一种深海新型热稳定性碱性酯酶及应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种深海细菌来源新型热稳定性碱性酯酶、其编码基因及其应用。

背景技术：

海洋是一个巨大的微生物资源宝库，蕴含着大量的类型多样、功能未知的新型基因。近年来，为满足人们日益增长的生产和生活需求，一些能适应极端反应条件的应用酶在工业生产中发挥了重要的作用，从海洋等极端环境中筛选的具有耐高/低温、耐酸/碱、耐盐、耐重金属等新特性的功能基因也越来越受到人们的重视。脂类水解酶是一类能够催化酯类化合物的水解和合成的酶，在手性药物合成、食品加工及食品风味改良、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、废水处理等领域具有广泛的应用潜力。微生物由于其来源的酯酶具有产量高、反应稳定、副产物毒性小及分子生物学操作简单等优点，成为工业应用酯酶的主要来源。

碱性酯酶由于在高ph下具有较高或最好的活性，在药物合成、洗涤、原料脱脂和废水处理等工业中比中性酯酶更具应用潜力，已受到广泛关注。然而目前国内授权的碱性细菌酯酶专利还较少。中国专利201110208211.0提供了一种南海沉积物宏基因组来源的碱性酯酶。中国专利201510181731.5提供了一种嗜热脂环芽孢杆菌来源的碱性热稳定性酯酶，其反应最适ph和温度分别为8.5和65℃，并可在高ph和高温处理下保持较高活性。中国专利201510668911.6提供了一种盐湖嗜碱菌来源的低温碱性酯酶，其反应最适ph为9.0，并可在0℃条件下保持70％以上活性。

本发明从一种深海细菌中筛选到一种新型碱性酯酶基因，并对该基因进行了重组表达，重组酶具有碱性、热稳定性、耐金属离子和耐有机溶剂等特点，可用于精细化工、制药、洗涤和废水处理等工业领域。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新的深海细菌来源酯酶、其编码基因及其制备方法，该酯酶可用于酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。

本发明提供了一种能表达热稳定性碱性酯酶基因的菌株croceicoccusmarinuse4a9^t。该细菌分离自太平洋深海沉积物，分类命名为croceicoccusmarinus，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.1.6776，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(100101)，保藏日期为2007年4月9日。

本发明针对分离自深海沉积物的细菌croceicoccusmarinuse4a9^t，基于全基因组序列分析筛选获得酯酶基因e6，其核苷酸序列如seqidno.1所示。酯酶基因e6大小为1338bp，碱基组成为204a(15.25％)、206t(15.40％)、464c(34.68％)和464g(34.68％)，编码蛋白大小为445个氨基酸残基，其氨基酸序列如seqidno.2所示。将该酯酶e6序列在genbank中进行同源搜索，与之相似性最高的是同科(赤杆菌科erythrobacteraceae)细菌erythrobactersp.qssc1-22b中的酯酶，相似性为63％(其在genbank数据库中的注册号为obx19645.1)。系统发育分析结果表明，活性位点丝氨酸附近序列为具有甘氨酸-x-丝氨酸-x-甘氨酸组成的保守区(氨基酸位置为196至200)，198位丝氨酸与311位谷氨酸和353位组氨酸共同构成酯酶催化中心。综上所述，e6应为酯酶家族中的一名新成员。

在不影响酯酶e6蛋白活性前提下，可对seqidno:2所示的远离催化中心氨基酸位置(优选远离196-200、311和353氨基酸位置)的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶e6活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是与其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域(优选196-200、311和353氨基酸位置)的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。所述的能够基本保留原蛋白质的生物学功能是指衍生蛋白质具有80％以上的酯酶e6的生物学活性，优选具有90％以上的酯酶e6的生物学活性，更优选具有95％以上的酯酶e6的生物学活性。

优选的酯酶e6突变体具有至少与seqidno:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

更为优选的酯酶e6突变体具有至少与seqidno:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性及具有80％以上的酯酶e6的生物学活性，更优选具有至少95％以上的同源性及具有90％以上的酯酶e6的生物学活性，，最优选具有至少99％以上的同源性及具有95％以上的酯酶e6的生物学活性。

同理，本发明还提供了编码如seqidno.2所示氨基酸序列的基因序列，其与seqidno.1所示的核苷酸序列一致；本发明还提供对seqidno.1所示的核苷酸序列中除586-600、931-933、1057-1059位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留酯酶e6蛋白生物学活性的突变体基因。优选的酯酶e6突变体基因具有至少与seqidno:1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶e6基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶e6。合适的原核生物宿主包括各种细菌如e.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等，优选采用原核表达系统e.coli。

合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pet系列载体，pqe系列载体；酵母表达载体ppicz-α-a、phil-d2、ppic9和phil-s1(invitrogencorp.sandiego.california.usa)；动物细胞表达载体psvk3和pmsg(amershampharmaciabiotechinc.usa)等。一个优选的例子是将本发明筛选到的酯酶基因e6连接到大肠杆菌表达载体pet28-a上，并转化到e.colirosetta(de3)中，经诱导表达出高活性的重组酯酶。

