一种具有益生功能的益生固态乳酸菌菌剂的制备方法与流程

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种具有益生功能的益生固态乳酸菌菌剂的制备方法。

背景技术：

活性乳酸菌菌剂具有促进肠胃消化吸收、调节肠道微生态平衡、提高机体免疫力、防病保健等功能。同时，乳酸菌制剂因其天然可食用、无毒副作用、安全可靠和易大规模发酵等优势，广泛应用于食品保健、畜牧饲料、水产养殖、微生物发酵和环境保护等行业。然而，目前市售乳酸菌多为液体菌剂，其剂型单一且保存期相对较短，而固态乳酸菌制剂不仅口感细腻，而且便于储存和运输。因此，乳酸菌固态活性菌剂的开发和制备具有广阔的市场潜力。

目前，有关具有显著益生功能的益生固态乳酸菌菌剂工艺研究较少，配方有待优化升级。专利cn1369553a公开了一种制备活性乳酸菌固态制剂的方法，该发明添加固体淀粉质碳源和多种氮源，采用糖化曲霉分解淀粉，并通过低温干燥制备为固态制剂。该发明所述工艺简单易行，产品便于保存，但是发酵菌活不高，且产物营养益生物质单一。专利cn1400304a公开了一种微生态制剂的液—固结合发酵工艺，该发明的固体发酵环节在厌氧塑料袋中进行，固体基质成分简单、发酵规模受限。专利cn103392911a公开了一种饲用高活性乳酸菌固态制剂及其制备方法，该发明采用的粘接剂为梭甲基纤维素钠或微晶纤维素、聚丙烯酸树脂ⅱ，包衣剂为聚丙烯酸树脂、海藻酸钠或氯化钙，该原料虽然能很好的完成固态制剂造粒，但是这些成分不是有益于肠道益生菌生长和定植的物质，且肠道益生功能未表明。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种具有益生功能的益生固态乳酸菌菌剂的制备方法，该方法经济环保，生产工艺简单高效，生产成本低；产品无异味，口感柔和，有天然发酵乳香味；固态菌剂制备的冷冻保护剂采用的全是有助于对肠道益生菌增殖的原料；乳酸菌具有高酸、胆盐耐受能力和胆固醇脱除能力，在模拟人工胃肠液中存活率高，具有良好的益生保健功能。

本发明是通过如下技术方案实现的，本发明提供一种具有益生功能的益生固态乳酸菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将添加脱脂奶粉的培养基灭菌，冷至室温后接入乳酸菌发酵菌种，恒温发酵至脱脂奶粉乳凝固，ph＝4.0-4.5时发酵结束，搅拌、冷却至室温，制得乳酸菌活菌剂；

(2)取乳酸菌活菌剂离心并收集菌体，弃上清液后吸取菌悬液，将菌悬液和冻干保护剂混匀；其中冻干保护剂为蒙脱土、海藻糖、普鲁兰多糖、谷胱甘肽、抗性淀粉、甘油、异vc酸、水中的一种或几种混合；

(3)将混匀后的菌悬液倒入待冻干的器皿中预冷冻。

作为优选，所述乳酸菌发酵菌种来源于青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、格式乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗依氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和唾液乳杆菌中的一种或几种混合。

本发明所使用的“w/v”是指重量体积比，即g/ml或kg/l。

作为优选，步骤(1)中，所述培养基的配方中添加10-15％(w/v)脱脂奶粉，以及以下混合物：

作为优选，步骤(1)中，在培养基上按1～3％的比例接入乳酸菌发酵菌种。

作为优选，步骤(1)中，发酵温度为30℃-39℃。发酵时间为5-8h，发酵过程中还可以控制氧气的量，一般在有氧或微好氧条件下发酵培养，当选择微好氧条件发酵时，氧气的量为0～0.5mg/l溶解氧。

作为优选，步骤(2)中，取乳酸菌活菌剂后采用6000r/min离心5min收集菌体。

作为优选，步骤(2)中，加入的冻干保护剂为甘油0.5-2.5％(w/v)、海藻糖3.0-5.0％(w/v)、抗性淀粉1.0-3.0％(w/v)、普鲁兰多糖1.0-3.0％(w/v)、异vc酸0.1-0.5％(w/v)，谷胱甘肽0.2-0.5mm，蒙脱土0.1-1.0％(w/v)，水5-70％(w/v)中的一种或几种混合。

