从链霉菌菌株HY‑14生产的新型木聚糖酶的制作方法

本发明涉及分离自链霉菌(Streptomyces sp.)菌株HY-14的新型木聚糖酶，该木聚糖酶包含糖苷水解酶家族10(GH10)结构域和碳水化合物结合域家族2(纤维素结合域家族2，CBM2)结构域。

背景技术：

木聚糖(非淀粉多糖)是形成植物细胞壁或组织的组份之一。非淀粉多糖主要分为纤维素和半纤维素两组。木聚糖是半纤维素的主要组份。木聚糖酶是将木聚糖水解成木糖和木二糖的酶。

木聚糖酶是微生物中产生的酶之一。根据以前的报道，内切-β-木聚糖酶、外切-β-木聚糖酶和β-木糖苷酶这三种酶一起作用，以将木聚糖(半纤维素的主要组份)完全水解和糖化，通常将这三种酶称为木聚糖酶(Biely,P.，Trends.Biotechnol.，3，286-290，1985)。该酶被广泛应用于各个领域和行业，用来生产高品质的纸、再生废纸(Beg,Q.&G.S.Hoondal.，Appl.Micribiol.Biotechnol.56，326-338，2001)；从果汁饮料和啤酒中除去杂质；提取咖啡、植物油和淀粉；以及提高饲料效率等(Bedford,M.R&Classen,H.L.，Elsevier Amsterdam，361-370，1992；Wong,K.K.Y&Saddler,J.N.，Crit.Rev.Biotechnol.12，413-435，1992)。如今，木聚糖酶作为饲料添加剂酶的可用性正在提高，因为木聚糖酶能够降解包含在饲料谷物中的纤维，所述饲料谷物不仅提供了动物能量代谢所必需的碳水化合物和少量的蛋白质，而且还提供了动物难以利用的纤维。

饲料谷物中的纤维由非淀粉多糖和木质素组成。植物细胞壁由以下组成：最外层的纤维素、含有β-葡聚糖的非淀粉多糖、覆盖整个谷物内部并以木聚糖作为主要组份的半纤维素以及木质素。非淀粉多糖不被牛的消化酶所降解，且遮盖了谷物中的淀粉或蛋白质，导致在牛中的营养效率降低。特别是，以高浓度包含在小麦和黑麦的细胞壁内的可溶性木聚糖在消化道中吸收水，成为粘性凝胶，并因此阻止消化酶接近营养素且干扰消化道中的消化流，从而使微生物附着至消化物而引起异常发酵，导致营养素损失(Kuhad,R.C.&Singh,A.，Crit.Rev.Biotechnol.13，151-172，1993)。

如果添加至谷物饲料，木聚糖酶能够水解遮盖谷物的半纤维素，从而使包含在谷物中的营养素的可用性提高，且能够改善牛中的肠道消化条件。尤其是对于小麦饲料产品而言，木聚糖酶是高价值的酶，因为木聚糖酶能够防止通常由具有高含量半纤维素的小麦产品所引起的牛中的大便稀溏或痢疾，从而提高饲料的价值，并使小麦产品成为稳定的饲料成分而改善品质差异。近来，不仅在发达国家，而且在生活环境和国民收入得到改善的其它国家，肉类消费得到提高。因此，对于单胃动物(如猪和鸡)的饲料而言，木聚糖酶被认为是一种重要的酶(Bedford.M.R.，Animal Feed Science and Technology.53，145-155，1995)。

作为食品酶，将木聚糖酶用于改善由谷物或谷物副产品制成的面团的颜色和物理性质，还将其用于制备低聚木糖，其中，将作为功能性材料吸引了我们注意的至少三种木糖组合。

作为饲料酶，将木聚糖酶用于提高包括谷物或谷物副产品的植物材料(如小麦麸、玉米和大豆粉)的消化效率，用于饲料的制备，并用于改善动物中的肠道流动性。

作为工艺酶，将木聚糖酶用于漂白，以去除半纤维素的木质素多糖复合物，在造纸和纸浆行业的领域中，所述漂白为使用有毒有机溶剂的常规工艺。

在如今受到关注的绿色技术领域中，研究目标从利用植物材料(如玉米和甘蔗)的第一代生物能源转移到了利用农业副产品(如玉米秸秆和稻秆)的第二代生物能源。因此，出于工业目的使用木聚糖酶的必要性得到提高。第二代生物能源生产工艺需要更复杂的程序。对同时包含纤维素和半纤维素的植物组织或细胞壁进行的化学处理破坏了环境。因此，使用纤维素酶和木聚糖酶进行水解更有效。

