专利名称：一种利用树干毕赤酵母固定化细胞发酵乙醇的方法
技术领域：
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种利用树干毕赤酵母固定化细胞发酵乙醇的方法。
背景技术：
在化工领域中，乙醇(俗称酒精)是一种重要的工业原料，广泛应用于化工、食品、饮料工业、军工、日用化工和医药卫生等领域，并且乙醇作为一种优良的燃料(其燃烧值达到26900 kj/kg)，可以提高燃油品质口。如今，在发酵行业中，主要采用酿酒酵母生物转化
生产乙醇。·固定化细胞技术根据固定化方法大致分为吸附法、包埋法、共价法和交联法，其中以包埋法应用最为普遍。载体是固定化细胞技术的核心部分。包埋法中的载体有多种，如聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸钙、角叉菜聚糖、琼脂糖、明胶等。目前固定化细胞技术已成为国际上研究的热点之一，广泛应用于工业、医学、环境保护、能源开发及化学分析等诸多领域。海藻酸钙是迄今应用最为广泛的一种固定化载体。它具有网格孔隙大、传质阻力小、制备方法简单及价格低廉等优点。但其强度较差，使用寿命短。这主要是由于培养基中的磷酸盐逐渐使海藻酸钙凝胶破裂和解体。延长海藻酸钙凝胶使用寿命的处理方法较多。
发明内容
本发明提供了一种利用树干毕赤酵母固定化细胞发酵乙醇的方法，本发明以树干毕赤酵母为出发菌株，利用海藻酸锰凝胶代替海藻酸钙，固定化酵母使用寿命明显增加。I. 一种利用树干毕赤酵母固定化细胞发酵乙醇的方法，其特征在于发酵时，将固定化凝胶球用无菌水洗3次后，移入发酵培养基中。发酵容器为250 mL三角瓶，发酵液体积与凝胶球的堆积体积之比为3 :2，其中发酵液体积为50 mL，总体积为80 mL ;将三角瓶置于恒温振荡器中，在35°C、150 r/min条件下进行乙醇发酵。2.步骤I所述的固定化细胞的制备与增殖方法为将试管斜面菌种接入液体酵母细胞培养基，在30°C、150 r/min条件下活化2 d，取2 mL菌液与海藻酸钠溶液(68 mL)于常温下混合，注入2% CaCl2A溶液中，固化4 h，用无菌水将固化后的海藻酸钙凝胶球(直径2 3 mm)洗3次(每次50 mL)，移入I. 2% MnSO4溶液中，放置冰箱(4°C )固化24 h。将固定化好的凝胶球(直经约3 mm)置于增殖培养基中，在30°C、150 r/min条件下增殖培养，12 h更换一次新鲜培养液，共增殖4次。3.步骤I所述的发酵培养基为葡萄糖30. 0 g/L，木糖30. 0 g/L，CaCl2 2. 5 g/L，MgSO4 0. 25 g/L, KH2PO4 2.5 g/L，培养基 pH 5. 0。4.步骤2所述的固定化增殖培养基为葡萄糖30. 0 g/L，木糖30. 0 g/L，蛋白胨3.0 g/L，酵母汁 2. 5 g/L, CaCl2 2.5 g/L，MgSO4
0.25 g/L, KH2PO4 2.5 g/L，培养基 pH 5.0。5.步骤2所述的酵母细胞培养基为木糖20. 0 g/L，蛋白胨5. 0 g/L，酵母汁3. 0g/L，培养基 pH 5.0。6.步骤2所述的海藻酸锰、海藻酸铝的固定化细胞耐磷酸盐能力提高3倍。7.步骤2所述的当MnSO4溶液质量分数为I. 3%时，形成的海藻酸锰固定化酵母进行乙醇发酵最佳。8.步骤2所述的当pH为5. 5时海藻酸锰固定化细胞乙醇发酵较适宜。9.步骤2所述的海藻酸锰固定化细胞乙醇发酵要比海藻酸铝固定化细胞乙醇发酵稳定时间长6 d。本发明利用Mn2+对Ca2+置换法，将低浓度的树干毕赤酵母细胞固定，通过增殖培养，能高效地同步发酵戊糖和己糖，形成的海藻酸锰固定化酵母细胞耐磷酸盐能力显著增强，其使用寿命显著增加。为固定化细胞乙醇发酵的工业化生产提供理论依据。
图I MnSO4溶液质量分数对固定化细胞乙醇发酵糖利用率的影响。图2海藻酸钙、海藻酸铝、海藻酸锰固定化细胞的乙醇发酵。
具体实施例方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。本发明所用的菌株为树干毕赤酵母，购买于CICC，编号为CICC1960。实施例I
