用混合菌种发酵水产品下脚料的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术，具体的说是一种利用混合菌种发酵水产品下脚料的方法。
【背景技术】
[0002] 随着人们对健康和食品营养的需求越来越高，水产品以低脂肪、高蛋白、富含维生 素和矿物质等特点而越来越受到人们的青睐，由此带来水产品加工业的迅速发展壮大，产 量逐年提升。但在加工过程中，会产生大量的下脚料，如鱼头、鱼皮、鱼鳍、鱼尾、鱼内脏、鱼 骨、鱼胆、鱼漂、虾壳、蟹壳、贝类及其残留鱼肉，其重量约占原料鱼的40%?55%。这类下 脚料大部分被废弃，不仅污染环境，还造成了资源的浪费。从资源利用的角度分析，水产品 下脚料中含有丰富的营养物质和有用成分，如鳗骨、鳗头等废弃物中含有丰富的蛋白质、磷 脂质、软骨素、维生素等，这些下脚料经过微生物的发酵，可以成为很好的农业肥料。
[0003] 近些年来，大量使用化肥带来的环境污染、土壤板结、地方衰退、生态恶化等问题 日益严重，破坏了环境，影响了土壤肥力，降低了农产品的品质。微生物菌肥以投入低、产出 高且绿色无污染等优点而成为发展绿色农业的重要方向。菌肥的矿物质含量和有机质含量 都决定了菌肥的应用范围和效果。优良的菌种及发酵工艺是影响菌肥品质的重要的因素。 目前，对微生物发酵生产菌肥的工艺优化方面的研宄很多，但原料多局限于动物粪便粪、稻 壳、污泥和秸杆等，使用菌种单一，工艺优化也多采用正交试验进行，如曹慧玲等以新鲜牛 粪和稻壳粉为发酵原料，进行牛粪好氧发酵试验，以正交试验，探讨生物有机肥生产的最佳 工艺条件。宋鹏等利用生活垃圾以及污泥混合物为原料，接入有机物料腐熟固体混合菌剂 和有益菌群混合菌悬液，生产微生物肥料。
[0004] 本发明以水产品下脚料为唯一原料，采用对下脚料有高效分解作用的多株菌进行 混合发酵，以游离氨基酸态氮含量为评价发酵的指标，对影响发酵的条件通过单因素试验 及响应面法分析，确定发酵生产的最佳工艺条件，旨在为微生物菌肥的生产拓宽领域及提 供一定的理论依据。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种利用混合菌种发酵水产品下脚料的方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0007] 用混合菌种发酵水产品下脚料的方法，其特征在于：所述方法是利用组合菌种对 水产品下脚料进行发酵，具体步骤包括：
[0008] (1)种子培养：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取组合菌种各一 环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30°C，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数 期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基；所述组合菌种为菌株a、菌株b、菌株c和菌 株d;所述菌株a为食酸菌、菌株b为假单胞菌、菌株c为黑曲霉、菌株d为酵母；
[0009] (2)发酵培养：250mL锥形瓶中装入发酵培养基50mL，按5%接种量将发酵菌液接 入发酵培养基中，在28°C，120rpm条件下摇床培养3d;所述发酵培养基按照重量百分比计 含有：10 %经绞碎的水产品下脚料，90 %蒸馏水。
[0010] 本发明的另一技术方案是所述种子培养步骤中：所述菌株a为
[0011] 菌株a:热带假丝酵母Candidatropicalis、
[0012] 菌株b:罗伦隐球酵母Cryptococcuslaurentii、
[0013] 菌株c:枯草芽抱杆菌Bacillussubtilis、
[0014] 菌株d:赌样芽抱杆菌Bacilluscereus〇
[0015] 优化地，所述水产品下脚料包括鱼鳞、鱼皮及内脏混合物。
[0016] 优化地，所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌 株a、菌株b各一环，菌株c、菌株d各两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30°C， 203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
[0017] 优化地，所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌 株a、菌株b和菌株c各一环、菌株d两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30°C， 203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