木聚糖是植物生物质的主要组份，可通过木聚糖酶进行水解。已知对处于β-1,4-木糖结构的木聚糖进行水解的糖苷水解酶家族(GH家族) 有六个成员：GH家族5、GH家族8、GH家族10、GH家族11、GH家族30和GH家族43(http://www.cazy.org，Luo等，2010)。其中最具代表性的家族是GH家族10和GH家族11。

本发明人识别了来自链霉菌菌株HY-14的新型内切-β-1,4-木聚糖酶，该酶包含糖苷水解酶家族10结构域和碳水化合物结合域家族2(纤维素结合域家族2；CBM2)结构域，随后对该酶的基因序列、氨基酸序列以及与温度和pH有关的特性进行了研究。结果，本发明人确认了在5.0-7.5之间的pH下，木聚糖酶的最大酶活性持续为至少80％，并且该酶能够显著降解糖底物(包括木聚糖)，从而可将该酶作为食品酶、饲料酶和工艺酶等有效地用于各个行业部门，使得完成本发明。

技术实现要素：

本发明的目的是提供链霉菌菌株HY-14和分离自上述菌株的新型木聚糖酶，该木聚糖酶包含糖苷水解酶家族10(GH10)结构域和碳水化合物结合域家族2(纤维素结合域家族2，CBM2)结构域。

为了达到上述目的，本发明提供了具有由SEQ.ID.NO:1表示的氨基酸序列的木聚糖酶。

本发明还提供了使用链霉菌菌株HY-14生产木聚糖酶的方法。

另外，本发明提供了包含上述木聚糖酶作为活性成分的饲料添加剂。

有益效果

本发明涉及分离自链霉菌菌株HY-14的新型木聚糖酶，该酶与对应于糖苷水解酶家族10(GH10)结构域的酶同源并包含作为底物结合域的碳水化合物结合域家族2(纤维素结合域家族2，CBM2)结构域。尤其是，在5.0至7.5之间的pH下，最大酶活性持续为至少80％，并且包含木聚糖在内的糖底物在木聚糖酶中被显著降解，并因此可将木聚糖酶作为酶用于诸如食品、饲料的各个行业部门以及其它行业中。

附图说明

本发明的优选实施方式的应用参考附图可以得到最好的理解，其中：

图1是说明本发明中分离的新型木聚糖酶的基因序列和氨基酸序列的图示。

图2是说明本发明中分离的木聚糖酶的氨基酸序列的活性结构域区域和底物结合结构域区域的图示：

Sme：链霉菌HY-14的内切-β-1,4-木聚糖酶；

Ssp：链霉菌Ame12xE9的内切-β-1,4-木聚糖酶(GenBank登录号：WP_019983605)；

Sli：变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24的内切-β-1,4-木聚糖酶(GenBank登录号：WP_003978188)；

Spr：始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)ATCC 25486的内切-β-1,4-木聚糖酶(GenBank登录号：WP_005310297)；