作为优选，步骤(2)中，所述冻干保护剂和菌悬液混合的比例为4:1～8:1。

作为优选，步骤(2)中，将菌悬液和冻干保护剂混匀后需要平衡30min。

作为优选，步骤(3)中，预冷冻参数为：混匀后的菌悬液在4℃冰箱内平衡30min后，移入-30℃冰箱内平衡60min，再移入冷冻干燥剂中冷冻干燥。

本发明在乳酸菌活菌剂的制备过程中定量添加的冷冻保护剂蒙脱土、海藻糖、普鲁兰多糖、谷胱甘肽、抗性淀粉、甘油、异vc酸的多种生物活性成分，并配制为富含多种营养益生成分和菌体保护物质的乳酸菌制剂，最终经过冷冻干燥处理得到乳白色粉粒状乳酸菌产品，有效提高乳酸菌菌剂活性的同时，增强了产品的营养成分和保健功能；蒙脱土具有吸附、固定、灭活病原微生物，以及吸附、清除毒素和有害因子的作用，是一种具有乳化、增稠、助悬、吸附功能和良好的药用价值的生物活性辅料。抗性淀粉能显著促进乳酸菌生长，协助肠道对铁离子和钙离子的吸收，且来源广泛、制备工艺简单、口感好。谷胱甘肽则具有抗过敏、抗肿瘤、延缓衰老和增强免疫力等功能，是一种重要的抗氧化剂。

本发明的有益效果为：

1.本发明使用脱脂奶粉为培养基，且发酵时间短。

2.本发明固态菌剂制备的冷冻保护剂采用的全是有助于对肠道益生菌增殖的原料：复配不同含量的抗性淀粉、海藻糖、普鲁兰多糖、异vc酸、谷胱甘肽、蒙脱土和甘油为冷冻保护剂。

3.本发明乳酸菌活性菌剂的制备方法经济环保，生产工艺简单高效，生产成本低；产品无异味，口感柔和，有天然发酵乳香味；乳酸菌具有高酸、胆盐耐受能力和胆固醇脱除能力，在模拟人工胃肠液中存活率高，具有良好的益生保健功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1菌粉在ph1.5、ph2.5条件下的存活率变化情况；

图2菌株在ph2.0的人工胃液中活菌数变化情况；

图3菌株在ph8.0的人工肠液液中活菌数变化情况；

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

实施例1

首先，配制含12％(w/v)脱脂奶粉的培养基，110℃灭菌10min，冷却至室温后，按3％的比例接入两歧双歧杆菌，发酵生产乳酸菌活菌剂，35℃恒温发酵6h，至脱脂奶粉乳凝固，ph为4.0时发酵结束，发酵得到乳酸菌活菌，该活菌经过150rpm搅拌、冷却至室温，得到乳酸菌活菌剂，其有效活菌数为2.0×10⁹cfu/ml。

然后，将制得的乳酸菌活菌剂在6000r/min离心5min收集菌体，弃上清液，用1ml脱脂奶粉重悬菌体胶头滴管吸取菌悬液，将菌悬液与冻干保护剂按照1:4的比例混合均匀，平衡30min，其中保护剂的配方为：甘油0.5-2.5％(w/v)、海藻糖3.0-5.0％(w/v)、抗性淀粉1.0-3.0％(w/v)、普鲁兰多糖1.0-3.0％(w/v)、异vc酸0.1-0.5％(w/v)，谷胱甘肽0.2-0.5mm，蒙脱土0.1-1.0％(w/v)，水5-70％(w/v)。

将混匀后的菌悬液倒入待冻干的器皿中预冷冻，预冷冻参数为：混匀后的菌悬液在4℃冰箱内平衡30min后，移入-30℃冰箱内平衡60min，再移入冷冻干燥剂中冷冻干燥，所得固态乳酸菌菌剂含水量2.2％，乳酸菌有效活菌数1.17×10¹²cfu/g。

实施例2

首先，配制含15％(w/v)脱脂奶粉的培养基，110℃灭菌12min，冷却至室温后，按3％分别接入嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚杆菌、瑞士乳杆菌，经39℃恒温发酵6h、ph为4.5时发酵结束，发酵得到乳酸菌活菌，该活菌经过150rpm搅拌、冷却至室温，得到乳酸菌活菌剂，其有效活菌数为3.6×10⁹cfu/ml。

