用于乳糜泻的乳酸菌的制作方法

专利名称：用于乳糜泻的乳酸菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗或预防乳糜泻(coeliac disease)的乳酸杆菌或链球菌。
背景技术：
乳糜泻是一种小肠自身免疫性病症，发生于始自婴儿期所有年龄段的遗传易感人群。乳糜泻由对麦醇溶蛋白(gliadin)的反应引起，所述麦醇溶蛋白是存在于小麦(和小麦族(Triticeae，例如大麦以及黑麦)的相似蛋白)的谷蛋白中相关的富脯氨酸和谷氨酰胺蛋白家族。当暴露于麦醇溶蛋白时，组织转谷氨酰胺酶修饰蛋白质，且易患乳糜泻的受试者的免疫系统与小肠组织反应和交叉反应，导致炎症反应。之后，炎症引起绒毛萎缩且干扰包括矿物质和脂溶性维生素的营养素的吸收。乳糜泻的典型症状包括腹胀、呕吐、腹泻、体重减轻(或儿童发育障碍)、贫血以及疲乏。免疫系统对于麦醇溶蛋白的最强且最常见的反应是针对长度为33个氨基酸的α 2-麦醇溶蛋白片段(本文中表示为SEQ ID NO:1)(Shan et al.2005 J.Proteome Res.4:1732-1741;Moron et al.2008;Am.J.Cl in.Nut87(2): 405-14)。经临床诊断的乳糜泻的发病率为0.05-0.27%。然而，来自欧洲、印度、南美、澳大利亚以及美国地区的人群研究显不儿童的发病率为0.33%-1.06%,成人的发病率为0.18-1.2%。数据表明许多人未被诊断出，仅具有轻度的胃肠不适症状。至今为止，已知的唯 一有效治疗是终生无谷蛋白饮食。Siegel 等(Siegel M.et al., 2006, Chem Biol 13 (6): 649-58)揭不了十二指肠中降解α2_麦醇溶蛋白的推定33-mer肽表位的酶组合(脯氨酰内肽酶和大麦谷氨酰胺特异性半胱氨酸内妝酶(EP-B2)) ο Piper 等(Piper et al., 2004, J Pharm Exper.Therap311:213-219)揭示了脯氨酰内肽酶降解麦醇溶蛋白肽的用途。TO 2007/108763揭示了用于促进乳糜湾或特应性皮炎的免疫耐受的植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株和鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株。WO 2006/097415揭不了一种由于细菌间的互补蛋白水解活性而能够降解麦醇溶蛋白肽的8种酸面团(sourdough)乳酸菌和双歧杆菌的混合物，所述麦醇溶蛋白肽例如A-麦醇溶蛋白的片段62-75和表位33-mer肽。从这些乳酸菌和双歧杆菌获得的焙烤食品可用于患有乳糜泻的受试者。W003/028745揭示了具有能够降解外啡肽A5(衍生自谷蛋白的5-mer肽)的内肽酶的乳酸菌菌株。这些菌株能够降低肠病原性肽的浓度。

发明内容
进行体外研究以选择具有益生菌特性的乳酸菌菌株。选择了大量属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)或双歧杆菌属(Bifidobacterium)的菌株在培养上清中能够降解与乳糜泻有关的33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)的肽酶活性。之后，对于最初所选的菌株，选择其在胃肠道存活的能力和上清肽酶活性在胃肠道中的稳定性，即其到达乳糜泻作用位点(即小肠)且在此仍具有活跃的降解33-mer肽的肽酶活性的能力。接下来，检测所选的菌株降解推定与乳糜泻有关的其他肽的能力，所述肽即来自α-麦醇溶蛋白的20-mer肽QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF (SEQ ID NO: 2)和来自A-麦醇溶蛋白的 13-mer 肽 LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID NO:3) 令人惊讶地，发现33-mer肽在模拟人消化道的条件下被缓慢降解，产生对人消化酶的进一步降解具有完全抗性的18-mer肽降解产物PQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 4)。该新发现使得能够通过选择乳酸菌菌株降解18-mer肽的能力而实现改进的进一步选择。