Smg：巨孢链霉菌(Streptomyces megasporus)的内切-β-1,4-木聚糖酶(GenBank登录号：ADZ99362)；

→，←：用于设计简并PCR引物的肽序列；

*：生物催化反应所必需的氨基酸；

GH10结构域：糖苷水解酶家族10，活性结构域；以及

CBM2结构域：碳水化合物结合域家族2(纤维素结合域家族2；CBM2)，底物结合结构域。

图3是说明显示除了结合至木聚糖酶的底物结合域(CBM2)之外的木聚糖酶的分子量的SDS-PAGE结果的图示：

S：蛋白标志物；

1：IPTG诱发后包含XylU的可溶性裂解物；

2：纯化的XylU；

3：纯化的XylUΔCBM2；以及

4：IPTG诱发后包含XylUΔCBM2的可溶性裂解物。

图3是说明对木聚糖酶的最佳反应条件(pH和温度)进行研究的图示，木聚糖酶的酶活性通过使用桦木木聚糖作为底物来测量：

○：木聚糖酶(XylU)；以及

●：除了底物结合域之外的木聚糖酶(XylUΔCBM2)。

具体实施方式

下文，对本发明进行详细地描述。

本发明提供了具有由SEQ.ID.NO:1表示的氨基酸序列的木聚糖酶。

上述木聚糖酶优选分离自链霉菌菌株HY-14(保藏号KCTC 12531BP)。

在本发明的优选实施方式中，将东方蝼蛄(Gryllotalpa orientalis)肠悬浮液涂覆于含有偶氮木聚糖的细菌分离培养基上，然后分离显示出由偶氮木聚糖的降解所形成的清晰的环的微生物菌落。对分离菌株的16srDNA序列(GenBank登录号：JQ943651)进行检查，结果该分离菌株被鉴定为链霉菌(GenBank登录号：JQ943651)。将所鉴定的菌株命名为链霉菌菌株HY-14，并于2013年12月16日保藏于韩国生物科学与生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology，KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures，KCTC)，保藏号：KCTC 12531BP。

上述木聚糖酶具有以下特性：

(a)在SDS-PAGE上具有约44.0kDa的分子量；

(b)表现出5.82的pI值；

(c)在5.0-7.5之间的pH下显示最大活性；

(d)在65℃显示最大活性；

(e)内切-β-1,4-木聚糖酶；

(f)包含处于N-末端的糖苷水解酶-10结构域(GH-10结构域)；以及

(g)包含处于C-末端的碳水化合物结合域家族2(纤维素结合域家族2；CBM2)结构域。

上述木聚糖酶优选分离自链霉菌菌株HY-14的木聚糖酶，并且上述糖苷水解酶-10结构域优选由SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列组成。上述碳水化合物结合域家族2结构域优选由SEQ.ID.NO:3表示的氨基酸序列组成。

上述木聚糖酶的特征优选在于水解桦木木聚糖(来自桦木的木聚糖)、山毛榉木聚糖(来自山毛榉的木聚糖)、小麦阿拉伯木聚糖(来自小麦的阿拉伯木聚糖)、斯卑尔脱燕麦(oat spelts)木聚糖(来自斯卑尔脱燕麦的木聚糖)、PNP-纤维二糖糖苷以及PNP-木吡喃糖苷。

上述木聚糖酶的特征优选在于使用木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)、木五糖(X5)和木六糖(X6)作为底物来产生低聚木糖。

上述木聚糖酶优选显示出内切-β-1,4-木聚糖酶活性。

在本发明的优选实施方式中，从上述菌株提取基因组DNA，随后使用由SEQ.ID.NO:6和SEQ.ID.NO:7表示的引物用木聚糖酶基因进行PCR。结果，获得351bp PCR产物。进行基因组步移(genome walking)和巢式PCR，获得对应于总的木聚糖酶基因(XylU，SEQ.ID.NO:12)的PCR产物。通过用由SEQ.ID.NO:8和SEQ.ID.NO:9表示的、含有限制性酶切位点的引物进行PCR获得XylU。通过用由SEQ.ID.NO:10和SEQ.ID.NO:11表示的引物进行PCR来获得XylUΔCBM2(其中，碳水化合物结合域家族2(纤维素结合域家族2，CBM2)结构域被除去)。结果，确认了本发明的木聚糖酶(XylU)包含对应于处于N末端的糖苷水解酶-10结构域(GH-10结构域，SEQ.ID.NO:2)的活性结构域以及处于C末端的碳水化合物结合域家族2(纤维素结合域家族2；CBM2，SEQ.ID.NO:3)，并由包含1,350bp开放阅读框的449个氨基酸组成。纯化后的蛋白质的分子量被确认为44.0kDa(参见图1-图3)。

为了研究上述分离的XylU和XylUΔCBM2的最佳反应条件和酶活性，本发明人使用桦木木聚糖作为底物通过DNS(二硝基水杨酸)定量来测量酶活性。结果，如图4所示，在pH 5.5和65℃的温度下，显示最大酶活性。在此期间，在60℃下，XylUΔCBM2的最大活性于1小时内持续为约70％(参见图4)。

