一株毛霉菌菌株及在发酵青砖茶上的应用的制作方法

本发明涉及毛霉菌的应用及其发酵青砖茶的方法，属于微生物发酵技术应用领域。

背景技术：

青砖茶属于黑茶类，黑茶发酵利用湿热与微生物共同作用发生物质转化，发酵周期长，品质特征突出。而相对于其它黑茶，青砖茶发酵更充分，发酵出来品质口感更加醇和，陈香凸显明显。

湖北青砖茶是以晒毛青叶为原料，经过发酵，成化，蒸压，烘干等程序制成。其中发酵过程对青砖茶的风味形成起着决定性作用。从前人对湖南安化黑茶、云南普洱茶等黑茶系列的研究得知，发酵的过程对改变茶的品质具有非常关键的作用。

根据前人研究发现，发酵过程中，影响茶叶品质风味形成的微生物主要有真菌、酵母、细菌、放线菌等，其中丝状真菌为优势菌株，在发酵过程中起到重要作用。

技术实现要素：

本发明目的在于分离纯化一种可用于青砖茶发酵的毛霉菌株，以及该菌株应用于青砖茶发酵的方法。

本发明从青砖茶发酵茶堆中分离纯化一株菌株；是丝状真菌。经鉴定，该菌株是一种总状枝毛霉菌株(mucorracemosusfres)；命名为毛霉菌xingding-2；保藏于中国典型培养物包藏中心；保藏编号为cctccm2017241；保藏时间为2017年5月5日。

本发明的毛霉菌xingding-2能够用于青砖茶的发酵生产。

采用本发明的毛霉菌xingding-2发酵生产青砖茶的方法为：液态培养毛霉菌xingding-2，富集其孢子制成孢子悬液并计数。按照每斤晒毛青茶投放十万真菌孢子的比例进行接种。

具体采用毛霉菌菌株mucorracemosusfresxingding-2发酵青砖茶的方法如下：

(1)斜面培养：毛霉菌xingding-2接种于斜面培养基上培养，得斜面菌株；

(2)发酵菌种扩大培养：取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，得到种子培养液；

(3)茶叶发酵：选取绿毛茶洒水至含湿量为20-30％，接种步骤(2)中收获的菌种孢子后进行发酵，发酵环境为无尘无污染恒温培养箱渥堆，控制温度为25℃，湿度为90％，发酵3至4天以后，待茶堆温度升到47℃时，进行翻堆，翻堆后茶堆会继续生长白色菌丝体，并伴随温度上升，待温度升到50-55℃时，茶叶颜色全部转化成暗褐色，散发出酵香时，停止；

(4)茶叶蒸制成型：将发酵好的茶叶汽蒸，汽蒸后的茶叶放入成型装置成型，成型后自然凉置，凉置时间为35-45小时，完成青砖茶散茶的制作。

所述的步骤(1)中，毛霉菌xingding-2接种于斜面培养基上，在28℃下培养48小时，得斜面菌株；所用斜面培养基，每1l中含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、琼脂15g，蒸馏水余量，自然ph，115℃灭菌20min。

所述的步骤(2)中，取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在175rpm、28℃的条件下恒温震荡培养48h，得到种子培养液；所用种子培养基，每1l中含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、蒸馏水余量，自然ph，115℃灭菌20min。

所述的步骤(3)中，绿毛茶洒水至含湿量为25％；接种步骤2中收获的菌种孢子，按照每斤茶投放十万真菌孢子的比例进行发酵；发酵环境为无尘无污染恒温培养箱渥堆，控制温度为25℃，湿度为90％。

所述的步骤(4)中，将发酵好的茶叶汽蒸，汽蒸温度为100℃，蒸制时间为3min。

有益效果：

1、首次分离培养出能够用于青砖茶发酵生产的真菌菌株毛霉菌xingding-2；

2、本发明利用真菌发酵方式生产青砖茶，大大缩短了青砖茶发酵周期，提高生产效率；

3、本发明应用外加特定培养真菌菌株的方法，使发酵过程快速形成特定优势菌群，应用于发酵生产青砖茶，生产方式具有新意。

保藏说明

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

地址：湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学

保藏日期：2017年5月5日

保藏编号:cctccm2017241

分类命名：总状枝毛霉mucorracemosusfres(xingding-2)

