一株棘孢木霉及其应用的制作方法

本发明涉及一株棘孢木霉及其应用。

背景技术：

水稻为旱育稀植作物，苗期短，一般为45天。水稻是我国第一大食粮作物，但是目前在全国各稻区生产中普遍存在秧苗品质差的难题，主要表现为弱秧、病秧。尤其是近年来旱育秧立枯病成为旱育稀植栽培技术的最大障碍，正常条件发病率15％左右，因为气候、管理等方面的起因，毁灭性发病也履见不鲜；水稻青枯病，系由水稻生理失水所致，病害常在1-2天内突然大面积成片发生。而化学肥料及化学农药的长期大量使用，使植物生长缓慢，病害严重，农产品品质下降，本质问题在于土壤退化严重。本发明采用木霉菌肥灌根的方法进行土壤施肥处理，改良土壤，从本质上解决水稻秧苗生长及常见病害的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株棘孢木霉及其应用。

本发明的一株棘孢木霉为棘孢木霉(trichodermaasperellum)necc20035，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2015年11月16日，保藏编号为cgmccno.11653。

本发明的一株棘孢木霉的应用是指棘孢木霉(trichodermaasperellum)necc20035在促进水稻秧苗生长同时防治病害上的应用。

本发明在2013年秋季从黑龙江省哈尔滨市群力新区丁香公园，紫丁香(syringaoblata)根际土壤分离得到棘孢木霉(trichodermaasperellum)necc20035；菌落正面分生孢子密集，不产生色素，无明显气味；分生孢子梗上的瓶梗对称分布；分生孢子亚球形。经形态鉴定和its分子鉴定为棘孢木霉菌(trichodermaasperellum)，最终命名为棘孢木霉菌(trichodermaasperellum)necc20035。

本发明的优点：

1、棘孢木霉菌(trichodermaasperellum)necc20035对环境友好，采用木霉菌肥灌根的方法进行土壤施肥处理，改良土壤，从本质上解决问题；

2、能定殖在水稻秧苗根围，短期内作用明显，并且苗期高温高湿的生长环境，更利于木霉菌发挥作用；

3、水稻旱育的特点是育苗集中，面积小，既有利于木霉菌肥的施肥，又能减少成本，提高经济效益；

4、本发明获得的木霉菌株为黑龙江省本土分离的木霉菌株，应用到黑龙江省寒地水稻育苗中，本土木霉菌在本土应用适应能力强，更容易发挥作用；

5、采用本发明制备木霉菌肥粉剂，可以促进水稻生长，并且青枯病和立枯病发病率均为0，种子发芽率提高10％，因此，育苗的时候种子可减量10％，节省种子成本10％。

附图说明

图1为绥棱县水稻秧苗木霉处理及对照对比图，其中a代表施肥组，b代表未施肥对照组；

图2为绥棱县水稻秧苗木霉处理及对照单株对比图，其中a组代表施肥组，b组代表未施肥对照组。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一株棘孢木霉为棘孢木霉(trichodermaasperellum)necc20035，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2015年11月16日，保藏编号为cgmccno.11653。

本实施方式在2013年秋季从黑龙江省哈尔滨市群力新区丁香公园，紫丁香(syringaoblata)根际土壤分离得到一株棘孢木霉(trichodermaasperellum)necc20035；该分生孢子密集，不产生色素，无明显气味；分生孢子梗上的瓶梗对称分布；分生孢子亚球形。经形态鉴定和its分子鉴定，为棘孢木霉菌(trichodermaasperellum)，最终命名为棘孢木霉菌(trichodermaasperellum)necc20035。

本实施方式的棘孢木霉菌(trichodermaasperellum)necc20035对环境友好，采用木霉菌肥灌根的方法进行土壤施肥处理，改良土壤，从本质上解决问题；并且能定殖在水稻根围，短期内作用明显，并且苗期高温高湿的生长环境，更利于木霉菌发挥作用；水稻旱育的特点是育苗集中，面积小，既有利于木霉菌肥的施肥，又能减少成本，提高经济效益。此外，本实施方式获得的木霉菌株为黑龙江省本土分离的木霉菌株，应用到黑龙江省寒地水稻育苗中，本土木霉菌在本土应用适应能力强，更容易发挥作用。

具体实施方式二：本实施方式一株棘孢木霉的应用是指棘孢木霉(trichodermaasperellum)necc20035在在促进水稻秧苗生长同时防治病害上的应用。

采用本实施方式制备木霉菌肥粉剂，可以促进水稻秧苗生长，并且青枯病和立枯病发病率均为0，种子发芽率提高10％，因此，育苗的时候种子可减量10％，节省种子成本10％。

具体实施方式三：本实施方式棘孢木霉(trichodermaasperellum)necc20035的筛选方法为：

称取10g从黑龙江省哈尔滨市采集的紫丁香根际土壤置于盛有90ml无菌水的250ml灭菌三角瓶内，充分振荡。吸取10ml悬浮液与90ml灭菌水中，制成10^-1的稀释液。以此类推稀释至体积分数为10^-2～10^-4。用移液枪吸取0.1ml悬浮液至孟加拉红平板上，用灭菌的三角玻璃涂布涂匀，用封口膜封口。28℃培养箱中倒置培养，待菌落形成后进行分离纯化。获得的菌落正面分生孢子密集，不产生色素，无明显气味，分生孢子梗上的瓶梗对称分布，分生孢子亚球形。trichodermaasperellumnecc20035的dna提取采用ctab法，扩增木霉dna的its序列，pcr扩增产物经纯化后直接进行双向测序。扩增的its基因序列提交ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation)上的blast程序分析，鉴定为棘孢木霉菌(trichodermaasperellum)最终命名为棘孢木霉trichodermaasperellumnecc20035。

