专利名称：：增强免疫的乳酸菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及乳酸菌的新菌株及其在增强免疫中的应用。
背景技术：
：消费含有乳酸菌(LAB)的产品具有一系列的保健作用，其中包括增强免疫。乳酸菌菌株有几千种，但其中仅有一些菌株具有促进健康的性质。这些细菌的耐酸和耐胆盐性、附着于粘膜上皮细胞的能力和通过胃肠道时的存活能力被认为是选择促进健康菌株的重要标准。目前仅有几株乳酸菌被证明具有保健作用。新西兰专利248057公开了显示具有良好的附着小肠的粘膜上皮细胞从而使其具有治疗用途的LAB菌株。这一专利中描述的微生物能增强天然免疫(吞噬细胞功能)和获得性免疫(抗体应答和淋巴细胞增殖应答)。还需要能增强广谱免疫应答包括吞噬细胞功能的其它乳酸菌。本发明的一个目的是能在某种程度上实现这些需要或者至少提供给公众增强免疫乳酸菌的实用选择。发明描述因此，本发明的一个方面包括鼠李糖乳杆菌HN001(LactobacillusrhamnosusHN001)的生物学纯培养物，澳大利亚政府分析实验室(AGAL)保藏号为NM97/09514，保藏日为1997年8月18日。本发明的另一个方面包括鼠李糖乳杆菌HN067(LactobacillusrhamnosusHN067)的生物学纯培养物，AGAL保藏号为NM97/01925，保藏日为1998年2月17日。本发明的再一个方面包括一种组合物，该组合物包括免疫刺激浓度的嗜酸性乳杆菌HN017(LactobacillusacidophilusHN017)，AGAL保藏号NM97/09515，保藏日为1997年8月18日、鼠李糖乳杆菌HN001、鼠李糖乳杆菌HN067或乳双岐杆菌HN019(BifidobacteriumlactisHN019)，AGAL保藏号NM97/09513，保藏日1997年8月18日任一种的生物学纯培养物，以及一种生理学可接受的赋形剂或稀释剂。在一个实施方案中，所述的组合物含有所述菌株的两种或多种。优选地，所述的生理学可接受的赋形剂或稀释剂是一种食品。优选地，所述的食品是酸乳(culturedmilk)、酸牛奶(yoghurt)、乳酪、乳饮料或奶粉中的任何一种。或者，所述的组合物是药物组合物，所述的赋形剂或稀释剂是药物学可接受的赋形剂或稀释剂。下述任一种菌株的同源物或突变体的增强免疫的生理学可接受的生物学纯菌株嗜酸性乳杆菌HN017，鼠李糖乳杆菌HN001，乳双岐杆菌HN019，或嗜酸性乳杆菌HN067。在另一个实施方案中，本发明包括增强天然和获得性免疫的方法，所述方法包括给予哺乳动物免疫刺激剂量的任一种上述生物学纯培养物。在另一个实施方案中，存在两种或三种上述菌株的基本上生物学纯培养物。优选地，所述的培养物以组合物的形式与生理学可接受的赋形剂或稀释剂一起给予。优选地，所述的生理学可接受的赋形剂或稀释剂是一种食品。优选地，所述的食品是酸乳、酸牛奶、乳酪、乳饮料或奶粉。本发明还单独或集合包括本申请文件中所指或所示的部分、要素和特征，以及任何两种或多种所述部分、要素或特征的任意组合或全部组合，并且当本文提到的特定整体在本发明所涉及的现有技术中有已知的等价物时，这种已知的等价物被认为并入本文，就象单独提到一样。附图简述图1示出如实施例5所述给小鼠补加用鼠李糖乳杆菌HN001发酵的产品或含有鼠李糖乳杆菌HN001的未发酵产品对外周血白细胞的吞噬细胞活性的影响。给BALB/c小鼠喂食含有在发酵的或未发酵的产品中的109cfu(每天)鼠李糖乳杆菌HN001的牛奶基食物，共14天。用流式细胞计数和荧光素异硫氰酸酯标记的大肠杆菌测定外周血白细胞的吞噬细胞活性。数值是平均值±标准误差。与对照的显著差异(ANOVA，SAS程序)**P＜0.0001。图2示出如实施例7所述给小鼠补加活鼠李糖乳杆菌HN001或热灭活的鼠李糖乳杆菌HN001对外周血白细胞的吞噬细胞活性的影响。给BALB/c小鼠喂食牛奶基食物并口服109cfu(每天)活鼠李糖乳杆菌HN001或热灭活的鼠李糖乳杆菌HN001，共14天。