本发明涉及一株假单胞菌及其双功能酶制剂的制备方法与应用，属于环境生物技术领域。
背景技术：
持久性有机污染物(pops)是环境中一类具有持久性、半挥发性、长距离迁移性、生物蓄积性和高毒性的有机污染物，分布广泛，对人体危害巨大。其中，工业化学品多氯联苯(pcbs)是首批被列入国际《斯德哥尔摩公约》的pops，其氯化程度越高，毒性越大，越难分解。有机氯农药阿特拉津是一种半衰期长的三嗪类除草剂，因其可移动性强，对土壤、水生生态系统和饮用水源产生严重污染，已被学术界提名为新pops物质。目前，已有pops污染问题亟待解决，新的pops污染事故仍不断发生，及时有效地治理和修复污染环境，对人类健康和经济发展至关重要。
微生物降解因其低耗、易于实现原位修复、环境安全和纯生态过程的显著优点，是公认的治理pops污染的一种环保而有效的手段。好氧微生物能够把低氯pcbs(ncl<5)氧化为氯代苯甲酸，但很难降解高氯pcbs(ncl≥5)；厌氧生物过程将高氯pcbs还原成低氯pcbs，但不能破坏苯环结构。目前，微生物降解pcbs周期长、效率低，好氧条件下的高氯代pcbs高效降解未见报道。胡江等利用arthrobactersp.ha1可在84h实现对阿特拉津的高效降解。然而，能够同时实现高效降解不同种类pops的多功能酶在国内外尚属空白。鉴于土壤、水生生态系统污染并非单一污染因素造成，制备能够高效降解pops的多功能酶，提高pcbs、有机氯农药的降解速率，对推进污染环境的大规模快速修复具有重要意义。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一株来源于pops污染土壤的能降解多氯联苯、阿特拉津的假单胞菌及其双功能酶制剂的制备方法与应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一株假单胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株，2017年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.13960。
上述假单胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株采用如下方法筛选获得：
取pops污染土壤浸出液，分别稀释至浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的5个浓度梯度。将稀释后的菌悬液涂布于含有多氯联苯和阿特拉津的固体培养基，每个浓度做两个平行，30℃培养1～3天。将生长较快、形态较为典型的细菌菌落挑出，然后经过3次平板划线分离纯化后，挑单菌落于无机盐液体培养基中，30℃、150转/分钟培养3天，取培养物1.5ml加入0.5ml甘油，混匀后于-80℃冰箱长期保存。用于涂布菌悬液的固体培养基为lb固体培养基，组分如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1l，ph自然。用于单菌落培养的无机盐液体培养基组分如下：磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，氯化钠0.2g，硫酸铵1.0g，蛋白胨2.0g，水定容至1l，ph7.0。
将上述所得到的菌株，分别接种到含有多氯联苯和阿特拉津的无机盐液体培养基上，150转/分钟、30℃培养72h，观察菌液浑浊情况，同时取菌悬液进行600nm处的吸光值检测。依据上述指标选择产酶菌株。将在无机盐培养基中吸光值最高的菌株挑取到lb固体培养基上培养，并保种记为eco-1。
假单胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株，经测定，其16srrna的基因序列长度为1401bp，核苷酸序列如seqidno.1所示。通过使用美国生物工程信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation,ncbi)blastn程序比对，本发明的菌株的16srrna的基因序列与ncbi注册的假单胞菌标准菌株(pseudomonas)16srrna的基因序列具有较高的同源性。经比对，与标准菌株pseudomonasputidaatcc12633，pseudomonasaspleniiatcc23835亲缘关系最近，相似度为99％，但是目前未见假单胞菌(pseudomonassp.)能够降解多种pops的报道。
上述16srrna基因测序的基本方法是：用细菌基因组提取试剂盒(天根)制备菌株的基因组dna，以菌株的基因组dna为模板，使用细菌16srrna基因的通用引物进行扩增，用胶回收试剂盒(天根)纯化pcr扩增产物，电泳验证后，由青岛擎科梓熙生物技术有限公司完成16srrna基因测序，将所得序列与美国国家生物信息中心(ncbi)收录的标准菌株的16srrna基因序列进行比对。
利用上述假单胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株生产双功能酶制剂的方法，步骤如下：