对本实施方式制备的木霉菌肥粉剂进行功能性验证：

试验1、检测棘孢木霉(trichodermaasperellum)necc20035的促进水稻生长以及防治病害的能力：

1、应用棘孢木霉(trichodermaasperellum)necc20035制备木霉菌肥粉剂的方法为：首先用聚丙烯试管配制pda斜面培养基，将棘孢木霉(trichodermaasperellum)necc20035接种于斜面上；再在室温、自然光照的条件下培养15d；然后收集棘孢木霉菌孢子，将棘孢木霉菌孢子粉与滑石粉按质量比1:5混匀，再避光保存，即得到木霉菌肥粉剂。其中所述的聚丙烯试管的规格为3cm口径×24cm长；所述的pda培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000ml。

2、水稻苗床施肥试验

2.1试验地点：

(1)试验点1：黑龙江省绥化市绥棱县长山乡(吉林省军区绥棱农副业基地)，属于黑龙江省第三积温带。

(2)试验点2：黑龙江省五常市安家镇德本村农户i、ii、iii，属于黑龙江省第二积温带。

2.2参与试验的水稻品种

(1)水稻品种(绥棱县)垦稻18号；

(2)水稻品种(五常市)稻花香。

2.3施肥面积

绥棱县1个样地，五常市3个样地，共4个不同样地。每个样地：施肥面积20m²，同时设置20m²不施肥为对照。所有试验均重复2次。

2.4播种及施肥日期

(1)绥棱县1个样地播种时施肥

播种时间：2015年4月18日；

取样时间：2015年5月10日。

(2)五常市3个样地出苗之后施肥

播种时间：农户i2015年4月6日；农户ii2015年4月7日；农户iii2015年4月6日。

施肥时间：2015年4月22日

取样时间：2015年5月6日

2.5水稻苗床施肥方法

(1)苗床拌土(绥棱县)

用量：20g/m²。将本菌肥试用品以1∶50(质量比)比例与细土拌匀。每平方米平均施用1kg。

方法：将拌过菌肥的细土均匀撒入秧床，再播种盖土浇水。

(2)苗床灌根(五常市)

用量：20g/m²。按1∶200(质量体积比g/ml)的比例将菌肥试用品与水搅拌均匀，获得高浓度木霉孢子悬液，浇施4l/m²。

方法：将高浓度木霉孢子悬液浇于水稻秧苗根部。

2.6水稻秧苗品质测定

(1)施肥22天(4.18日-5.10日)

由图1和图2可知，木霉菌诱导水稻秧苗22天后，水稻秧苗生长状态出现显著差异。施肥的水稻秧苗，与未施肥的水稻秧苗相比，长得明显更高，颜色更绿，并且生长整齐。

(2)黑龙江省绥棱县木霉诱导后水稻秧苗素质变化

由表1可见，黑龙江省绥棱县“垦稻18号”水稻秧苗经木霉处理后，水稻秧苗的根长、1.5cm白根个数、株高、1-2叶耳间距、2-3叶耳间、1叶长度、2叶长度、3叶长度、总鲜重、总干重、地上部分鲜重、地上部分干重、叶绿素含量等指标均显著高于对照(p<0.05)。处理组的总根数、茎基粗、叶龄、1叶鞘长等指标与对照组相比无差异。

表1黑龙江省绥棱县木霉诱导22天后水稻秧苗素质变化

(3)黑龙江省五常市木霉诱导后水稻秧苗素质变化

由表2可见，黑龙江省五常市农户i“稻花香”品种水稻苗床经木霉处理能使水稻秧苗的总根数、株高、1叶鞘长、2-3叶耳间、2叶长度、3叶长度、总鲜重、地上部分鲜重和叶绿素含量等指标均显著高于对照(p<0.05)。处理组的叶龄、1-2叶耳间距、1叶长度、根冠比和地上干重等指标与对照组相比无差异。

表2黑龙江省五常市农户i木霉诱导后水稻秧苗素质变化

由表3可见，黑龙江省五常市农户ii“稻花香”品种水稻苗床经木霉处理后能使水稻秧苗的株高、叶龄、1叶鞘长、2-3叶耳间、2叶长度、3叶长度、总鲜重、地上部分鲜重、地上部分干重以及叶绿素含量等指标均显著高于对照(p<0.05)。处理组的根长、总根数、1.5cm白根数、茎基粗、1-2叶耳间距、1叶长度等指标与对照组相比无差异。

表3黑龙江省五常市农户ii木霉诱导后水稻秧苗素质变化

由表4可见，五常市农户iii“稻花香”品种水稻苗床经木霉处理后，水稻秧苗的总根数、株高、茎基粗、1叶鞘长、1-2叶耳间距、2叶长度、3叶长度、总鲜重、总干重、地上部分鲜重、地上部分干重以及叶绿素含量等指标均显著高于对照(p<0.05)。处理组的根长、1.5cm白根数、叶龄、2-3叶耳间距、1叶长度和根冠比等指标与对照组相比无差异。

表4黑龙江省五常市农户iii木霉诱导后水稻秧苗素质变化

从上述试验可知，本发明4个处理组的水稻秧苗的株高、总鲜重、地上部分鲜重以及叶绿素含量等指标均显著高于对照组；处理组的青枯病和立枯病发病率均为0，对照组的青枯病及立枯病的发病率为6～7％。并且处理组的种子发芽率提高10％，育苗的时候种子可减量10％，节省种子成本10％。因此，本发明的棘孢木霉(trichodermaasperellum)necc20035可以促进水稻秧苗生长同时防治病害。