用流式细胞计数和荧光素异硫氰酸酯标记的大肠杆菌测定外周血白细胞和腹膜巨噬细胞的吞噬细胞活性。数值是平均值±标准误差。与对照的显著差异(ANOVA，SAS程序)**P＜0.0001。图3示出如实施例8所示给小鼠补加鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019对细菌在用鼠伤寒沙门氏菌攻击的小鼠中的转移的影响。将未补加菌或者补加乳双岐杆菌HN019或鼠李糖乳杆菌HN001的BALB/c小鼠随着持续每日补加菌口服给予鼠伤寒沙门氏菌进行攻击。攻击后6天无痛处死小鼠，取其肝和脾检测细菌转移。在计数前将收获的器官的组织悬液在MacConkey琼脂平板上培养24-48小时。数值是平均值±标准误差。与对照的显著差异(ANOVA，SAS程序)*P＜0.05。图4示出如实施例8所示给小鼠补加鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019对用鼠伤寒沙门氏菌攻击的小鼠的外周血白细胞的吞噬细胞活性的影响。将未补加菌或者补加乳双岐杆菌HN019或鼠李糖乳杆菌HN001的BALB/c小鼠随着持续每日补加菌口服给予鼠伤寒沙门氏菌进行攻击。攻击后6天用流式细胞计数和荧光素异硫氰酸酯标记的大肠杆菌测定外周血白细胞的吞噬细胞活性。数值是平均值±标准误差。具有不同上标的数值(平均值±标准误差)具有显著差异(ANOVA，SAS程序)P＜0.01。图5示出如实施例8所示给小鼠补加鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019对用鼠伤寒沙门氏菌攻击的小鼠的脾淋巴细胞的增殖应答的影响。将未补加菌或者补加乳双岐杆菌HN019或鼠李糖乳杆菌HN001的BALB/c小鼠随着持续每日补加菌口服给予鼠伤寒沙门氏菌进行攻击。攻击后6天，通过保温96小时并在保温最后16小时掺入5-溴-2＇-脱氧尿苷来比色测定脾淋巴细胞的增殖应答。具有不同上标的数值(平均值±标准误差)具有显著差异(ANOVA，SAS程序)P＜0.01。实施发明的方式四株细菌菌株的冻干培养物在澳大利亚政府分析实验室(AGAL)的新南威尔士地区实验室(地址1SuakinStreet，Pymble，新南威尔士2073，澳大利亚)保藏，保藏细节如下菌株保藏号保藏日嗜酸性乳杆菌HN017NM97/095151997年8月18日鼠李糖乳杆菌HN001NM97/095141997年8月18日乳双岐杆菌HN019NM97/095131997年8月18日鼠李糖乳杆菌HN067NM97/019251998年2月11日发现上述四株菌能增强广谱免疫应答，包括天然和获得性免疫应答。实施例1形态学和一般特征使用RAPD分析、16SrRNA测序及SDS-PAGE分析证实这些菌株的分类学特征。还发现嗜酸性乳杆菌HN017与新西兰专利248057中的嗜酸性乳杆菌(LC1)遗传学上不同。使用RAPD分析、16SrRNA测序及SDS-PAGE分析证实鼠李糖乳杆菌HN067的分类学特征，用于在分子水平鉴定鼠李糖乳杆菌HN067的种特异性引物包括PrI(正向)5-CAGACTGAAAGTCTGACGG-3和PhaII(反向)5-GCGATGCGAATTTCTATTATT-3。这一菌株的形态学和糖发酵性质见表1和表2。表1形态学和其它特征</tables>表2所选乳杆菌和双岐杆菌菌株的糖发酵模式用API50CH糖发酵试剂盒测定糖发酵模式。*分值基于22种主要糖的分值(伯杰氏手册)实施例2对小肠细胞的粘附在体外用不同的细胞系测定所述益生菌菌株粘附人小肠上皮细胞(HT-29和CaCo-2)的能力。在盖玻片上培养HT-29和CaCo-2细胞单层并置于多孔平板上，然后将在1ml发酵培养物上清中的108cfu/mlLAB及1mlDMEM培养基一起加到细胞单层上，并在10％CO2-90％空气下于37℃培养1小时。