最终从大量菌株中选择了三种单菌株和两种菌株的混合物。这些菌株对于胃肠道条件具有抗性，产生在胃肠道条件下稳定的高肽酶活性，并且有利地降解与乳糜泻有关的33-mer、20-mer、13-mer肽且还降解具有抗性18_mer肽。从这些菌株纯化负责肽降解的酶，并将其表征、测序，在干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)中，其被鉴定为与延长因子Tu相同的蛋白；在嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)中，其被鉴定为延长因子G。这些特异性乳酸菌菌株或这些具有肽酶活性的细菌所产生的酶可有利地用于患有乳糜泻的人或处于患乳糜泻危险的人，例如具有乳糜泻家族史的人或具有与乳糜泻有关的轻度胃肠问题的人。优选地，以新鲜产品、发酵产品施用所述菌株，更优选地，以发酵乳制品施用所述囷株。
具体实施例方式因此，本发明提供了一种用于治疗和/或预防乳糜泻的乳酸菌菌株和/或经乳酸菌菌株发酵的培养基，其中所述乳酸菌和/或经乳酸菌发酵的培养基能够降解 33-mer 肽 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO:1),20-mer 肽QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF(SE Q ID NO:2)、13_mer 肽 LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID N0:3)和 / 或18-mer肽PQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 4)，并且，其中所述乳酸菌选自乳酸杆菌属和链球菌属组成的组。在本发明的优选实施方式中，所述乳酸菌和/或经所述乳酸菌发酵的所述培养基能够降解 SEQ ID NO: 3 的 33-mer 肽和 SEQ ID NO:4 的 18-mer 肽。本发明还提供了一种用于治疗和/或预防乳糜泻的两种乳酸菌菌株的混合物和/或经两种乳酸菌菌株的混合物发酵的培养基，其中，所述乳酸菌和/或经乳酸菌发酵的培养基能够降解 SEQ ID NO:1 的 33-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的13-mer 肽和 / 或 SEQ ID NO: 4 的 18-mer 肽、优选 SEQ ID NO: 3 的 13-mer 肽和 SEQ ID NO: 4的18-mer肽，且其中所述乳酸菌选自乳酸杆菌属和链球菌属组成的组。本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含选自瑞士乳酸杆菌CNCM1-4279(Lactobacillus helveticus CNCM 1-4279)、德氏乳酸杆菌乳亚种CNCM1-4280 (L.delbrueckii subsp lactis CNCM 1-4280)、干酪乳酸杆菌CNCM1-4270、嗜热链球菌CNCM 1-4269以及嗜热链球菌CNCM 1-2776和保加利亚乳酸杆菌CNCM 1-2787 (L.bulgaricus CNCM 1-2787)的混合物组成的组中的至少一种菌株。本发明还提供了选自乳酸杆菌属和链球菌属组成的组中的至少一种乳酸菌菌株的用途，所述菌株产生蛋白延长因子，所述蛋白延长因子用于降解SEQ ID N0:1的33-mer肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的 13-mer 肽和 / 或 SEQ ID NO:4 的 18-mer肽，优选 SEQ ID NO: 3 的 33-mer 肽和 SEQ ID NO:4 的 18-mer 肽。本发明还提供了一种选择用于治疗和/或预防乳糜泻的乳酸菌菌株的方法，所述方法包括选择具有降解SEQ ID NO:4的18mer肽的能力的菌株的步骤，此时，在所述菌株培养上清的存在下至少45%、优选至少70%的所述肽被水解。乳麽泻

