专利名称：一种利用光滑球拟酵母菌高效制备丙酮酸的方法
技术领域：
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种利用光滑球拟酵母菌高效制备丙酮酸的方法。
背景技术：
丙酮酸是酶法合成色氨酸和酪氨酸、L-多巴(医学上用来治疗帕金森氏病)，是氢化阿托酸的原料、乙烯系聚合物的起始剂、人工器官的合成原料，是合成L-半肤氨酸、L-亮氨酸、VBf^PVB12的原料。同时丙酮酸还可以用来合成系列蛋白酶抑制剂、抗病毒剂、镇静剂、消炎镇痛药、抗病毒剂药物等。丙酮酸的另一个重要应用领域就是用作减肥剂。外界补充丙酮酸，通过刺激
线粒体加速TCA循环，从而加速脂肪消耗达到减肥的目的。Virtual Musde杂志中提到“Pittsburgh医学中心附属大学的科学家们说明饮食中添加含有丙酮酸盐(通常为钠、钾、钙、镁盐)的补充剂，不仅可以增加脂肪的代谢高达48%，而且可以减少因低脂饮食造成的蛋白质流失”。近年来国外发达国家利用丙酮酸这一特性，以其钙盐作为减肥保健药品。国外有关媒体己经报道，含有丙酮酸钙的减肥药已经风靡全球，成为减肥药市场上的新宠。丙酮酸乙酯是农药合成中难以替代的原料和中间体，它被广泛应用于杀菌剂和除草剂的合成。溴代丙酮酸乙酯是高效杀菌剂噻菌灵的主要中间体，噻菌灵是一种高效广谱的内吸式杀菌剂，对植物有保护和治疗作用，还可以控制仓储水果、蔬菜的病害，广泛用于柑橘、香蕉等多种水果蔬菜的防腐保鲜，我国卫生部也准许其作为食品添加剂使用。
发明内容
本发明提供了一种利用光滑球拟酵母菌高效制备丙酮酸的方法，通过对菌株培养条件的研究，确定了菌株最适的发酵培养条件选择种龄19 h的种子液，12%的接种量加入发酵培养基中，CaCO3添加时间为9 h，500 mL三角瓶中装液量以50 mL最佳。I. 一种利用光滑球拟酵母菌高效制备丙酮酸的方法，通过对菌株培养条件的研究，确定了菌株最适的发酵培养条件。具体包括种子培养和发酵产酸步骤。2.步骤I所述的种子培养基为30 g/L葡萄糖，10 g/L蛋白胨，，10 mL/L玉米浆，2 g/L KH2PO4,10 mg/L烟酸，15 μ g/L盐酸硫胺素，2 mg/L盐酸吡哆醇，9 μ g/L生物素，pH为5. 6，30°C培养。3.步骤I所述的发酵培养基为80 g/L葡萄糖，3 g/L蛋白胨，5. 9 g/L硫酸铵，Ig/L KH2PO4,0. 5 g/L MgSO4 · 7H20,8 mg/L 烟酸，15 μ g/L 盐酸硫胺素，2 mg/L 盐酸吡哆醇，9 μ g/L生物素，pH为5.6，30°C培养。4.步骤I所述的最佳种龄为19 h。5.步骤I所述的最佳接种量为12%。6.步骤I所述的最佳CaCO3添加时间为9 h。
7.步骤I所述的装液量500 mL三角瓶以50 mL最佳。本发明使用光滑球拟酵母菌高效制备丙酮酸，通过对菌株培养条件的研究，确定菌株最适的发酵培养条件，提高光滑球拟酵母菌生产丙酮酸能力。
图I种龄对光滑球拟酵母菌产丙酮酸的影响。图2接种量对光滑球拟酵母菌产丙酮酸的影响。图3 CaCO3添加时间对光滑球拟酵母菌产丙酮酸的影响。 图4装液量对光滑球拟酵母菌产丙酮酸的影响。
具体实施例方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。本专利所用的菌株为光滑球拟酵母菌(CCTCC M202019)，购买于CCTCC。
实施例I
本实施案例说明种龄对光滑球拟酵母菌产丙酮酸的影响，为探讨不同种龄对光滑球拟酵母菌产丙酮酸的影响，选择不同种龄进行丙酮酸发酵，结果如图I所示。结果见图1，在添加有玉米浆的种子培养基中菌体在18-21 h之间达到对数生长后期。对数生长后期的菌体量基本上不再有所增加，一般来说此时的菌体活力强，代谢速度快，适于接入发酵。选择种龄分别为15 h、19 h、23 h，27 h的种子接入发酵培养基中发酵，种龄为19 h和23 h的种子对丙酮酸发酵的影响不大；种龄为27 h的种子发酵丙酮酸能力下降较快，推测是菌体衰老造成的；15 h的种子丙酮酸产量低，可能是种子幼嫩造成的。因此选择种龄为19 h的种子接入发酵。实施例2