用PBS洗单层4次，在甲醇中固定，革兰氏染色并在显微镜下计数粘附于上皮细胞的细菌数。平均计数20个区域，结果见表3。表3对HT-29和CaCo-2细胞系的粘附*<>*细菌数(平均±SEM)/100个上皮细胞实施例3对天然和获得性免疫的增强作用通过测定小鼠中吞噬细胞(血白细胞和腹膜巨噬细胞)功能并定量针对用于模拟对疫苗的应答的蛋白抗原的特异抗体的浓度检测鼠李糖乳杆菌HN001、嗜酸性乳杆菌HN017和乳双岐杆菌HN019三株菌的免疫增强作用。使用了下述实验方案1、使用6-7周龄的重20-30g的BALB/c小鼠。2、随机分配小鼠至不同的处理组(表4)3、给小鼠喂食在50μl脱脂牛奶中的嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019(109cfu/天)，共10天，对照小鼠每天接受50μl脱脂牛奶。4、在整个实验期间所有小鼠均接受脱脂牛奶基食物。来自接受嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019的小鼠的血白细胞和巨噬细胞与来自对照小鼠的细胞相比具有明显较高的吞噬细胞能力(表4)。来自益生菌喂养的小鼠的白细胞产生的氧自由基(oxidativeburst)也比对照小鼠高(数据未示出)。表4饮食性嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001和乳双岐杆菌HN019对小鼠中吞噬细胞功能的影响</tables>将109cfu(每天)嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019口服给予BALB/c小鼠，共10天。用流式细胞计数和荧光素异硫氰酸酯标记的大肠杆菌测定血白细胞和腹膜巨噬细胞的吞噬细胞活性。数值是平均值±标准误差。与对照的显著差异(Student＇st检验)*P＜0.05，**P＜0.01。在接受嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019的小鼠的血清和小肠洗液中的特异IgG抗体的浓度也比对照小鼠高(表5)。表5嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001和乳双岐杆菌HN019对血清和粘膜抗体应答的影响将109cfu(每天)嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019口服给予BALB/c小鼠，共10天。在第0天和第7天用霍乱毒素(一种用于模拟肠道传染的抗原)免疫小鼠。在第10天用ELISA测定血清和小肠分泌物中的特异抗体浓度。数值是平均值±标准误差。与对照的显著差异(Student＇st检验)*P＝0.08，**P＜0.05，***P＜0.01。实施例4补加LAB4周后的免疫刺激作用用下述实验方案在小鼠中评价嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001和乳双岐杆菌HN019的免疫刺激作用1、使用6-7周龄的重20-30g的BALB/c小鼠。2、随机分配小鼠至不同的处理组(18个/组)。3、驯化(7天)后，给小鼠喂食109cfu(每天)在50μl脱脂牛奶中的嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019，共28天(从第0天至第28天)，对照小鼠每天接受50μl脱脂牛奶(不加任何微生物)。4、在整个实验期间，给小鼠随意提供脱脂奶粉基食物和水。5、通过检测血白细胞和腹膜巨噬细胞的吞噬细胞活性、脾淋巴细胞的NK细胞活性、对T细胞促分裂原ConA(一种细胞介导的免疫的指示剂)的淋巴细胞增殖(脾细胞)应答、以及对破伤风疫苗的抗体应答来评价免疫刺激作用。