乳糜湾(coeliac disease或celiac disease)有时还被称为腹型斯泼卢腹湾(c(o)eliac sprue)、非热带性乳糜湾、地方性乳糜湾、谷蛋白(gluten)性肠病、谷蛋白敏感性肠病以及谷蛋白不耐症。如本领域已知，该疾病可由医生进行诊断，涉及血清学血液检测，以及常见的内窥镜检查/胃镜检测和活组织检查。乳糜泻是由对麦醇溶蛋白反应所引起的小肠病症，所述麦醇溶蛋白是存在于小麦、大麦以及黑麦的谷蛋白中相关的富脯氨酸和谷氨酰胺蛋白家族。当暴露于麦醇溶蛋白时，免疫系统导致炎症反应，所述炎症反应引起绒毛萎缩且干扰营养素(包括矿物质和脂溶性维生素)吸收。乳糜泻患者常患有腹胀、呕吐、腹泻、体重减轻(或儿童发育障碍)、贫血以及疲乏。乳酸菌本发明的乳酸菌、乳酸菌混合物或经乳酸菌发酵的培养基能够降解如上所述的肽，此时在所选乳酸菌或所选的乳酸菌混合物的培养上清的存在下至少45%、且按照递增的优选顺序至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%以及90%的所述肽被水解。可如下通过存在于在对数期和静止期培养物中获得的所选乳酸菌或所选的乳酸菌混合物的培养上清中的酶促蛋白水解活性来进行肽降解测定:测定在37° C使用含有PBS (例如IOOmM, pH 7.3)、所述肽(例如l_2mM)以及培养上清(例如20-30 μ I)的混合物经48小时进行；然后，煮沸样品、过滤(例如通过0.45 μ m)且通过高效液相色谱进行分析。进行体外研究以选择具有所述特性的乳酸菌菌株。选择了大量属于乳酸杆菌属、链球菌属或双歧杆菌属的菌株在培养上清中能够降解与乳糜泻有关的33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)的肽酶活性。初选的具有该能力的菌株均属于乳酸杆菌属和链球菌属。之后，选择其在胃肠道存活的能力和上清肽酶活性在胃肠道中的稳定性，即其到达乳糜泻作用位点(小肠)且仍具有活跃的降解33-mer肽的肽酶活性的能力。接下来，检测所选的菌株降解推定与乳糜泻有关的其他肽的能力，所述肽即来自α-麦醇溶蛋白的20-mer肽QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF (SEQ ID NO: 2)和来自A-麦醇溶蛋白的 13-mer 肽 LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID NO:3) 令人惊讶地发现33-mer肽在模拟人消化道的条件下被缓慢降解，产生对人消化酶的进一步消化具有完全抗性的18-mer肽降解产物PQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 4)。该新发现使得能够通过选择乳酸菌菌株降解18-mer肽的能力而改进进一步的选择。最终从大量菌株中选择了五种单菌株和两种菌株的混合物。这些菌株将33-mer麦醇溶蛋白肽降解达最高程度(在所选的乳酸菌菌株或如上所述的混合物的培养上清的存在下至少45%、优选至少70%的所述肽被水解)。在所述选择中，优选三种单菌株和两种菌株的混合物的子选择(sub-selection)，原由是它们对胃肠道条件具有最高抗性，在胃肠条件下产生稳定的高肽酶活性，且还降解与乳糜泻有关的20-mer肽和13-mer肽，还降解由33-mer肽生成的具有抗性的18-mer肽。发现下述乳酸菌菌株的培养上清(经发酵的培养基)在降解与乳糜泻有关的肽中最有效。-干酪乳酸杆菌菌株DN_114001，其根据布达佩斯条约于1994年9月28日以保藏号1-1518保藏于法国国家微生物保藏中心(CNCM,Collection Nationale de Culturesde Microorganisms, 25Rue du Docteur Roux, Paris)。该菌株的详细特征在 PCT 申请W096/20607 中公开；-干酪乳酸杆菌菌株DN_114077，其根据布达佩斯条约于2009年12月16日以保藏号1-4270保藏于法国国家微生物保藏中心。基于PCR分型和使用API 50CHL试剂盒(Biomerieux, France)测定的生物化学活性,该菌株被鉴定属于干酪乳酸杆菌。