(1)取假单胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株划线于lb固体培养基上，28～37℃倒置活化培养1～2天，制得活化后菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化后菌株接种至lb液体培养基中，在温度为28～37℃、转速为100～200转/分钟的条件下，摇床培养1～2天，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按1～10％的体积百分比接种于无机盐培养基中，在温度为28～37℃、转速为100～200转/分钟的条件下，扩大培养3～5天，制得假单胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌液；
(4)取步骤(3)制得的假单胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌液，在3000～10000转/分钟的条件下，离心2～10分钟，收集菌体，悬浮于10～30倍体积的ph6.0～8.0的磷酸缓冲液中，进行超声波细胞破碎，在4～25℃、3000～8000转/分钟的条件下，离心2～5分钟，收集上清液，制得双功能酶制剂。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的lb固体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1l，ph自然。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的lb液体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1l，ph自然。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的无机盐培养基，每升组分如下：
磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，氯化钠0.2g，硫酸铵1.0g，蛋白胨2.0g，联苯0.5g，阿特拉津0.025g，水定容至1l，ph7.0。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中的超声波细胞破碎，条件如下：
破碎时间/间隙时间为2秒/2秒，总时间17分钟，功率为165瓦。
上述双功能酶制剂在降解多氯联苯、阿特拉津中的应用。
上述应用，步骤如下：
取上述制得的双功能酶制剂，调整体系中多氯联苯浓度0.5～5mg/l和/或阿特拉津的浓度50～500mg/l，加入双功能酶制剂使体系中双功能酶制剂浓度为0.05～0.25g/l，在温度为20～37℃的条件下，反应3～24小时，即可。
有益效果
本发明首次从pops污染土壤中分离获得一株假单胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株，利用该菌株首次制备获得能够高效降解多氯联苯、阿特拉津的双功能酶制剂，尤其对在好氧条件下难降解的高氯代多氯联苯降解活性显著，这与现有已知的假单胞菌(pseudomonassp.)及其酶制剂的功能完全不同，具有大规模生产应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
一株假单胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株，2017年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.13960。
上述假单胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株采用如下方法筛选获得：
取pops污染土壤浸出液，分别稀释至浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的5个浓度梯度。将稀释后的菌悬液涂布于含有多氯联苯和阿特拉津的固体培养基，每个浓度做两个平行，30℃培养1～3天。将生长较快、形态较为典型的细菌菌落挑出，然后经过3次平板划线分离纯化后，挑单菌落于无机盐液体培养基中，30℃、150转/分钟培养3天，取培养物1.5ml加入0.5ml甘油，混匀后于-80℃冰箱长期保存。用于涂布菌悬液的固体培养基为lb固体培养基，组分如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1l，ph自然。用于单菌落培养的无机盐液体培养基组分如下：磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，氯化钠0.2g，硫酸铵1.0g，蛋白胨2.0g，水定容至1l，ph7.0。
将上述所得到的菌株，分别接种到含有多氯联苯和阿特拉津的无机盐液体培养基上，150转/分钟、30℃培养72h，观察菌液浑浊情况，同时取菌悬液进行600nm处的吸光值检测。依据上述指标选择产酶菌株。将在无机盐培养基中吸光值最高的菌株挑取到lb固体培养基上培养，并保种记为eco-1。