如表6所示，接受嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019的小鼠的白细胞(嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)比对照小鼠的白细胞具有明显高的吞噬细胞活性(天然免疫的指示物)。表6饮食性嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001和乳双岐杆菌HN019在小鼠中的作用将在50μl脱脂牛奶中的109cfu(每天)嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019给予小鼠(18个/组)，共28天。在第28天用流式细胞计数和荧光素异硫氰酸酯标记的大肠杆菌测定血白细胞/腹膜巨噬细胞的吞噬细胞活性。数值是最小二乘方平均值。显著差异(SAS分析)*P＜0.002，**P＜0.0005。消耗嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019共28天也使NK细胞活性、对ConA的淋巴细胞增殖应答以及对破伤风疫苗的抗体应答增加。对于所有的免疫活性指示剂，接受嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019的小鼠均具有比对照小鼠高的应答(表7)。这些结果总地示出用嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019补加一段时期能诱导天然和获得性免疫的几个方面的延长的增强作用。表7饮食性嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001和乳双岐杆菌HN019对NK细胞活性、对ConA的淋巴细胞增殖应答以及对破伤风疫苗的抗体应答的作用</tables>将在50μl脱脂牛奶中的109cfu(每天)嗜酸性乳杆菌HN017、鼠李糖乳杆菌HN001或乳双岐杆菌HN019给予小鼠(18个/组)，共28天(即从第0天至第28天)。在第28天用流式细胞计数和D275标记的Yac-1细胞测定脾淋巴细胞的NK细胞活性，在第28天用商购细胞增殖试剂盒(BoehringerMannheim，德国)评价脾淋巴细胞对ConA的淋巴细胞增殖应答。对于抗体应答，在第7天和第21天用破伤风疫苗(50μl/剂，CSL，澳大利亚)免疫小鼠。用ELISA测定特异抗体的浓度；用由疫苗供应商(CSL，澳大利亚)通过的抗原包被平板。数值是18个小鼠的最小二乘方平均值。显著差异(SAS分析)*P＜0.05。实施例5用发酵的对未发酵的产品对天然和获得性免疫的增强作用目的是评价用益生菌鼠李糖乳杆菌HN001制备(发酵)的酸牛奶与含鼠李糖乳杆菌HN001的未发酵的产品相比的免疫增强效果。通过测定吞噬细胞功能(外周血白细胞和腹膜巨噬细胞)以及对B细胞促分裂原(LPS)的淋巴细胞增殖应答来检测免疫增强效果。使用下述实验方案1、使用6-7周龄的重20-30g的BALB/c小鼠。2、随机分配小鼠至不同的处理组。3、在整个实验期间，对照小鼠接受全脂奶粉基食物。4、测试组小鼠每天接受2.5g用鼠李糖乳杆菌HN001(109cfu/天)制备的酸牛奶或2.5g含有鼠李糖乳杆菌HN001(109cfu/天)的全脂牛奶，以及全脂奶粉基食物，共14天。结果观察到接受用鼠李糖乳杆菌HN001制备的酸牛奶或含有鼠李糖乳杆菌HN001的全脂牛奶的小鼠比接受对照食物的小鼠具有明显高水平的外周血白细胞的吞噬细胞活性(图1)。观察到这一增加与鼠李糖乳杆菌HN001是在酸牛奶(用鼠李糖乳杆菌HN001发酵)或含有鼠李糖乳杆菌HN001的未发酵产品中给予无关。接受用鼠李糖乳杆菌(HN001)制备的发酵酸牛奶或含有鼠李糖乳杆菌(HN001)的未发酵WMP产品的小鼠之间的吞噬细胞活性水平没有差别。未发酵的和鼠李糖乳杆菌HN001发酵的产品喂养的小鼠均显示比对照小鼠高的对LPS的淋巴细胞增殖应答(表8)。