为了研究上述分离的木聚糖酶(XylU)对各种木聚糖和糖底物的降解活性，本发明人使用各种木糖聚合物(如山毛榉木聚糖、桦木木聚糖以及斯卑尔脱燕麦木聚糖)和其它聚合物(如淀粉、果胶、葡聚糖和PNP(对硝基苯基)糖衍生物)对底物依赖性酶活性进行了测量。结果，确认了斯卑尔脱燕麦木聚糖得到最有效地降解(参见表1)。

为了研究上述分离的木聚糖酶(XylU)的酶学特性，本发明人对木聚糖降解产物进行了分析。尤其是，通过使用桦木木聚糖(BX)、木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)和木五糖(X5)作为底物来诱发酶反应，然后通过高效液相色谱(HPLC)对降解产物进行研究。结果，桦木木聚糖的水解产物为X2(83.9％，w/v)和X3(11.0％，w/v)；木三糖(X3)的水解产物为X2(76.2％，w/v)和X3(20.0％，w/v)；木四糖(X4)的水解产物为X2(82.4％，w/v)、X3(13.5％，w/v)和X4(0.3％，w/v)；木五糖(X5)的水解产物为X2(80.0％，w/v)、X3(16.4％，w/v)和X4(0.3％，w/v)；并且木六糖(X6)的水解产物为X2(76.1％，w/v)、X3(20.7％，w/v)和X4(0.4％，w/v)(参见表2)。从上述结果确认了上述木聚糖酶具有内切-β-1,4-木聚糖酶的典型活性。

本发明涉及分离自链霉菌菌株HY-14的新型木聚糖酶，该木聚糖酶与对应于糖苷水解酶家族10(GH10)结构域的酶同源并包含作为底物结合域的碳水化合物结合域家族2(纤维素结合域家族2，CBM2)结构域。尤其是，在5.0至7.5之间的pH下，最大酶活性持续为至少80％，并且包含木聚糖在内的糖底物在木聚糖酶中被显著降解，从而可将本发明的木聚糖酶作为食品酶、饲料酶和工艺酶有效地用于各个行业部门中。

本发明还提供了用于生产木聚糖酶的方法，所述方法包括以下步骤：

1)在含有木聚糖的培养基中培养链霉菌菌株HY-14，并通过离心从其获得上清液；

2)通过向步骤1)中获得的上清液添加沉淀剂，诱发水溶性蛋白的沉淀；

3)从步骤2)的沉淀物中除去不溶性沉淀物，并通过透析获得粗酶溶液；以及

4)通过柱色谱将步骤3)中获得的粗酶溶液纯化。

在上述方法中，步骤2)中的沉淀剂选自于由硫酸铵、丙酮、异丙醇、甲醇、乙醇和聚乙二醇所组成的组。所述沉淀可通过使用具有不同孔径的膜经由超滤进行浓缩来代替。

在上述方法中，可通过使用填充有填充物的柱色谱来实施步骤4)中使用柱色谱进行的纯化，所述填充物选自于由硅胶、sephadex、RP-18、聚酰胺、Toyo-pearl以及XAD树脂所组成的组。如果需要的话，可用适当选择的填充物进行多次柱色谱。

本发明还提供了饲料添加剂，所述饲料添加剂包含上述木聚糖酶作为活性成分。

在本发明的优选实施方式中，本发明的木聚糖酶在pH 5.5下表现出最大活性，在5.0-7.5之间的pH下最大活性持续为至少80％。该酶对PNP-纤维二糖糖苷显示出最高的切割活性，该切割活性甚至比已知的当底物相同时的另一木聚糖酶的切割活性更高(Haga KM等，1991；Kim DY等，2009，Proc.Biochem.44：1055-1059)。经确认本发明的木聚糖酶对桦木木聚糖、山毛榉木聚糖、斯卑尔脱燕麦木聚糖以及PNP(对硝基苯基)-纤维二糖糖苷具有高的降解能力。然而，该酶不能降解可溶性淀粉和羧甲基纤维素。因此，确认了本发明的木聚糖酶为不具有纤维素酶活性的内切-β-1,4-木聚糖酶。另外，确认了本发明的木聚糖酶具有能够切割PNP-木吡喃糖苷的木糖置换活性。

