，其曲块表面白色菌斑（扣囊复膜孢酵母菌）分布均匀，断面整齐，曲皮较薄，糖化力与液化力优于混料方式强化的大曲，因此，推荐使用喷洒方式对传统中高温大曲进行强化。
sequencelisting
<110>中国食品发酵工业研究院；山东扳倒井股份有限公司
<120>一种扣囊复膜孢酵母及其在中高温大曲生产中的应用
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<213>saccharomycopsisfibuligeracicc33077
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