接受含有鼠李糖乳杆菌HN001的未发酵产品的小鼠和接受用鼠李糖乳杆菌HN001发酵的产品的小鼠之间的应答没有差别。表8发酵的和未发酵的鼠李糖乳杆菌HN001在小鼠中对淋巴细胞增殖应答的作用用含有109cfu(每天)在未发酵产品或用鼠李糖乳杆菌HN001制备的酸牛奶(发酵产品)中的鼠李糖乳杆菌HN001的牛奶基食物喂养BALB/c小鼠，共14天。对照小鼠接受不含LAB的牛奶基食物。通过保温96小时并在保温最后16小时掺入5-溴-2′-脱氧尿苷来比色测定增殖应答。数值是平均值±标准误差。与对照的显著差异(Student＇st检验)*P＝0.05。所有这些结果提示补加鼠李糖HN001增强了一系列免疫功能，包括吞噬细胞活性和淋巴细胞增殖。存在于发酵和未发酵产品中的鼠李糖乳杆菌HN001均能有效激发对免疫功能的增强，发酵产品对于某些功能能给出较高的应答，而未发酵产品对于其它一些功能较优异。实施例6鼠李糖乳杆菌HN067对天然和获得性免疫的增强作用实验1通过测定外周血白细胞和腹膜巨噬细胞的吞噬细胞功能(非特异性免疫的指示物)并测定针对免疫抗原霍乱毒素(用于模拟对肠道疫苗的应答)的特异抗体的浓度来检测鼠李糖乳杆菌HN067的免疫增强效果。使用下述实验方案1、使用6-7周龄的重20-30g的BALB/c小鼠。在整个实验期间，它们用脱脂牛奶基食物喂养。2、测试组小鼠(n＝6)口服给予在50μl脱脂牛奶中的鼠李糖乳杆菌HN067(109cfu/天)，共10天。对照小鼠(n＝6)只接受50μl脱脂奶粉(无任何LAB)。结果观察到来自接受鼠李糖乳杆菌HN067的小鼠的外周血白细胞和腹膜巨噬细胞比对照小鼠的细胞具有明显高水平的吞噬细胞活性(增强的吞噬细胞功能)。结果示于表9。表9饮食性鼠李糖乳杆菌HN067对吞噬细胞活性的影响用牛奶基食物、口服给予或不给予鼠李糖乳杆菌HN067(109cfu/天)喂养BALB/c小鼠(6个/组)，共10天。用流式细胞计数和荧光素异硫氰酸酯标记的大肠杆菌测定血白细胞和腹膜巨噬细胞的吞噬细胞活性。数值是最小二乘方平均值±标准误差LSM。与对照的显著差异(SAS程序)*P＝0.0005，**P＝0.0001。在接受鼠李糖乳杆菌HN067的小鼠的血清和小肠洗液中的针对用于口服免疫的抗原霍乱毒素的特异抗体的浓度也比对照小鼠明显高(表10)。表10饮食补加鼠李糖乳杆菌HN067对针对霍乱毒素的血清和粘膜抗体应答的影响用牛奶基食物、给予或不给予鼠李糖乳杆菌HN067(109cfu/天)喂养BALB/c小鼠，共10天。在第0天和第7天用霍乱毒素(一种用于模拟肠道传染的抗原)(10μg/剂)口服免疫小鼠。在第10天用ELISA测定血清和小肠分泌物中的特异抗体水平。数值是最小二乘方平均值±标准误差LSM。与对照的显著差异(SAS程序)*P＝0.02，**P＝0.0039。实验2用下述实验方案在小鼠中评价鼠李糖乳杆菌HN067的免疫刺激作用1、使用6-7周龄的重20-30g的BALB/c小鼠。在整个实验期间，给小鼠随意提供脱脂奶粉基食物和水2、驯化7天后，口服给予组1(n＝20)的小鼠109cfu(每天)在50μl脱脂牛奶中的鼠李糖乳杆菌(HN067)，共14天。对照小鼠(组2，n＝20)接受不加任何微生物的脱脂牛奶。3、通过检测血白细胞和腹膜巨噬细胞的吞噬细胞活性以及对植物凝集素(PHA)和脂多糖(LPS)(分别为T细胞和B细胞促分裂原)的脾淋巴细胞细胞增殖应答来评价免疫刺激作用。结果观察到来自接受鼠李糖乳杆菌HN067的小鼠的外周血白细胞和腹膜巨噬细胞比对照小鼠的白细胞和腹膜巨噬细胞具有明显高水平的吞噬细胞活性(天然免疫的指示物)(表11)。表11饮食性鼠李糖乳杆菌HN067对小鼠吞噬细胞活性的影响</tables>用牛奶基食物、口服给予或不给予鼠李糖乳杆菌HN067(109cfu/天)喂养BALB/c小鼠，共14天。在第14天用流式细胞计数和荧光素异硫氰酸酯标记的大肠杆菌测定血白细胞/腹膜巨噬细胞的吞噬细胞活性。数值是最小二乘方平均值±标准误差LSM。