从上述结果确认了本发明的木聚糖酶适合作为饲料添加剂，以提高包含在主要用于动物生长的植物谷物饲料中的木聚糖的降解。

非反刍动物(如猪和鸡)的饲料不具有能够降解植物细胞壁的酶，使得包含在谷物中的淀粉或蛋白的使用效率降低。本发明的饲料添加剂能够使木聚糖(细胞壁的主要成分)糖化，从而当非反刍动物(如猪和鸡)的饲料中包含该饲料添加剂时，能够提高饲料的价值。

本发明的饲料添加剂的活性成分木聚糖酶优选以相对于饲料总重量的0.01重量份-10重量份的浓度、更优选以0.05重量份-5重量份的浓度、且最优选以0.12重量份的浓度包含在饲料中。

上述饲料添加剂还可包含非反刍动物可接受的载体。在本发明中，可将饲料添加剂按原样独立添加、或与所建议的载体和稳定剂等一起添加。如果需要的话，还可向其中添加各种营养素(如维生素、氨基酸和矿物质)、抗氧化剂和其它添加剂。可将饲料添加剂配制成散剂、颗粒剂、丸剂和混悬剂等的形式。当向非反刍动物给予本发明的饲料添加剂时，可将该饲料添加剂独立提供或混合在饲料中提供。

因此，与对应于糖苷水解酶家族10(GH10)结构域的酶同源并包含作为底物结合域的碳水化合物结合域家族2(纤维素结合域家族2，CBM2)结构域的新型木聚糖酶(分离自链霉菌菌株HY-14)可被用于各个领域中，例如，用于包括物理性质改善和寡糖生产工艺的食品行业中、用于具有提高的饲料谷物可用性的饲料行业中以及用于包括纸浆和生物能源原材料的预处理(可以作为化学工艺的替代)的预处理工艺中。因此，本发明的酶对于如下而言可以是有用的酶：开发使用酶的环保工艺、通过改善消化效率来照料牛的健康以及提高各种谷物或谷物副产品的附加价值。

如以下实施例所示，本发明的实践的和当前优选的实施方式是示例性的。

然而，应当理解的是，本领域技术人员在考虑了本公开内容的情况下，可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。

实施例

实施例1：链霉菌菌株的分离和鉴定

为了分离产生木聚糖酶的微生物，本发明人进行了以下实验，以从东方蝼蛄的共生的肠道微生物中分离具有水解木聚糖的酶活性的微生物。

具体而言，将收集的东方蝼蛄在70％(w/w)乙醇中浸泡1分钟-2分钟，以将该昆虫表面上的任何污染物除去。用无菌蒸馏水洗涤昆虫躯体两次，以除去乙醇。将昆虫解剖，用镊子将肠取出。将肠放置到磷酸盐缓冲盐水(0.8％NaCl、0.02％KCl、0.144％Na₂HPO₄、0.024％KH₂PO₄)中并粉碎。为了分离能够水解木聚糖的微生物，使用Difco^TM R2A琼脂(BD)作为基础培养基，并用补充有2g/L的偶氮木聚糖(Megazyme)的培养基来制备选择培养基。通过使用连续稀释法，将含有经粉碎的肠的微生物悬浮液稀释于PBS中，将其以各100μl分配到选择培养基中，随后在25℃下培养48小时。将显示出由偶氮木聚糖的降解所形成的清晰的环的微生物菌落从各培养基中选择性地进行收集。

为了鉴定分离的微生物，在30℃于120rpm下在LB培养基中培养15小时。通过在6,000rpm下将培养基离心10分钟来回收细胞。通过NucleoSpin组织试剂盒(Machery-Nagel)从所获得的细胞中提取基因组DNA。通过使用上述引物[27F引物：5’-AGACTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ.ID.NO:4)；1492R引物：5’-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3’(SEQ.ID.NO:5)]，用16S rDNA序列进行PCR。PCR反应混合物的总体积为50μl，且组成如下：1μl的总DNA(50ng/μl-200ng/μl)、5μl的10X Taq DNA聚合酶缓冲液(含有MgCl₂)、5μl的2.5mM dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、5μl的各引物(3.2pmol)以及1单位-2单位的Taq DNA聚合酶(Promega，USA)。添加足够多的蒸馏水以使反应混合物的总体积达到50μl。按照如下进行PCR反应：在94℃下预变性5分钟，在94℃下变性30秒，在65℃下退火30秒，在72℃下延伸3分钟，从变性到延伸进行30个循环，在72℃下终延伸7分钟。然后，将PCR产物保持在4℃下。通过使用ABI prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready反应试剂盒和ABI 3730x1DNA分析仪(Applied Biosystems)，对获得自上述PCR的16S rDNA序列进行分析。