根据API50CHL的结果，1-4270菌株发酵下述糖和醇:核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖(弱反应)、甘露醇、山梨醇、α -甲基-D葡萄糖苷、N-乙酰基葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶苷、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、松三糖、淀粉(弱反应)、龙胆二糖、松二糖、塔格糖、L-阿拉伯糖醇以及葡萄糖酸；-瑞士乳酸杆菌菌株DN_1190118，其根据布达佩斯条约于2010年2月25日以保藏号1-4279保藏于法国国家 微生物保藏中心。基于PCR分型和使用API 50CHL试剂盒(Biomerieux, France)测定的生物化学活性,该菌株被鉴定属于瑞士乳酸杆菌。根据API50CHL的结果，1-4279菌株发酵下述糖和醇:半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰基葡萄糖胺和乳糖；-嗜热链球菌菌株DN_001343，其根据布达佩斯条约于2002年I月24日以保藏号1-2776保藏于法国国家微生物保藏中心。基于PCR分型和使用API 50CHL试剂盒(Biomerieux, France)测定的生物化学活性，该菌株被鉴定属于嗜热链球菌。根据API50CHL的结果，1-2776菌株发酵下述糖和醇:葡萄糖、乳糖以及蔗糖；-保加利亚乳酸杆菌菌株DN_100290，其根据布达佩斯条约于2002年I月24日以保藏号1-2787保藏于法国国家微生物保藏中心。基于PCR分型和使用API 50CHL试剂盒(Biomerieux, France)测定的生物化学活性,该菌株被鉴定属于保加利亚乳酸杆菌。根据API 50CHL的结果，1-2787菌株发酵下述糖和醇:葡萄糖、果糖、甘露糖以及乳糖；-嗜热链球菌菌株DN_001546，其根据布达佩斯条约于2009年12月16日以保藏号1-4269保藏于法国国家微生物保藏中心。基于PCR分型和使用API 50CHL试剂盒(Biomerieux, France)测定的生物化学活性，该菌株被鉴定属于嗜热链球菌。根据API50CHL的结果，1-4269菌株发酵下述糖和醇:葡萄糖、乳糖以及蔗糖；和-德氏乳酸杆菌乳亚种菌株DN_1110272，其根据布达佩斯条约于2010年2月25日以保藏号1-4280保藏于法国国家微生物保藏中心。基于PCR分型和使用API 50CHL试剂盒(Biomerieux, France)测定的生物化学活性,该菌株被鉴定属于德氏乳酸杆菌乳亚种。根据API 50CHL的结果，1-4280菌株发酵下述糖和醇:半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰基葡萄糖胺、麦芽糖以及乳糖。优选地，将嗜热链球菌CNCM 1-2776和保加利亚乳酸杆菌CNCM 1-2787在混合物(例如酸奶起子培养物)中一起使用。
在一种优选的实施方式中，乳酸菌选自干酪乳酸杆菌、瑞士乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、德氏乳酸杆菌乳亚种以及嗜热链球菌组成的组。在另一种优选的实施方式中，所述乳酸菌菌株或两种菌株的混合物选自干酪乳酸杆菌CNCM 1-1518、干酪乳酸杆菌CNCM 1-4270、瑞士乳酸杆菌CNCM 1-4279、嗜热链球菌CNCM 1-4269、德氏乳酸杆菌乳亚种CNCM 1-4280以及嗜热链球菌CNCM 1-2776和保加利亚乳酸杆菌CNCM 1-2787的混合物组成的组。在胃肠条件下最有效且因此优选的菌株选自干酪乳酸杆菌CNCM 1-1518 (菌株DN_114001)、瑞士乳酸杆菌CNCM 1-4279 (菌株DN_1190118)、德氏乳酸杆菌乳亚种CNCM1-4280 (菌株DN_1110272)以及嗜热链球菌CNCM1-2776 (菌株DN_001343)与保加利亚乳酸杆菌CNCM 1-2787 (菌株DN_100290)的混合物。本发明还包括上述菌株，以及衍生自任一亲本菌株仍具有抗谷蛋白肽的肽酶活性的突变菌株或基因转化菌株的用于抗乳糜泻目的的用途。这些突变菌株或基因转化菌株可为其中亲本菌株的一种或多种内源性基因被突变以例如修饰其某些代谢特性(例如，其发酵糖的能力、其对酸的抗性、其经胃肠道运输的存活力、其后酸化或其代谢物生成)。它们还可为由一种或多种感兴趣的基因对于亲本菌株基因转化而产生的菌株，其中，所述基因转化例如用于赋予所述菌株其他生理特性或使其表达期望通过所述菌株而施用的具有治疗或免疫意义的蛋白。