与对照的显著差异(SAS程序)*P＝0.002，**P＝0.0001。接受鼠李糖乳杆菌HN06714天的小鼠还显示出比对照小鼠高的针对PHA和LPS的淋巴细胞增殖应答。表12补加鼠李糖乳杆菌HN067对针对PHA和LPS的淋巴细胞增殖应答的影响用牛奶基食物、口服给予或不给予鼠李糖乳杆菌HN067(109cfu/天)喂养BALB/c小鼠，共14天。在第14天用商购细胞增殖试剂盒(BoehringerMannheim，德国)测定针对PHA和LPS的脾细胞的淋巴细胞增殖应答。数值是最小二乘方平均值±标准误差LSM。与对照的显著差异(SAS程序)*P＜0.08，**P＜0.01。总之，接受鼠李糖乳杆菌HN067的小鼠显示了对一系列宿主免疫应答的明显的增强作用，包括白细胞吞噬细胞功能、对口服免疫的抗体应答和对T细胞和B细胞促分裂原的淋巴细胞增殖应答。血白细胞(嗜中性粒细胞和单核细胞)和巨噬细胞是天然免疫的主要效应细胞并在抗细菌感染方面起重要作用。还详细记录了对促分裂原(T细胞和B细胞促分裂原)的体外淋巴细胞增殖应答与个体的免疫活性之间的相关性。因此这些结果提示补加鼠李糖乳杆菌HN067能增强若干方面的天然和获得性免疫。实施例7使用活的和热灭活的鼠李糖HN001对天然和获得性免疫的增强作用本项研究的目的在于研究活的和热灭活形式的益生菌鼠李糖HN001的免疫增强作用。通过测定外周血白细胞的吞噬细胞活性评价对免疫功能的作用。通过用霍乱毒素免疫小鼠并测定所产生的特异抗体的浓度研究活的和热灭活形式的鼠李糖HN001对体液免疫的作用。使用下述实验方案1、使用6-7周龄的重20-30g的BALB/c小鼠。2、随机分配小鼠至不同的处理组。3、在整个实验期间，对照小鼠接受脱脂奶粉基食物。4、测试组小鼠每天接受109cfu/天的活的鼠李糖乳杆菌HN001或109cfu/天热灭活的鼠李糖乳杆菌HN001，以及脱脂奶粉基食物，共14天。5、在喂养的第0天和第7天用霍乱毒素口服免疫小鼠。结果与接受对照食物的小鼠相比，鼠李糖乳杆菌HN001喂养明显增强了外周血白细胞的吞噬细胞活性水平(图2)。观察到这一增加与鼠李糖乳杆菌HN001以活菌形式或热灭活形式给予无关。接受活的鼠李糖乳杆菌HN001或热灭活的鼠李糖乳杆菌HN001的小鼠之间的吞噬细胞活性水平没有差别。与对照小鼠相比，用活的和死的鼠李糖乳杆菌HN001喂养均能诱导血清和粘膜抗体应答的增高。然而用活的鼠李糖乳杆菌HN001喂养的小鼠中的应答水平明显较高(表13)。表13活的和热灭活的鼠李糖乳杆菌HN001对小鼠中针对霍乱毒素的血清和粘膜抗体应答的影响</tables>用牛奶基食物、口服给予活的或热灭活形式的鼠李糖乳杆菌HN001(109cfu/天)喂养BALB/c小鼠，共14天。对照小鼠未用LAB喂养。在第0天和第7天用霍乱毒素口服免疫小鼠。在第14天用ELISA测定抗体应答(血清和小肠分泌物)。数值是平均值±标准误差。与对照的显著差异(Studentst检验)*P＝0.05，***P＝0.0005。这些结果提示活的和热灭活的鼠李糖乳杆菌HN001在小鼠中均能增强天然和获得性免疫的某些方面。实施例8乳双岐杆菌HN019和鼠李糖乳杆菌HN001抗感染特性本研究的目的是1、评价乳双岐杆菌HN019和鼠李糖乳杆菌HN001针对胃肠道病原体鼠伤寒沙门氏菌的保护效果。2、确定由乳双岐杆菌HN019和鼠李糖乳杆菌HN001诱导的免疫刺激作用在针对小鼠中鼠伤寒沙门氏菌感染的保护作用中的作用。通过测定细菌向肝脏和脾中的转移而评价抗感染特性。通过测定吞噬细胞功能(外周血白细胞和腹膜内巨噬细胞)和对于T细胞促分裂原(PHA)的淋巴细胞增殖应答检测免疫增强效应。使用下述实验方案1、使用6-7周龄的重20-30g的BALB/c小鼠。2、随机分配小鼠至4个不同的处理组并单独笼养。3、在整个实验期间，对照小鼠接受脱脂奶粉基食物。4、测试组小鼠每天用乳双岐杆菌HN019或鼠李糖乳杆菌HN001(109cfu/天)喂养，7天后攻击，在余下的试验期间内继续用细菌喂养。