附图说明

图1：本发明毛霉菌xingding-2在显微镜下形态特征。

图2：本发明毛霉菌xingding-2在pda平板上正面的形态。

图3：本发明毛霉菌xingding-2在pda平板上反面的形态。

图4：添加毛霉菌xingding-2发酵青砖茶茶堆样。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法；所用试剂活仪器为注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1毛霉菌菌株xingding-2的形态学鉴定；

菌株xingding-2分离自青砖茶发酵茶堆，显微镜观察其形态如图1所示。分别在查氏琼脂、查氏酵母琼脂、麦芽汁琼脂等培养基质上培养，培养温度28℃，培养时间2-5d，观察形态。

查氏琼脂上菌落为白色、菌丝体分为两部，营养菌丝生长由中央向四周呈现较规则圆形，气生菌丝较少。察氏酵母琼脂上菌落为白色、菌落形态为较规则圆形，气生菌丝较多，与查氏琼脂相比，生长更快。麦芽汁琼脂上菌落为白色，无气生菌丝，生长较查氏琼脂快，较察氏酵母琼脂慢。参照《真菌鉴定手册》(加入进参考文献)对xingding-2菌株进行形态学比对，确定xingding-2菌株为mucorracemosus属菌。

实施例2菌株xingding-2分子鉴定：

提取菌株基因组dna，利用its1与its4通用引物对该基因组dna进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)以增殖特定dna序列，并利用美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)数据库进行菌株比对。

(1)18srdna序列分析：

its1rdna引物序列：5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'

its4rdna引物序列：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'

扩增获得18srdna序列，序列全长617bp。将该扩增所得18srdna序列与genebank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，从ncbi上查出与菌株xingding-2同源性较高的菌株为mucorracemosusfracemosusstaincbs(eu484278)，同源性达到99％。

(2)lsurdna序列分析：

nl1rdna引物序列：5'-gcatatcaataagcggaggaaaag-3'

nl4rdna引物序列：5'-ggtccgtgtttcaagacgg-3'

扩增获得28srdna序列，序列全长678bp。将该扩增所得28srdna序列与genebank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，查出与菌株xingding-2同源性较高的菌株为mucorracemosusfracemosusstaincbs(hm849676.1)，同源性达到99％

因此可以判定xingding-2为总状枝毛霉菌株。序列已经提交至ncbi上genebank数据库(序列号为ky373220.1)。毛霉菌xingding-2于2017年保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)；保藏编号为cctccm2017241；此生物材料已经存活实验测试并通过该实验。

实施例3利用毛霉菌株进行青砖茶发酵实验：

(1)斜面培养：毛霉菌xingding-2接种于斜面培养基上，在28℃下培养48小时，得斜面菌株。所用斜面培养基，每1l中含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、琼脂15g，蒸馏水余量，自然ph，115℃灭菌20min。

(2)发酵菌种扩大培养：取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在175rpm、28℃的条件下恒温震荡培养48h，得到种子培养液。所用种子培养基，每1l中含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、蒸馏水余量，自然ph，115℃灭菌20min。

(3)茶叶发酵：选取三级绿毛茶洒水至含湿量为25％。接种步骤2中收获的菌种孢子，按照每斤茶投放十万真菌孢子的比例进行发酵。发酵环境为无尘无污染恒温培养箱渥堆，控制温度为25℃，湿度为90％。发酵3至4天以后，发酵真菌在茶堆表面繁殖生长，茶叶叶片上可见白色菌丝体，同时伴随着茶堆温度上升，待茶堆温度升到47℃时，进行翻堆，翻堆后茶堆会继续生长白色菌丝体，并伴随温度上升，待温度升到53℃左右，茶叶颜色全部转化成暗褐色，散发出酵香时，停止。

(4)茶叶蒸制成型：将发酵好的茶叶汽蒸，汽蒸温度为100℃，蒸制时间为3min，得到汽蒸后的茶叶放入成型装置成型，成型后自然凉置，凉置时间为40小时，完成青砖茶散茶的制作。

实施例4发酵青砖茶的审评：

对发酵茶的审评参照《茶叶感官审评方法》，从外形、汤色、香气、滋味等方面对本实验发酵生产的茶叶与传统生产方式生产的青砖茶进行对比，结果如表1。结果显示运用本方法发酵生产的茶与传统方法生产的青砖茶品质上并无太大差异，说明本方法可以用于青砖茶的生产，且本方法用时更短，生产效率更高。

表1本发明生产青砖茶与传统青砖茶审评对比