蔬菜发酵生产用发酵菌剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物制剂生产领域，特别是涉及制备一种用于泡菜生产的微生物制 剂及其生产方法。
【背景技术】
[0002] 目前乳酸菌纯种生产泡菜还处于起步阶段，采用的乳酸菌均为酸奶、乳酸等产品 的专有菌种，没有开发出适合泡菜生产的专用菌种。此类菌群在泡菜制作基质的特定环境 中适应性差，生长繁殖困难，无法酿制出发酵泡菜独有的品位。
[0003] 申请号为200710048203.8的发明专利，公开了 "高活性泡菜直投式菌剂的制备技 术"，该发明将植物乳杆菌、短乳杆菌、肠膜明串珠菌按〇. 15~2 %的量分别接入蔬菜汁培养 液中进行振荡培养，并通过滴加10 %ΝΑ0Η溶液控制培养液中的酸度，培养液经离心浓缩，得 离心沉淀物，在其中添加冻干保护剂后进行真空冷冻干燥，得乳酸菌菌剂;酵母菌经增菌培 养、离心浓缩，得离心沉淀物，加入麸皮后干燥、粉碎，得酵母菌菌剂。将植物乳杆菌、短乳杆 菌、肠膜明串珠菌、酵母菌按2~3:1~2:1~2:0.5~1的比例复配后得到泡菜直投式菌剂； 将此菌剂按0.02~0.1%的量接入泡菜坛中，进行泡菜发酵。该发明有利于泡菜的规模化、 标准化生产。
[0004] 申请号为200810172333.7的发明专利，公开了 "一种发酵剂发酵泡菜及其制备方 法"，该发明特别涉及几种纯乳酸菌发酵剂发酵泡菜及其制备方法，其制备的步骤如下：（1) 原料蔬菜的处理:清洗、淋干；（2)盐水的制备；（3)发酵剂溶液的制备；（4)蔬菜装瓶并加入 盐水和发酵剂溶液；（5)发酵;此发明不但提供了一种含益生菌的食品发酵剂的一种新的深 加工途径，而且得到了一种新的传统健康的泡菜。
[0005] 申请号为201110421967.3的发明专利，公开了生物法快速发酵泡菜的制备方法， 特别涉及利用复合菌粉生产泡菜的方法。该发明的主要步骤有：（1)加料密封:蔬菜原料切 分后放入容器中，加入含有醋酸杆菌、酿酒酵母菌的复合菌粉和含有食盐的辅料，密封容 器；（2)发酵:控制温度在23-36°C进行前期发酵，随后将温度控制在15-25°C进行后发酵，整 个发酵时间在20-40小时；（3)脱水调配:发酵完毕脱去泡菜水分，加入调味料混合均匀即 可。该方法适用于不同规模的泡菜生产，可以明显缩短生产时间，泡菜产品营养丰富、口味 纯正，在泡菜生产领域具有广阔的应用前景。
[0006] 由此可知，因微生物菌种的原因，泡菜的工业化生产还是受到了较大的限制;面对 人们生活水平的提高和日益增长的市场需求，泡菜生产用微生物制剂的开发对泡菜的工业 化开发具有重要的现实意义。
【发明内容】
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[0007] 本发明解决的技术问题是提供一种用于蔬菜发酵生产用发酵菌剂；
[0008] 所述蔬菜发酵生产用发酵菌剂含有植物乳杆菌CGMCC N0.11763;
[0009] 所述蔬菜发酵生产用发酵菌剂由如下菌剂组成:植物乳杆菌CGMCC NO. 11763、醋 酸杆菌，所述菌剂的重量份数组成为:植物乳杆菌CGMCC11763 15-20份、醋酸杆菌1-3份.