然而，本发明不包括PCT申请WO 2007/108763中所公开的植物乳酸杆菌菌株 LB931(DSM 11918)，LB7c (DSM 17853)和 LB3e (DSM 17852)以及鼠李糖乳酸杆菌菌株LB2 KNCIMB 40564)。培养上清中针对谷蛋白肽的肽酶活性位于细胞外的肽酶活性在其中细胞被培养至中对数期的培养物中最高。这表明所述肽酶活性为初级代谢的 一部分。在模拟人胃肠道的环境下，一些菌株的肽酶活性高度稳定(至少25%、优选至少30%肽降解)。所述肽酶活性导致如上所述的LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)、QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF(SEQ ID NO:2)、LGQQQPFPPQQPY (SEQ ID NO: 3)以及具有降解抗性的18-mer肽降解产物PQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:4)的裂解，优选 SEQ ID NO: 3 的 33-mer 肽和 SEQ ID N0:4 的 18-mer肽的裂解。自干酪乳酸杆菌菌株DN_114001 (CNCM 1-1518)以及嗜热链球菌菌株DN_001343 (CNCM 1-2776)分离、纯化肽酶活性，并进行测序，令人惊讶地，所述肽酶活性为延长因子，即，在乳酸杆菌情况下为延长因子Tu和在嗜热链球菌情况下为延长因子G。延长因子Tu和G为直系同源的基因/蛋白质。延长因子为促进翻译延长事件(即蛋白质合成中从第一个肽键形成至最后一个肽键形成的步骤)的蛋白质。细菌延长因子Tu可降解η端封闭的蛋白质。另外，延长因子为具有粘附因子特征的表面蛋白。所述因子在粘蛋白结合能力中起作用。鉬合物本发明还涉及一种组合物，所述组合物包含乳酸菌或两种乳酸菌菌株的混合物和/或经至少一种乳酸菌或两种乳酸菌菌株的混合物发酵的培养基，其中所述乳酸菌选自乳酸杆菌属和链球菌属组成的组。所述乳酸菌、两种乳酸菌菌株的混合物和/或经发酵的培养基能够降解如上所述的 33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)、20-mer 肽 QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF (SEQ ID NO: 2), 13-mer 肽 LGQQQPFPPQQPY (SEQ ID NO: 3)和 / 或 18-mer 肽 PQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 4)，优选 SEQ ID NO: 3 的 33-mer 肽和SEQ ID NO:4 的 18-mer 肽。优选地，具有降解谷蛋白肽能力的本发明的乳酸菌用于制备适于肠给药的组合物。在一种实施方式中，所述组合物包含如上所述的乳酸菌的细胞。优选地，所述组合物包含选自瑞士乳酸杆菌CNCM 1-4279、德氏乳酸杆菌乳亚种CNCM 1-4280、干酪乳酸杆菌CNCM 1-4270、嗜热链球菌CNCM1-4269以及嗜热链球菌CNCM1-2776和保加利亚乳酸杆菌CNCM 1-2787的混合物组成的组中的至少一种菌株，优选瑞士乳酸杆菌CNCM 1-4279、德氏乳酸杆菌乳亚种CNCM 1-4280以及嗜热链球菌CNCM 1-2776和保加利亚乳酸杆菌CNCM 1-2787的混合物。优选地，所述细胞为活细胞。可选地，所述细胞为灭活细胞，但为了不以太大程度地破坏酶活性，所述灭活应以温和方式进行。如果活细胞存在于所述组合物中，它们的存在量优选为每克干重组合物IO5至IO13集落形成单位(Cfu)，优选至少IO6Cfu,更优选至少107cfu,还更优选至少108cfu,最优选至少109cfu。在液体组合物的情况下,这通常对应于IO4至IO12集落形成单位(c fu) / ml、优选至少105cfu / ml、更优选至少106cfu / ml、还更优选至少IO7Cfu / ml以及最优选至少IO8Cfu / ml。任选地，活细胞可存在于组合物中，但没有包含肽酶活性的上清。当在胃肠道中进行细胞的传代时，新肽酶活性将在原位产生。因此，仅具有细胞的组合物仍具有抗谷蛋白活性。优选地，细菌细胞可被分离并添加至组合物中，例如，以干细菌细胞、冷冻细菌细胞或冻干细菌细胞的形式。