假单胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株，经测定，其16srrna的基因序列长度为1401bp，核苷酸序列如seqidno.1所示。通过使用美国生物工程信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation,ncbi)blastn程序比对，本发明的菌株的16srrna的基因序列与ncbi注册的假单胞菌标准菌株(pseudomonas)16srrna的基因序列具有较高的同源性。经比对，与标准菌株pseudomonasputidaatcc12633，pseudomonasaspleniiatcc23835亲缘关系最近，相似度为99％，但是目前未见假单胞菌(pseudomonassp.)能够降解多种pops的报道。
上述16srrna基因测序的基本方法是：用细菌基因组提取试剂盒(天根)制备菌株的基因组dna，以菌株的基因组dna为模板，使用细菌16srrna基因的通用引物进行扩增，用胶回收试剂盒(天根)纯化pcr扩增产物，电泳验证后，由青岛擎科梓熙生物技术有限公司完成16srrna基因测序，将所得序列与美国国家生物信息中心(ncbi)收录的标准菌株的16srrna基因序列进行比对。
实施例2
利用上述假单胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株生产双功能酶制剂的方法，步骤如下：
(1)从-80℃冰箱划线假单胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株于lb固体培养基上，28℃倒置培养1天；
所述lb固体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1l，ph自然；
(2)挑取eco-1单菌落至lb液体培养基中，在温度为28℃、转速为200转/分钟的条件下，摇床培养1天，制得种子液；
所述lb液体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1l，ph自然；
(3)将步骤(2)制得的种子液，按10％的体积百分比接种于无机盐培养基中，在温度为28℃、转速为200转/分钟的条件下，扩大培养5天，制得假单胞菌eco-1菌液；
所述无机盐培养基，每升组分如下：
磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，氯化钠0.2g，硫酸铵1.0g，蛋白胨2.0g，联苯0.5g，阿特拉津0.025g，水定容至1l，ph7.0；
(4)取步骤(3)制得的假单胞菌eco-1菌液，在3000转/分钟的条件下，离心10分钟，收集菌体，悬浮于30倍体积的ph7.0的磷酸缓冲液中，进行超声波细胞破碎，在4℃、3000转/分钟的条件下，离心2分钟，收集上清液，制得双功能酶制剂；
所述的超声波细胞破碎，条件如下：
破碎时间/间隙时间为2秒/2秒，总时间17分钟，功率为165瓦。
对比例
如实施例2所述的方法，不同之处在于，采用的菌株为pseudomonasputidaatcc12633。
实验例1、双功能酶对多氯联苯降解能力的分析
将浓度25mg/l的五氯联苯pcb114底物、双功能酶、pbs缓冲液按1:5:19(体积比)的比例混合后，在30℃、ph7.0下反应12h，加入10ml正己烷萃取3次，取萃取液，用gc-ms法检测五氯联苯降解率，pcb114降解率可达65.7％。
对比例中菌株pseudomonasputidaatcc12633胞内酶、pbs缓冲液、浓度25mg/l的五氯联苯pcb114底物按5:19:1(体积比)的比例混合后，在30℃、ph7.0下反应12h，加入10ml正己烷萃取3次，取萃取液，用gc-ms法检测五氯联苯降解率，pcb114未被降解。
实验例、双功能酶对阿特拉津降解能力的分析
将浓度100mg/l的阿特拉津底物、双功能酶、pbs缓冲液按1:10:38(体积比)的比例混合后，在25℃、ph7.5下反应6h，加入10ml二氯甲烷萃取3次，取萃取液，用hplc法检测阿特拉津降解率，降解率可达45％。
对比例中菌株pseudomonasputidaatcc12633胞内酶、pbs缓冲液、浓度100mg/l的阿特拉津底物按10:38:1(体积比)的比例混合后，在25℃、ph7.5下反应6h，加入10ml二氯甲烷萃取3次，取萃取液，用hplc法检测阿特拉津降解率，降解率为7.3％。
结果显示，假单胞菌eco-1菌株制备的双功能酶能够高效降解多氯联苯、阿特拉津，尤其对好氧条件下难降解的高氯代多氯联苯具有较高降解活性，在pops污染治理与修复领域具有潜在的应用价值。对比例中与假单胞菌eco-1同源性较高的假单胞菌标准菌株pseudomonasputidaatcc12633，其胞内酶在好氧条件下对高氯代多氯联苯不具有降解能力，对阿特拉津的降解率远远低于假单胞菌eco-1菌株胞内酶。假单胞菌eco-1菌株制备的双功能酶是能够同时实现高效降解不同种类pops的多功能酶，这与现有已知的假单胞菌(pseudomonassp.)及其酶制剂的功能完全不同，具有大规模生产应用前景。
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