通过使用NCBI数据库BLAST程序和EzTaxon server Genbank，对获得的16S rDNA的序列(GenBank登录号JQ943651)进行分析。结果，将其鉴定为链霉菌，本发明人将其命名为链霉菌菌株HY-14，并保藏于作为国际保藏单位的韩国生物科学与生物技术研究所(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC 12531BP)。

实施例2：木聚糖酶基因的确定

为了找到实施例1中分离的链霉菌菌株HY-14(保藏号：KCTC 12531BP)的能够降解木聚糖的基因，如图1所示，通过使用基于上述菌株的基因组DNA的GH10(糖苷水解酶家族10)木聚糖酶基因保守序列(WDVVNE，ITELDI)构建的引物，对编码木聚糖酶(XylU)蛋白(SEQ.ID.NO:1)的多核苷酸序列(SEQ.ID.NO:12)进行扩增。

特别是，从上述菌株分离基因组DNA。通过使用基因组DNA作为模板用如下进行PCR：10×缓冲液(MgCl₂)、2.5mM dNTPs、5×缓冲液、FastStart Taq DNA聚合酶(Roche)以及引物[GF-10引物：5’-TGGGACGTCSTCAACGAG-3’(SEQ.ID.NO:6)；GR-10引物：5’-GATGTCGAGCTCSGTGAT-3’(SEQ.ID.NO:7)]。此时，PCR条件如下：在95℃下预变性5分钟，在95℃下变性30秒，在50℃下退火30 秒，在72℃下延伸40秒，从变性到延伸进行35个循环，在72℃下终延伸7分钟。使用DNA Walking SpeedUp premix试剂盒(Seegene，韩国)，用获得的351bp PCR产物进行基因组步移和巢式PCR。结果，获得对应于总的木聚糖酶基因(XylU)的PCR产物。使用含有NdeI和HindIII位点的引物[F-GN引物：5’-CATATGGCCGACACGCTGGGCTC-3’(SEQ.ID.NO:8)；R-GH引物：5’-AAGCTTTCACGACGCCGTGCAGG-3’(SEQ.ID.NO:9)]，用由DNA步移获得的总序列，按照如下进行PCR：在95℃下预变性5分钟，在95℃下变性30秒，在62℃下退火30秒，在72℃下延伸40秒，从变性到延伸进行35个循环，在72℃下终延伸7分钟。结果，获得含有限制性酶切位点的XylU PCR产物。为了确定碳水化合物结合域家族2(纤维素结合域家族2；CBM2，SEQ.ID.NO:3)敲除的木聚糖酶(XylUΔCBM2)基因，使用含有NdeI和HindIII位点的引物[F-GN1引物：5’-CATATGGCCGACACGCTGGGCTC-3’(SEQ.ID.NO:10)；R-GH1引物：5’-AAGCTTTCAGGCGGCACCGGTGT-3’(SEQ.ID.NO:11)]用总的XylU基因序列根据如下进行PCR：在95℃下预变性5分钟，在95℃下变性30秒，在54℃下退火30秒，在72℃下延伸40秒，从变性到延伸进行35个循环，在72℃下终延伸7分钟。结果，获得含有限制性酶切位点的XylUΔCBM2PCR产物。

如图2所示，使用NCBI数据库的蛋白质blast调查(protein blast survey)，对扩增的基因序列进行分析，并对氨基酸序列进行研究。然后，确认了木聚糖酶(XylU)具有对应于处于N-末端的糖苷水解酶-10结构域(GH-10结构域，SEQ.ID.NO:2)的活性结构域和处于C末端的碳水化合物结合域家族2(纤维素结合域家族2；CBM2，SEQ.IF.NO:3)。由基因测序也确认了该酶具有1,350bp开放性阅读框(ORF)编码的蛋白质(由449个氨基酸组成)，并具有46,774Da的分子量。该酶的pI值被确认为6.24(图2)。在SignalP 3.0数据库中，对分泌信号区域进行了研究。结果，确认了木聚糖酶由419个氨基酸组成，分子量为43,838Da，且pI值为5.82。