[0010] 本发明中各种菌种组成比例也是经过精心试验研究得到，上述菌种的选择和配比 保障了泡菜产品的生产速度、泡菜产品良好风味和泡菜产品的良好质量。
[0011] 本发明的技术方案概述如下：
[0012] 本发明首先对植物乳杆菌，醋酸杆菌进行单独培养，培养到预定时间后经离心后 收集菌体，利用常规微生物制剂的生产方法制备各菌的粉状微生物菌粉;将制备的菌种粉 剂根据配比进行混和调配。
[0013] 本发明中菌粉的制备方法如下:所述醋酸杆菌、植物乳杆菌粉状菌粉制备步骤如 下:将斜面菌种转接到液体培养基并逐级扩培到要求的体积;将扩培得到的菌液进行离心 分离，收集沉淀菌体；向沉淀菌体中加入保护剂并进行稀释;利用干燥设备制备粉状菌剂， 上述方法制得植物乳杆菌菌粉中活细胞数为〇 . 1 X 1〇1()-6.0 X 101()个/克，醋酸杆菌菌粉中 活细胞数为〇 · 1 X 1〇9_6 · 0 X 109个/克。
[0014] 所述植物乳杆菌CGMCC11763，于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（简称CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.11763,保藏地址为：中国北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
[0015] 植物乳杆菌益生特性如下：
[0016] 本发明所提供的植物乳杆菌CGMCC N0.11763经实验发现能够在pH为1.50的条件 下存活，在1%胆盐培养4小时后仍处于存活状态;植物乳杆菌CGMCC N0.11763降解亚硝酸 盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓 度在4.8mg/kg以下；CGMCC N0.11763在发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76%。 CGMCC N0 · 11763黏附能力测定的自凝集率为95 · 71 %。
[0017] CGMCC N0.11763对胆固醇降解能力研究和测定：
[0018] 取lml CGMCC N0.11763母液接种于10mL的MRS胆固醇液体培养基（胆固醇含量 0. 1mg/ml，pH 6.2)中，37°C的恒温静置分别培养20h、40h、60h备用，以接入lmL无菌水的MRS 胆固醇培养基为对照，取以上培养不同时间的菌液样品及对照液各lml，9000r/min，4°C下 离心10min，得到发酵上清液，邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量(具体为:取各上清液 0 . lml于相应的试管中，加冰醋酸0.3ml，lmg/ml的邻苯二甲醛0.15ml，缓缓加入浓硫酸 1. 〇ml，混合均匀。室温静置10min，于550nm下测吸光值）。每一处理3个重复，以同样方法制 作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降解率，结果见表1。可知，CGMCCN0.11763 对胆固醇有很好的降解作用，在发酵60h小时后，降解率可达到64.76%。
[0019] 表1对胆固醇的降解情况。
[0021] 菌CGMCC N0.11763菌株的耐胆盐试验：
[0022] 取CGMCCN0.11763菌液lmL接种菌种于含有不同胆盐（含量梯度为0.0%、0.2%、 0.4%、0.6%、0.8%、1%)的1011^]\?5液体培养基(？!1=6.4)，置于37°(3下分别培养0、2、411， 每个处理3个重复。各取lml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释 液于MRS中涂布，于37°C生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平 板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1 %处理4h后菌的生长量依然达到 0· 59±0·92 X 107(cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力。
[0023] 表2耐胆盐能力检测[(土s) X 107cfu/ml]
[0024]
[0025] 菌CGMCC NO.11763菌株的耐酸试验
[0026] 取HLX37母液按lml接种菌种于不同pH值(pH梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)的 lOmLMRS液体培养基，置于37°C下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。各取lml样品菌液于 9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0 . lml稀释液于MRS中涂布，于37°C生化培养箱中倒 置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结果见表3。说明该菌具有 很强的耐酸能力。
[0027]表3 耐酸能力检测[(土s) X 107cfu/ml]
[0028]
[0029] 菌CGMCC NO.11763的黏附能力测定
[0030] 培养CGMCC NO. 11763(MRS液体培养基）、大肠杆菌DH5a(LB液体培养基)24h得发酵 液，分别置于3000r/min、4°C下离心10min，收集菌泥，分别用pH = 7.0的无菌磷酸盐缓冲液 (PBS)洗涤菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于3000r/min、4°C下离心 10min，收集菌体）。自凝集率（％ :用无菌的roS将菌泥CGMCC NO. 11763制成在波长600nm处 的吸光值为〇. 4±0.1 (A0)的悬浮菌液及菌悬液，静置24h后测定吸光值A24，自凝集率（％ ) 公式为(A0-A24)/A0。；他凝集率（％ :将CGMCC N0.11763和大肠杆菌DH5a的悬菌液调节成 在波长600nm处的吸光值为0.6 ± 0.1 (A0)的混合悬浮菌液。静置24H后测定吸光值A24，他凝 集率（％ )公式为（A0-A24)/A0。测定结果见表5,可知CGMCC N0.11763的自凝集率为 95.71%，有很强的黏附能力。
[0031] 表4黏附能力表
[0033] 菌株生理特性
[0034] 所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)XH于201