本实施案例说明固定化凝胶颗粒耐磷酸盐能力，试验通过Mn2+对Ca2+置换法，形成的海藻酸锰固定化酵母细胞耐磷酸盐能力明显增强。试验过程为分别称取I g固定化凝胶颗粒，溶于50 mL浓度为0.1 mol/L的磷酸盐中性缓冲液中，于35°C条件下，间歇振荡，确定固定化凝胶颗粒开裂及溶解的时间，以测试凝胶颗粒耐磷酸盐能力，结果见表I。从表I可见，海藻酸钙凝胶颗粒中添加剂不同，其耐磷酸盐能力也不同。添加活性炭的固定化凝胶颗粒耐磷酸盐能力没有明显提高，由于活性炭表面积比较大且具有多孔性，添加到海藻酸钙凝胶颗粒里，增加了固定化细胞的通透性，但其耐磷酸盐能力提高不多，开裂时间为30 min，比空白多lOmin，溶解时间均为120 min。添加SiO2比Al2O3效果要好，耐磷酸盐能力提高2倍，而采用置换法形成海藻酸锰、海藻酸铝的固定化细胞耐磷酸盐能力增强显著，因为Mn2+、A13+把Ca2+从海藻酸钙凝胶颗粒中置换出来，磷酸盐对海藻酸锰、海藻酸铝的凝胶颗粒破坏性减少，故海藻酸锰、海藻酸铝的固定化细胞耐磷酸盐能力提高3倍。表I固定化细胞凝胶颗粒耐磷酸盐能力
实验号I添加物I添加物质量分数(％) I凝胶颗粒溶解时间/min I凝胶颗粒破裂时间/min
1- Al2O3 (A)TTo' 14040
2_ Al2O3 (B)~0' 14040
3"MnCl2(A)~0_300180
4_ MnCl2 (B)~0' 12030
5_ SiO2 (A)~0_24060
6~Si02 (B)~0_24070
7_ 活性炭(A)1.0T2030~
8_ 活性炭(B)1.0T2030~
9I 空白|/|l20|20
权利要求
1.一种利用树干毕赤酵母固定化细胞发酵乙醇的方法，其特征在于发酵时，将固定化凝胶球用无菌水洗3次后，移入发酵培养基中；发酵容器为250 mL三角瓶，发酵液体积与凝胶球的堆积体积之比为3:2，其中发酵液体积为50 mL，总体积为80 mL ;将三角瓶置于恒温振荡器中，在35°C、150 r/min条件下进行乙醇发酵。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，固定化细胞的制备与增殖方法为将试管斜面菌种接入液体酵母细胞培养基，在30°C、150 r/min条件下活化2 d，取2 mL菌液与68mL海藻酸钠溶液于常温下混合，注入2% CaCl2A溶液中，固化4 h，用无菌水将固化后的直径2 3 mm海藻酸钙凝胶球洗3次，每次50 mL,移入I. 2% MnSO4溶液中，放置4°C冰箱固化24 h;将固定化好的直经3 mm凝胶球置于增殖培养基中，在30°C、150 r/min条件下增殖培养，12 h更换一次新鲜培养液，共增殖4次。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵培养基为葡萄糖30.O 8/1，木糖30.0g/L, CaCl2 2.5 g/L, MgSO4 O. 25 g/L, KH2PO4 2.5 g/L，培养基 pH 5. 0。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，固定化增殖培养基为葡萄糖30.0g/L,木糖 30. O 8/1，蛋白胨3.0 8/1，酵母汁2.5 g/L, CaCl2 2. 5 g/L，MgSO4O.25 g/L, KH2PO4 2.5 g/L，培养基 pH 5.0。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，酵母细胞培养基为木糖20.0g/L，蛋白胨5. O 8/1，酵母汁3.0 g/L，培养基pH 5.0。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，海藻酸锰、海藻酸铝的固定化细胞耐磷酸盐能力提高3倍。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当MnSO4溶液质量分数为I.3%时，形成的海藻酸锰固定化酵母进行乙醇发酵。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当pH为5.5时海藻酸锰固定化细胞乙醇发酵。
全文摘要
本发明提供了一种利用树干毕赤酵母固定化细胞发酵乙醇的方法，本发明以树干毕赤酵母为出发菌株，利用海藻酸锰凝胶代替海藻酸钙，固定化酵母使用寿命明显增加。
文档编号C12N11/04GK102787143SQ201210311939
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月29日 优先权日2012年8月29日
发明者石大勇 申请人:太仓同济化工原料厂