在一种实施方式中，从所述组合物中去除细菌细胞，但包含肽酶活性的上清存在于产品中。优选地，这样的组合物是从中去除了细菌细胞的发酵产品。去除细菌细胞的合适方式为过滤或离心。在优选的实施方式中，包含肽酶活性的细胞和上清均存在于组合物中。因此，优选地，本发明的乳酸菌用于制备发酵产品。所述发酵产品通常具有发酵过程中产生的细菌的所有细胞外代谢物，包括谷蛋白肽酶活性。任选地，可存在其他乳酸菌菌株。所述发酵产品可以以液体形式存在或以通过干燥发酵液体而获得的干粉形式而存在。优选地，发酵产品为新鲜产品。未经严格加热处理步骤的新鲜产品具有最高的肽酶活性(至少45%、优选至少70%的如上所述的肽被水解)。优选地，所述发酵产品为乳制品，更优选发酵乳和/或发酵乳清。优选地，营养组合物为固定、搅拌或可饮用形式的酸奶或发酵乳。优选地，所述发酵产品是奶酪。优选地，所述发酵产品为发酵的植物，例如固定、搅拌或可饮用形式的发酵大豆、谷物和/或水果。优选地，所存在的营养组合物为婴儿食品、婴儿配方乳或较大婴儿配方乳。优选地，本发明的组合物为营养食品或药品、营养补剂或医用食品。任选地，所述组合物可包含其他乳酸菌菌株。这些其他菌株可用于发酵产品，优选乳制品°
方法本发明还涉及一种选择用于治疗和/或预防乳糜泻的乳酸菌菌株的方法，所述方法包括选择具有降解 SEQ ID NO:1 的 33-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3的13-mer肽和/或SEQ ID NO:4的Iner肽,优选SEQ ID NO:4的18-mer肽能力的菌株的步骤，此时，在所述菌株的培养上清的存在下至少45%、优选至少70%的所述肽被水解。在所述方法的一种实施方式中，其进一步包括选择下述菌株的步骤:所述菌株降解 SEQ ID NO:1 的 3-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的 Iier 肽和 / 或SEQ ID NO: 4的1-mer肽的能力在pH 4_6，优选pH5下稳定(即，超过25%、优选超过30%的所述肽被降解)和/或在选自溶菌酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶组成的组中的消化酶的存在下稳定(即，超过25%、优选超过35%的所述肽被降解)。实施例1:选择乳酸菌培养上清降解SEQ ID NO:1的33-mer肽的能力选择了 34种乳酸杆菌菌株、10种链球菌菌株以及3种双歧杆菌菌株，并对于它们产生具有降解来自α 2-麦醇溶蛋白(推定导致乳糜泻)的33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)的蛋白水解活性的能力进行评价。所包含的所有微生物均在普通培养基和特异性培养基中培养。对于乳酸杆菌菌株，使用普通培养基MRS (20g/l葡萄糖，10g/l蛋白胨，8g/l肉浸出物，5g/l乙酸钠，2g/l磷酸氢二钾，2g/l柠檬酸铵，Iml Tween 80，0.2g/l硫酸镁，0.05g/I硫酸锰)，并且使用特异 性培养基YGBLP(10g/l蛋白胨，8g/l肉浸出物，3g/l酵母浸出物，
2.5g/l磷酸二氢钾，2.5g/l磷酸氢二钾，0.2g/l硫酸镁，0.05g/l硫酸锰，5g/l葡萄糖，5g/I乳糖)。对于链球菌菌株，使用普通培养基Elliker (5g/l葡萄糖，20g/l蛋白胨，5g/l蔗糖，1.5g/l乙酸钠，2.5g/l明胶,0.5g/l抗坏血酸，5g/l酵母浸出物，5g/l乳糖，4g/l氯化钠)和特异性培养基BHI (12.5g/l小牛脑浸出物固体，5g/l牛心浸出物固体，10g/l示蛋白胨(proteose peptone), 2g/l 葡萄糖，5g/1 氯化钠,2.5g/l 磷酸氢二钠)。对于双歧杆菌菌株，在由MRS和半胱氨酸(0.5g/l)组成的普通培养基中和在特异性双歧杆菌培养基(10g/l酪蛋白胨，5g/l肉浸出物，5g/l酵母浸出物，10g/l葡萄糖，ImlTween 80，3g/l磷酸氢二钾和0.5g/l半胱氨酸)中培养。对于乳酸杆菌菌株所选择的培养温度为25° C和37° C，对于链球菌和双歧杆菌菌株为37° C。在有氧和缺氧条件下培养。将在10，OOOrpm下离心5min后获得的上清用于体外33-mer肽降解测定。