实施例3：木聚糖酶重组载体的构建

进行如下实验，以克隆在实施例2中获得的总的XylU和XylUΔCBM2。

具体而言，通过使用NucleoSpinGel和PCR Clean-up试剂盒(Machery-Nagel)对上述获得的PCR产物进行纯化，随后在pGEM-T easy载体(Promega，Madison，USA)中连接。用上述载体转染大肠杆菌DH5α，然后从补充有氨苄青霉素的LB琼脂平板中对转化菌株进行选择。从所选择的转化菌株中分离和纯化重组的pGEM-T载体，将其命名为“pGEM-T-XylU”和“pGEM-T-XylUΔCBM2”。用NdeI和HindIII对pGEM-T-XylU和pGEM-T-XylUΔCBM2进行消化，然后通过使用NucleoSpinGel和PCR Clean-up试剂盒(Machery-Nagel)对XylU和XylUΔCBM2基因进行纯化。另外用NdeI和HindIII对表达载体pET-28a(+)(Novagen，USA)进行消化，随后进行纯化。在1单位的连接酶(TaKaRa)的存在下，使纯化的XylU和XylUΔCBM2基因以及表达载体pET-28a(+)各100ng在16℃下反应16小时。连接完成后，用重组表达载体pET-28a(+)对大肠杆菌BL21(Novagen)进行转染。从含有卡那霉素的平板中选择菌落。从选择的菌株中对重组表达载体pET-28a(+)进行纯化，随后用适当的限制性内切酶进行消化。确定含有XylU和XylUΔCBM2基因片段的载体。最后，通过测序确定XylU和XylUΔCBM2重组表达载体。

将确定的XylU和XylUΔCBM2重组表达载体命名为“pET-XylU”和“pET-XylUΔCBM2”。

实施例4：木聚糖酶蛋白的纯化

在大肠杆菌中过表达实施例3中制备的重组表达载体pET-XylU和pET-XylUΔCBM2。然后，进行以下实验以将重组蛋白XylU(rXylU)和XylUΔCBM2(rXylUΔCBM2)分离和纯化。

具体而言，将转染有上述各表达载体的大肠杆菌接种在液体LB培养基中，随后在37℃下振荡培养。当各大肠杆菌培养液的OD₆₀₀达到0.4-0.5时，向其中添加1.0mM的IPTG，随后在30℃下振荡培养5小时。通过将培养溶液离心，收集细胞。通过超声处理对细胞进行裂解，以获得包涵体。用含有20mM咪唑和0.5M氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)将所获得的包涵体溶解。通过使用150mM-200mM的咪唑，使溶解的细胞裂解物于5ml的His-trap HP柱(GE Healthcare，英国)中重新折叠，随后进行纯化。然后，使用LC系统(GE Healthcare，英国)进行液相色谱(LC)。另外，使用HiLoad 26/60Superdex 200prep-grade(GE Healthcare，英国)进行凝胶渗透色谱，这为本领域技术人员公知的方法。通过12％SDS-PAGE对纯化的rXylU和rXylUΔCBM2蛋白进行确认。通过使用Bradford试剂(Bio-Rad，美国)，对纯化的rXylU和rXylUΔCBM2蛋白进行定量。将定量的蛋白冷冻干燥并储存在-20℃。

结果，如图3所示，确认了rXylU和rXylUΔCBM2的分子量分别为44.0kDa和33.0kDa的(图3)。

实施例5：木聚糖酶的生化特性的分析

<5-1>木聚糖酶的酶活性的测量

进行以下实验，以对实施例4中分离的rXylU和rXylUΔCBM2的酶活性和最佳反应条件(pH和温度)进行研究。

具体而言，将桦木木聚糖用作研究底物。为了研究酶活性的最佳pH，用50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0-5.5)、50mM磷酸钠缓冲液(pH 5.5-7.5)、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5-9.0)以及50mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0-10.5)在60℃下诱发反应15分钟，随后测量酶活性。