本发明还提供了酯酶e6或能表达酯酶e6的宿主菌在工业上的应用，例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，酯酶e6或上述能表达e6酯酶的宿主菌可用于水解短链脂肪酸酯，例如c2-c8短碳链脂肪酸酯，同时对c10-c16的长碳链脂肪酸酯也具有一定降解作用。优选的短链脂肪酸脂为具有c2-c8短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯酚乙酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚己酸酯和对硝基苯酚辛酸酯等，其中底物为对硝基苯酚丁酸酯(c4)时催化活性最高，酶活为75.2u/mg。

酯酶e6催化水解温度范围为10～60℃，优选为45～55℃；所述水解的ph值为7.0～11.0，优选为10.0～11.0。e6在金属离子和有机溶剂存在下，仍能保持较高活性；在40、50和60℃中孵育60min和120min条件下，仍能保持50％和35％以上活性。

本发明从深海沉积物来源细菌croceicoccusmarinuse4a9^t中筛选获得新的热稳定性碱性酯酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化解酯和酶法合成酯产品生产过程中。获得的酯酶基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产热稳定性碱性酯酶，为后续的工业应用提供成本低廉的热稳定性碱性酯酶起始材料。该酶的生产可在食品加工、洗涤剂和废水处理等高温和高碱生产工艺中显示出重要的经济和社会价值。

附图说明

图1为纯化酯酶e6的聚乙酰胺凝胶电泳分析图。

图2为酯酶e6的底物特异性图。c2：对硝基苯酚乙酸酯；c4：对硝基苯酚丁酸酯、c6：对硝基苯酚己酸酯；c8：对硝基苯酚辛酸酯；c10：对硝基苯酚癸酸酯；c12：对硝基苯酚十二酸酯；c14：对硝基苯酚十四酸酯；c16：对硝基苯酚十六酸酯；定义底物为c4时测定值为100％。

图3为酯酶e6最适反应温度图。

图4为酯酶e6最适反应ph图。

图5为二价阳离子对酯酶e6活性影响图。

图6为有机溶剂和去垢剂对酯酶e6活性影响图。

图7酯酶e6热稳定性图。

具体实施方式

实施例1酯酶基因e6的获取

基于深海沉积物来源细菌croceicoccusmarinuse4a9^t全基因组、开放阅读框预测及基因注释结果，筛选脂类水解酶相关基因。通过blastx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知酯酶基因序列的同源性。经数据库比对分析获得e6基因，大小为1338bp，碱基组成为204a(15.25％)、206t(15.40％)、464c(34.68％)和464g(34.68％)，其核苷酸序列如seqidno:1所示。编码蛋白大小为445个氨基酸残基，其氨基酸序列如seqidno.2所示。将该基因序列在genbank中进行同源搜索，与之相似性最高的是同科(赤杆菌科erythrobacteraceae)细菌erythrobactersp.qssc1-22b中的酯酶，相似性为63％，其在genbank数据库中的注册号为obx19645.1。

氨基酸序列分析结果显示，酯酶e6属于酯酶第vii家族。活性位点丝氨酸附近序列为具有甘氨酸-x-丝氨酸-x-甘氨酸组成的保守区(氨基酸位置为196至200)，198位丝氨酸与311位谷氨酸和353位组氨酸共同构成酯酶催化中心。

综上所述，e6应为酯酶家族中的一名新成员。

实施例2酯酶基因e6的重组表达质粒和重组菌株的构建

将本发明获得的酯酶基因e6克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。基于ncbiorffinder的orf分析获得的酯酶基因的开放阅读框序列，设计扩增酯酶全基因的上游引物e6f(5’-tcgcggatccatgccgccttcgcccac-3’，bamhi)和下游引物e6r(5’-tccgctcgagctagttgctggcggtttcctc-3’，xhoi)，pcr扩增确认基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用bamhi和xhoi双酶切pcr产物，纯化后的片段与经bamhi和xhoi双酶切的质粒psmt3连接，采用cacl2转化法转化至e.colidh5α中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(axygen，美国)提取阳性克隆的质粒，经bamhi和xhoi双酶切鉴定，获得1400bp左右的dna片段，经测序鉴定为酯酶基因e6。将重组表达质粒转化到e.colirosetta(de3)表达菌株中，构建表达重组菌株。

实施例3利用重组表达菌株表达重组酯酶基因e6

将构建好的3ml重组表达菌株转接到100ml含有20μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养至od600达到0.6，加入终浓度为0.5mm的iptg进行诱导表达，转入25℃以150r/min振荡培养8h。低温离心收集菌体，重悬于nta-10溶液(500mm氯化钠，10mm咪唑，20mmtris盐酸，ph8.0)中，在冰上进行超声波破碎处理。低温离心收集上清，采用nta-ni²⁺亲和柱层析纯化表达蛋白。所表达的重组蛋白含有n端的6×histag，可亲和吸附到层吸柱上，经过不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱，收集洗脱液。经sds-page检测目的蛋白在洗脱液中的分布情况。利用ulp1酶在透析袋中切除重组蛋白n端的类泛素sumo，并采用nta-ni²⁺亲和柱层析去除sumo蛋白，收集样品进行sds-page检测。得到电泳纯的重组酯酶蛋白e6，分子量约50kda。用lowry法测定蛋白质浓度。