在对数期和静止期培养物中获得来自普通培养基和特异性培养基的培养上清，以根据初级代谢和次级代谢产生的降解活性进行选择。通过存在于所选微生物的培养上清中的酶促蛋白水解活性进行33-mer肽降解测定。使用 114 μ I PBSdOOmM, pH 7.3)、获自 GENSCRIPT (Pscataway, USA)合成的 12 μ I33-mer肽和24 μ I培养上清在37° C进行反应48小时。接下来，煮沸样品，通过0.45 μ m过滤，并通过配备光电二极管阵列检测器的高效液相色谱仪进行分析。使用来自Waters的C18柱通过HPLC评估残留33-mer肽的定量。在220_和35° C下进行肽检测。所使用的溶剂是具有TFA(0.1%)的miI1-Q水和具有TFA(0.1%)的乙腈。下文表I显示了对上清的选择结果。结果显示特别是属于乳酸杆菌属和链球菌属的菌株的培养上清能够降解所述肽，且培养至对数期的细胞比培养至静止期的细胞在肽降解方面更有效。另外，在大多数情况下，在普通培养基上培养的细胞比在特异性培养基上能够更好地降解33-mer肽。表1:来自在特异性培养基或普通培养基上培养至对数期培养物和静止期培养物的乳酸杆菌、双歧杆菌和链球菌菌株的培养上清的33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO:1)降解的百分率
权利要求
1.一种用于治疗和/或预防乳糜泻的乳酸菌菌株和/或经乳酸菌菌株发酵的培养基，其中所述乳酸菌和/或经乳酸菌发酵的培养基能够降解33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)、20_mer肽 QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF(SEQ ID N0:2)、13_mer肽 LGQQQPFPPQQPY (SEQ ID NO: 3)和 / 或 18-mer 肽 PQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 4)，并且，其中所述乳酸菌选自乳酸杆菌属(Lactobacillus)和链球菌属(Streptococcus)组成的组。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌菌株和/或经乳酸菌菌株发酵的培养基，其中所述乳酸菌和/或其中经所述乳酸菌发酵的所述培养基能够降解SEQ ID NO:1的33-mer肽和SEQID NO:4 的 18-mer 肽。
3.根据权利要求1或2所述的乳酸菌菌株和/或经乳酸菌菌株发酵的培养基，其中所述乳酸菌产生蛋白延长因子和/或其中经所述乳酸菌发酵的所述培养基包含蛋白延长因子，且其中所述蛋白延长因子具有能够降解SEQ ID N0:1的33-mer肽、SEQ ID N0:2的20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的 13-mer 肽和 / 或 SEQ ID NO:4 的 18-mer 肽的肽酶活性。
4.根据权利要求1至3任一项所述的乳酸菌菌株和/或经乳酸菌菌株发酵的培养基，其中所述肽的降解发生在受试者的小肠中。
5.根据权利要求3或4所述的乳酸菌菌株和/或经乳酸菌菌株发酵的培养基，其中至少 45% 的 SEQ ID NO:1 的 33-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的 13-mer 肽和/或SEQ ID NO:4的18-mer肽在所述菌株的培养上清的存在下被水解。
6.根据前述权利要求任一项所述的乳酸菌菌株和/或经乳酸菌菌株发酵的培养基，其中所述乳酸菌选自干酪乳酸杆菌CNCM 1-1518 (Lactobacillus casei CNCM 1-1518)、瑞士乳酸杆菌 CNCM 1-4279 (Lactobacillus helveticus CNCM 1-4279)、德氏乳酸杆菌乳亚种 CNCM 1-4280 (L.d elbrueckii subsp lactis CNCM 1-4280)、干酪乳酸杆菌 CNCM1-4270 (Lactobacillus casei CNCM1-4270)以及嗜热链球菌CNCM 1-4269 (Streptococcusthermophilus CNCM1-4269)组成的组。