5、从第7天开始用鼠伤寒沙门氏菌(ATCC1772)以8×105cfu/天口服攻击接受乳双岐杆菌HN019或鼠李糖乳杆菌HN001的小鼠及对照组(无LAB)的小鼠，共攻击5天。6、未感染的对照组不接受鼠伤寒沙门氏菌攻击。7、在攻击后第6天，测定小鼠体内细菌向肝脏和脾的转移以及将小鼠用于免疫功能评价。结果与仅接受鼠伤寒沙门氏菌的小鼠相比，补加乳双岐杆菌HN019和鼠李糖乳杆菌HN001的小鼠均显示出明显降低的细菌向肝脏和脾转移的水平(图3)。攻击感染导致对吞噬细胞功能的明显抑制作用(图4)；用鼠伤寒沙门氏菌攻击的对照小鼠的吞噬细胞活性比未感染小鼠明显低。然而，用鼠伤寒沙门氏菌感染对补加乳双岐杆菌HN019或鼠李糖乳杆菌HN001的小鼠的外周血白细胞的吞噬细胞活性没有作用。这一结论由补加乳双岐杆菌HN019或鼠李糖乳杆菌HN001并用鼠伤寒沙门氏菌攻击的小鼠和正常的未感染对照小鼠中的吞噬细胞活性相似而得出。与鼠伤寒沙门氏菌攻击的对照小鼠相比，补加乳双岐杆菌HN019和鼠李糖乳杆菌HN001的小鼠均显示出较高的对PHA的淋巴细胞增殖应答(图5)。在接受乳双岐杆菌HN019或鼠李糖乳杆菌HN001的小鼠与未感染的对照小鼠之间该应答没有明显差异。这些结果提示补加乳双岐杆菌HN019和鼠李糖乳杆菌HN001能够赋予对肠道病原体如鼠伤寒沙门氏菌的保护作用。对感染的增强的抗性伴有免疫性能的增加。权利要求1.于1997年8月18日保藏于澳大利亚政府分析实验室的保藏号为NM97/09514的鼠李糖乳杆菌HN001或者于1998年2月11日保藏于澳大利亚政府分析实验室的保藏号为NM97/01925的鼠李糖乳杆菌HN067的生物学纯培养物。2.于1997年8月18日保藏于澳大利亚政府分析实验室的保藏号为NM97/09514的鼠李糖乳杆菌HN001的生物学纯培养物。3.保藏于澳大利亚政府分析实验室的保藏号为NM97/01925鼠李糖乳杆菌HN067的生物学纯培养物。4.一种组合物，包括免疫刺激浓度的权利要求2的鼠李糖乳杆菌HN001、权利要求3的鼠李糖乳杆菌HN067、于1997年8月18日保藏于澳大利亚政府分析实验室的保藏号为NM97/09513的乳双岐杆菌HN019或者于1997年8月18日保藏于澳大利亚政府分析实验室的保藏号为NM97/09515的嗜酸性乳杆菌HN017中任一种的生物学纯培养物，以及生理学可接受的赋形剂或稀释剂。5.权利要求4的组合物，含有任意两种或多种所述菌株。6.权利要求4或5的组合物，其中所述的生理学可接受的赋形剂或稀释剂是食品。7.权利要求6的组合物，其中所述的食品是是酸乳、酸牛奶、乳酪、乳饮料或奶粉中的任何一种。8.权利要求4或5的组合物，其是药物组合物，并且其中所述的赋形剂或稀释剂是药物学可接受的赋形剂或稀释剂。9.下述任一种菌株的同源物或突变体的增强免疫的生理学可接受的生物学纯菌株嗜酸性乳杆菌HN017，鼠李糖乳杆菌HN001，乳双岐杆菌HN019，或嗜酸性乳杆菌HN067。10.增强天然和获得性免疫的方法，所述方法包括给予哺乳动物免疫刺激剂量的权利要求1-3和9中任一项所述的生物学纯培养物。11.权利要求10的方法，存在两种或三种上述菌株的生物学纯培养物。12.增强天然和获得性免疫的方法，所述方法包括给予哺乳动物权利要求4-8任一项所述的组合物。13.权利要求10的方法，其中所述的生理学可接受的赋形剂或稀释剂是一种食品。14.权利要求10的方法，其中所述的食品是酸乳、酸牛奶、乳酪、乳饮料或奶粉。全文摘要本发明涉及如下新菌株:鼠李糖乳杆菌HN001和HN067,嗜酸性乳杆菌HN017以及乳双岐杆菌HN019,当摄入时,每种菌株均具有免疫增强作用。文档编号C12R1/23GK1264422SQ98805171公开日2000年8月23日申请日期1998年8月18日优先权日1997年8月21日发明者哈什阿恩吉特·S·吉尔,约翰·B·斯马特,普拉默德·K·戈帕尔申请人:纽西兰乳品局被以下专利引用(1),