然后，将制得的乳酸菌活菌剂在6000r/min离心5min收集菌体，弃上清液，用1ml脱脂奶粉重悬菌体胶头滴管吸取菌悬液，将菌悬液与冻干保护剂按照1:7的比例混合均匀，平衡30min，其中保护剂的配方为：甘油0.5-2.5％(w/v)、海藻糖3.0-5.0％(w/v)、抗性淀粉1.0-3.0％(w/v)、普鲁兰多糖1.0-3.0％(w/v)、异vc酸0.1-0.5％(w/v)，谷胱甘肽0.2-0.5mm，蒙脱土0.1-1.0％(w/v)，水5-70％(w/v)。

将混匀后的菌悬液倒入待冻干的器皿中预冷冻，预冷冻参数为：混匀后的菌悬液在4℃冰箱内平衡30min后，移入-30℃冰箱内平衡60min，再移入冷冻干燥剂中冷冻干燥，所得固态乳酸菌菌剂含水量3.21％，乳酸菌有效活菌数1.45×10¹²cfu/g。

对照例1为普通市售乳酸菌菌剂。

本发明实施例1和实施例2制备的固态乳酸菌菌剂性能检测：

1)取0.1g对比例1、实施例1和实施例2中的冻干菌粉，接到5ml新鲜mrs培养基中，37℃静止培养至od600＝1.0，离心收集菌体，弃掉培养基。将菌体悬浮在牛胆盐浓度为0.5％、1.0％、1.5％的mrs培养基中，37℃继续培养6h后，等比稀释，涂布mrs平板，活菌计数，每个实验重复三次，求其平均值将以上所得的乳酸菌菌粉进行酸、胆盐和人工胃肠液耐受能力检测，胆盐耐受能力如表1所示：实施例1和实施例2中的乳酸菌菌粉对胆盐的耐受能力高于对比例1。

表1不同胆盐质量浓度下菌株的生长情况

2)取0.1g对比例1、实施例1和实施例2中的冻干菌粉，接到5ml新鲜mrs培养基中，37℃静止培养至od600＝1.0，离心收集菌体，弃掉培养基，将菌体悬浮在ph为1.5、2.5的mrs培养基中，根据胃酸的酸度和食物在胃中的停留时间，将菌株培养基在37℃条件下继续培养4h后，等比稀释，涂布mrs平板，活菌计数，每个实验重复三次，求其平均值，计算其存活率。结果如图1所示，实施例1和实施例2的冻干菌粉在酸性ph培养基中存活率高，既实施例1和实施例2冻干菌粉的酸耐受性高。如图1所示为菌粉在ph1.5、ph2.5条件下的存活率变化情况；

其中：a1为0h时的活菌数；a2为6h时的活菌数。

3)菌粉胆固醇去除能力测定：供试菌株以0.1g转接于mrs-stc-chol培养基，37℃发酵24h。分别测定培养上清液(12000×g，10min，4℃)中胆固醇含量，计算胆固醇去除率。胆固醇去除率(％)＝(初始胆固醇含量-上清液胆固醇含量)/初始胆固醇含量×100％，结果如表2所示，实施例1的胆固醇降解率低于对比例1，但是实施例2的胆固醇降解率高于对比例1。

表2菌粉在mrs-stc-chol培养液胆固醇含量降解情况(μg/ml)

4)菌株对人工胃肠液的耐受性评价：以对比例1、实施例1和实施例2为检测菌粉，用胃蛋白酶、胰蛋白酶、猪胆盐和浓盐酸模拟人工胃、肠液，对此4中菌粉的人工胃肠液耐受性进行比较。结果如图2、3所示，实施例2对人工胃、肠液耐受性较高，该菌粉中菌株在ph＝2.0的人工胃液中处理6小时，能保持6.3×10⁸cfu/ml活菌数，在ph＝8.0的人工肠液中处理6小时，能保持2.3×10⁸cfu/ml活菌数，该活菌数的保持，为菌粉在肠道内黏附和定植提供了良好的保障。

综上述实验结果，经过本发明制备的益生固态乳酸菌菌剂能够显著提高乳酸菌高存活率的同时，提高乳酸菌菌剂的益生功能。同时菌粉具有较高的酸、胆盐耐受能力和胆固醇脱除能力，在模拟人工胃肠液中存活率高，具有良好的益生保健功能。

当然，上述说明也并不仅限于上述举例，本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述；以上实施例仅用于说明本发明的技术方案并非是对本发明的限制，参照优选的实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换都不脱离本发明的宗旨，也应属于本发明的权利要求保护范围。