为了测量酶活性，使用了DNS(二硝基水杨酸)定量方法(Miller GL，Anal.Chem.，55:952-959，1959)。确切地说，将逐步稀释的100μl酶溶液加入到含有1％(w/v)山毛榉木聚糖的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0)中，随后在55℃下反应15分钟。向其中加入750μl的DNS(3,5-二硝基水杨酸)溶液。将混合溶液在100℃静置5分钟，并对OD₅₄₀进行测量。将1单位的酶确定为1分钟内能够释放1μmol还原糖的酶的量。

为了确认酶的最佳反应温度，在40℃-75℃，以5℃的间隔对酶活性进行了测量。为了研究取决于温度的稳定性，在30℃-75℃将反应混合物置于50mM磷酸钠缓冲液(pH 5.5)中1小时。然后，在60℃诱发反应10分钟，并测量酶活性。

结果，如图4所示，在pH 5.5(图4a)和65℃(图4b)下，rXylU 和rXylUΔCBM2的酶活性最高。在5.0-7.5之间的pH下，最大酶活性持续为至少80％。rXylUΔCBM2的酶活性在60℃下于1小时内持续为70％(图4c)。

<5-2>木聚糖酶的底物特异性

进行以下实验，以对实施例4中分离的XylU降解各种木聚糖和糖底物的能力进行研究。

具体而言，用各种木糖聚合物(如山毛榉木聚糖、桦木木聚糖、斯卑尔脱燕麦木聚糖)、聚合物(如淀粉、果胶、葡聚糖)以及5mM PNP(对硝基苯基)糖衍生物，对底物特异性进行研究。通过如实施例<5-1>所述的相同的方式，将含有木聚糖酶的酶溶液(0.05ml)(稀释于包含各底物(1％w/v)的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0)中)的标准分析混合物(0.5ml)用于在45℃下诱发酶反应10分钟。通过在标准分析条件下，经由1分钟内产生1μmol还原糖或PNP所必需的酶的量而确定的单位，定义对于木聚糖或PNP-糖底物而言的木聚糖酶活性。

结果，如表1所示，在木聚糖中，木聚糖酶(XylU)最有效地水解了斯卑尔脱燕麦木聚糖，随后依次为山毛榉木聚糖、桦木木聚糖和小麦阿拉伯木聚糖。在PNP(对硝基苯基)底物中，对于PNP-纤维二糖糖苷而言的酶活性是所有中最高的(表1)。

【表1】

对于各种木聚糖和糖底物而言的XylU的降解活性

ND：未检出

U/mg：以三重复实验所获得的每蛋白单位重量的酶活性单位

<5-3>由木聚糖酶获得的木聚糖降解产物的特性

对木聚糖降解产物进行分析，以对实施例4中分离的XylU的酶特性进行研究，为此进行以下实验。

具体而言，通过如实施例<5-1>所述的相同的方式，用桦木木聚糖(BX)、木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)和木五糖(X5)作为底物，诱发实施例4中分离的XylU的酶反应。将反应混合物在100℃下加热5分钟以终止酶反应。然后，使用Asahipak NH2P-50 2D柱(5μm，2.0×150mm，Shodex)，使水解产物进行高效液相色谱(HPLC)(流动相：洗脱溶液A，0.05％甲酸/无菌水；洗脱溶液B，0.05％甲酸/无菌水:乙腈/甲醇＝6:4)。

结果，如表2所示，桦木木聚糖的水解产物为X2(83.9％，w/v)和X3(11.0％，w/v)；木三糖(X3)的水解产物为X2(76.2％，w/v)和X3(20.0％，w/v)；木四糖(X4)的水解产物为X2(82.4％，w/v)、X3(13.5％，w/v)和X4(0.3％，w/v)；木五糖(X5)的水解产物为X2(80.0％，w/v)、X3(16.4％，w/v)和X4(0.3％，w/v)；以及木六糖(X6)的水解产物为X2(76.1％，w/v)、X3(20.7％，w/v)和X4(0.4％，w/v)。从上述结果确认了，上述木聚糖酶具有内切-木聚糖酶的典型活性(表2)。

【表2】

木聚糖酶(XylU)降解的木聚糖降解产物的LC结果

【保藏号】

保藏机构：韩国生物科学与生物技术研究所

保藏号：KCTC 12531BP

保藏日：2013年12月16日