7.一种用于治疗和/或预防乳糜泻的两种乳酸菌菌株混合物和/或经两种乳酸菌菌株混合物发酵的培养基，其中所述乳酸菌和/或经乳酸菌发酵的培养基能够降解SEQ ID NO:1的 33-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的 13-mer 肽和 / 或 SEQ ID NO: 4 的18-mer肽,其中所述乳酸菌选自乳酸杆菌属和链球菌属组成的组。
8.根据权利要求7所述的乳酸菌混合物，其包含嗜热链球菌CNCM1-2776和保加利亚乳酸杆菌 CNCM 1-2787 (L.bulgaricus CNCM 1-2787)或由嗜热链球菌 CNCM 1-2776 和保加利亚乳酸杆菌CNCM 1-2787组成。
9.一种组合物,所述组合物包含权利要求1至6任一项所述的菌株或权利要求7和8任一项所述的乳酸菌混合物。
10.一种组合物，所述组合物包含选自瑞士乳酸杆菌CNCM 1-4279、德氏乳酸杆菌乳亚种CNCM 1-4280、干酪乳酸杆菌CNCM 1-4270、嗜热链球菌CNCM 1-4269以及嗜热链球菌CNCM1-2776和保加利亚乳酸杆菌CNCM 1-2787的混合物组成的组中的至少一种菌株。
11.根据权利要求10所述的组合物，所述组合物用于预防和/或治疗乳糜泻。
12.根据权利要求9至11任一项所述的组合物，其中所述组合物是液体产品。
13.根据权利要求9至12任一项所述的组合物，其中所述组合物是乳制品。
14.根据权利要求9至13任一项所述的组合物，其中所述组合物为发酵产品。
15.根据权利要求9至14任一项所述的组合物，其中所述组合物每克干重包含IO5至1013cfu。
16.根据权利要求10至15任一项所述的组合物，其中所述乳酸菌以至少IOltlCfu/天的剂量施用于受试者。
17.自乳酸杆菌属和链球菌属组成的组中的至少一种乳酸菌菌株的用途，其中，所述乳酸菌菌株产生降解 SEQ ID NO:1 的 33-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3的13-mer肽和/或SEQ ID NO:4的18-mer肽的蛋白延长因子。
18.根据前述权利要求任一项所述的组合物或用途，其中所述乳酸菌选自干酪乳酸杆菌CNCM 1-1518、干酪乳酸杆菌CNCM 1-4270、瑞士乳酸杆菌CNCM 1-4279、德氏乳酸杆菌乳亚种CNCM 1-4280以及嗜热链球菌CNCM 1-2776和保加利亚乳酸杆菌CNCM 1-2787的混合物组成的组。
19.酸菌或两种乳酸菌菌株的混合物，其选自干酪乳酸杆菌CNCM1-4270、瑞士乳酸杆菌CNCM 1-4279、德氏乳酸杆菌乳亚种CNCM 1-4280、嗜热链球菌CNCM 1-2776、保加利亚乳酸杆菌CNCM 1-2787以及嗜热链球菌CNCM 1-2776和保加利亚乳酸杆菌CNCM 1-2787的混合物组成的组。
20.择用于治疗和/或预防乳 糜泻的乳酸菌菌株的方法，所述方法包括选择具有降解SEQ ID N0:4的18-mer肽的能力的菌株的步骤，此时，在所述菌株培养上清的存在下，45%的所述肽被水解。
21.根据权利要求20所述的方法，所述方法还包括选择下述菌株的步骤:所述菌株降解 SEQ ID NO:1 的 33-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的 13-mer 肽和 / 或SEQ ID NO:4的18-mer肽的能力在pH 4_6下稳定和/或在选自溶菌酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶组成的组中的消化酶的存在下稳定。
全文摘要
本发明公开了乳酸杆菌属和链球菌属的菌株，所述菌株具有降解与乳糜泻有关的麦醇溶蛋白肽的能力，且其肽降解活性在低pH下和哺乳动物消化酶存在下稳定。这些菌株适于用于预防和/或治疗乳糜泻的产品。
文档编号A61K35/74GK103097513SQ201080066730
公开日2013年5月8日 申请日期2010年3月12日 优先权日2010年3月12日
发明者阿古斯蒂·蒙特塞拉特·卡雷拉斯, 蒙特塞拉特·安德鲁·科罗米纳斯, 丹尼尔·拉蒙·维达尔, 萨尔瓦多·赫诺韦斯·马丁内斯, 埃丝特·巴塔列尔·莱瓦 申请人:热尔韦·达诺尼公司