实施例4重组酯酶基因e6的活性检测

利用对硝基苯酚丁酸酯法测定纯化的重组酯酶e6活性。具体操作：1ml反应体系中包括1mm对硝基苯酚己酸酯，100mm2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(ph9.0)和530ng纯酶蛋白，采用紫外可见光分光光度计(beckmandu800型，美国)于40℃条件下连续测定吸光值a4052min，使用失活的酶液作为对照用于调零。一个酶活力单位定义为每分钟从对硝基苯酚酯催化产生lμmol对硝基苯酚的所需要的酶量。测得的酯酶活性为75.2u/mg。

实施例5酯酶e6底物特异性分析

酯酶e6的底物特异性分析采用体系(1ml)：100mm2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(ph9.0)，1mm底物，加入530ng纯酶蛋白，在25℃下连续测定吸光值a4052min。测定采用的底物为：对硝基苯酚乙酸酯(c2)，对硝基苯酚丁酸酯(c4)，对硝基苯酚己酸酯(c6)，对硝基苯酚辛酸酯(c8)，对硝基苯酚癸酸酯(c10)，对硝基苯酚十二酸酯(c12)，对硝基苯酚十四酸酯(c14)，对硝基苯酚十六酸酯(c16)。经测定表明，酯酶e6对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯(c2、c4、c6、c8和c10)具有催化活性，其中底物为对硝基苯酚丁酸酯(c4)时催化活性最高，对硝基苯酚十四酸酯(c12)、对硝基苯酚十四酸酯(c14)和对硝基苯酚十六酸酯(c16)也具有极低的催化活性(图2)。结果表明，酯酶e6对酰基碳链较短脂类物质具有较好催化活性，对于短链脂类的水解活力优于长链脂类。

实施例6酯酶e6最适反应条件分析

酯酶e6最适反应温度在10～60℃范围内测定。具体操作为：1ml反应体系中，100mm2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(ph9.0)，1mm对硝基苯酚丁酸酯，加入530ng纯酶蛋白，分别在10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60℃条件下连续测定吸光值a4052min。测定结果表明e6的反应温度范围为10～60℃，最适反应温度为50℃，说明酯酶e6具有耐高温特性(图3)。

酯酶e6最适反应ph在6.0～11.0范围内测定。具体操作为：在不同phbritton-robinson缓冲液中加入1mm对硝基苯酚丁酸酯和530ng纯酶蛋白，在25℃下连续测定吸光值a3482min。测定结果表明，酯酶e6最适反应ph为11.0，在ph7.0～11.0范围内具有活性，说明酯酶e6为碱性酯酶(图4)。

实施例7酯酶e6酶学稳定性分析

二价阳离子对酯酶e6活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入10mmco²⁺、ca²⁺、mg²⁺、sr²⁺、ni²⁺、ba²⁺和乙二胺四乙酸(edta)，测定酶活性。测酶活体系为：1ml反应体系中，加入100mm2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(ph9.0)，1mm对硝基苯酚丁酸酯，530ng纯酶蛋白，于40℃下连续测定吸光值a4052min。测定结果表明，酯酶e6活性会被金属离子明显抑制，在edta、ba²⁺、ca²⁺、co²⁺、mg²⁺和sr²⁺存在下e6仍能保持50％以上活性(图5)。

有机溶剂和去垢剂对酯酶e6活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入15％(v/v)有机溶剂(异丙醇、乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺)和1％去垢剂(w/v或v/v)(sds、吐温20、吐温80和tritonx-100)然后测定酶的活性。测活体系为：1ml反应体系中，加入100mm2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(ph9.0)，1mm对硝基苯酚丁酸酯，530ng纯酶蛋白，于40℃下连续测定吸光值a4052min。测定结果表明，酯酶e6活性会被tween80完全抑制，在甲醇、异丙醇、甘油、二甲基亚砜、乙腈、乙醇、丙酮和二甲基甲酰胺存在下e6仍能保持60％以上活性(图6)。

酯酶e6的热稳定性分析具体操作为：将酶液分别在40、50和60℃条件下孵育60min和120min，测定酶的活性。测活体系为：1ml反应体系中，加入100mm2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(ph9.0)，1mm对硝基苯酚丁酸酯，530ng纯酶蛋白，于40℃下连续测定吸光值a4052min。结果表明，在40、50和60℃中孵育60min和120min条件下，e6仍能保持50％和35％以上活性，说明e6具有较好的热稳定性。

序列表

<110>国家海洋局第二海洋研究所

<120>一种深海新型热稳定性碱性酯酶及应用

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1338

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<213>未知

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