本实施案例说明接种量对光滑球拟酵母菌产丙酮酸的影响，为探讨不同接种量对光滑球拟酵母菌产丙酮酸的影响，选择不同接种量进行丙酮酸发酵，结果如图2所示。结果见图2，为了考查接种量对丙酮酸发酵的影响，进行了不同接种量实验。向发酵培养基中分别接入4%、6%、8%、10%、12%、14% (体积比)的种子(菌龄19 h)，调整最终装液量一定，菌体浓度随着接种量的增加而增加，而残留葡萄糖浓度随着接种量的增加逐渐下降。在4%-12%的范围内，随着接种量的增加丙酮酸产量上升，在12%的接种量时达最高，随后丙酮酸产量下降。分析可能是因为接种量过大导致菌体生长过旺；种子培养基中带来过多的营养成分(尤其是维生素等生长因子)，造成流向TCA循环的通量增加，降低了丙酮酸产量。实验结果12%的接种量最佳。实施例3
本实施案例说明CaCO3添加时间对光滑球拟酵母菌产丙酮酸的影响，为探讨不同CaCO3添加时间对光滑球拟酵母菌产丙酮酸的影响，选择不同CaCO3添加时间进行丙酮酸发酵，结果如图3所示。结果见图3，发酵前添加CaCO3虽然有利于菌体生长，丙酮酸产量也较高，但是残糖含量高，其原因还有待于进一步研究。9 h添加CaCO3有利于菌体生长和葡萄糖消耗，丙酮酸产量也最高。9 h后添加CaCO3丙酮酸产量下降、残糖高，推测可能是因为不利的高酸性环境导致菌体生长受限，菌体增长缓慢，菌体活力降低。实施例4
本实施案例说明装液量对光滑球拟酵母菌产丙酮酸的影响，为探讨不同装液量对光滑球拟酵母菌产丙酮酸的影响，选择不同装液量进行丙酮酸发酵，结果如图4所示。结果见图4，丙酮酸发酵属于好氧型发酵，通气量对于丙酮酸发酵具有重要影响。测定溶氧量的最佳方法是直接测定发酵液的溶氧系数，但是对于摇瓶发酵，此法操作烦琐。固定摇瓶转速一定，通过调节装液量能初步得出发酵时菌体需氧情况。在体积为500 mL摇瓶中，不同装液量对丙酮酸发酵是有影响的。装液量太大，通气效果差，结果丙酮酸产量低，原因是发酵液溶氧量低，丙酮酸生成乙醛氧化过多的NADH，即丙酮酸向下代谢通量大，丙酮酸产量降低；装液量太小，溶氧量过大，发酵过程中产生的大量NADH通过呼吸链氧化生成ATP，大量的ATP抑制了糖酵解，流向丙酮酸的代谢通量降低，也降低了丙酮酸产量。结果 500 mL三角瓶中装液量以50 mL最好。
权利要求
1.一种利用光滑球拟酵母菌高效制备丙酮酸的方法，包括种子培养和发酵产酸步骤，其特征在于，种子培养基为30 g/L葡萄糖，10 g/L蛋白胨，10 mL/L玉米浆，2 g/L KH2PO4,10 mg/L烟酸，15 μ g/L盐酸硫胺素，2 mg/L盐酸吡哆醇，9 μ g/L生物素，pH为5. 6，30°C培养。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵培养基为80g/L葡萄糖，3 g/L蛋白胨，5. 9 g/L 硫酸铵，I g/L KH2PO4,0. 5 g/L MgSO4 · 7H20,8 mg/L 烟酸，15 μ g/L 盐酸硫胺素，2 mg/L盐酸吡哆醇，9 μ g/L生物素，pH为5.6，30°C培养。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，种龄为19h。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，接种量为12%。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，CaCO3添加时间为9h。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，装液量500mL三角瓶装液50 mL。
全文摘要
本发明提供了一种利用光滑球拟酵母菌高效制备丙酮酸的方法，通过对菌株培养条件的研究，确定了菌株最适的发酵培养条件选择种龄19h的种子液，12%的接种量加入发酵培养基中，CaCO3添加时间为9h，500mL三角瓶中装液量以50mL最佳。
文档编号C12R1/88GK102864179SQ201210311839
公开日2013年1月9日 申请日期2012年8月29日 优先权日2012年8月29日
发明者金雅新 申请人:太仓市茂通化建有限公司