[0018] 优化地，所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌 株a-环，菌株b、菌株c、菌株d各两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30°C， 203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
[0019] 优化地，所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌 株a-环，菌株b、菌株c、菌株d各两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30°C， 203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
[0020] 本发明利用混合菌株直接发酵水产品下脚料的过程中无需添加任何其他辅助原 料，微生物即可良好生长，且发酵工艺简单、发酵效果也非常显著，解决了水产品资源浪费 和环境污染问题。
[0021] 本发明通过混合菌株发酵的单因素试验和工艺优化发现，在混菌发酵水产品下脚 料的过程中，发酵条件对游离氨基酸态氮的含量有着重要的影响。本发明在单因素试验基 础上，对发酵温度、接种量和转速三个因素进行响应面法分析，建立二次多项数学模型得到 响应面立体图，优化后得到混合菌株的最佳的发酵条件为：转速203rpm、接种量5%、温度 30°C。经过试验，在上述发酵条件下发酵水产品下脚料，游离氨基酸态氮含量可达13. 865g/ L，较优化前（12. 365g/L)提高了 12. 13%。发酵产物符合水溶性氨基酸肥料标准，也适合制 备微生物肥料。
[0022] 本发明由于利用了水产品加工下脚料，同时又可提高产品的附加值，因而具有较 好的市场开发前景。另外，微生物发酵过程中由于显著减少了产生化学污染和病原菌污染 的机会，与动物源性蛋白和植物源性蛋白相比，品质更稳定、更安全、更可靠。
【附图说明】
[0023] 图1是游离氨基酸态氮标准曲线示意图。
[0024] 图2是转速对发酵液游离氨基酸态氮含量的影响示意图。
[0025] 图3是接种量对游离氨基酸态氮含量的影响示意图。
[0026] 图4是温度对游离氨基酸态氮含量的影响示意图。
[0027] 图5是培养时间对游离氨基酸态氮含量的影响示意图。
[0028] 图6是料液比对游离氨基酸态氮含量的影响示意图。
[0029]图7是转速与接种量对游离氨基酸态氮含量影响的响应面和等高线图。
[0030] 图8是转速与温度对游离氨基酸态氮含量影响的响应面和等高线图。
[0031] 图9是接种量与温度对游离氨基酸态氮含量影响的响应面和等高线图。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1
[0033] 1、制备培养基
[0034] 菌种活化培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA)培养基，青岛高科技工业园海博生物 技术有限公司。
[0035] 种子培养基：马铃薯液体培养基（将200g马铃薯去皮切碎，煮烂后取得土豆汁，加 入20g葡萄糖或者蔗糖，加水至lOOOmL)。
[0036] 发酵培养基：10%(w/v)经绞碎的低值水产品，90%的蒸馏水。
[0037]2实验方法
[0038]2. 1培养方法
[0039] 平板活化培养：28°C培养3d。
[0040] 种子培养：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取所述菌株a食酸菌、 菌株b假单胞菌、菌株c黑曲霉、菌株d酵母各一环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封 口，在28°C，120rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出。
[0041] 发酵培养：25〇1^锥形瓶中装入发酵培养基5〇1^，按5%接种量将发酵菌液接入发 酵培养基中，在28°C，120rpm条件下摇床培养3d。
[0042] 2. 2显色剂的配制
[0043] 15. 00mL37%甲醛与7. 80mL乙酞丙酮混合，加水定容至lOOmL，剧烈振荡使其反 应完全，放置12h后使用。
[0044] 2. 3游离氨基酸态氮含量的测定
[0045] 制作氨基酸态氮标准曲线。
[0046] 样品测定：用移液枪吸取10.OmL发酵上清液于100mL容量瓶中，加水至刻度混匀， 再从中吸取5mL于50mL容量瓶中，加水至刻度，混匀备用。取备用样品lmL于10mL比色管 中。加4.OmL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.OmL显色剂，加水稀释至刻度，混勻。置于100°C 水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入lcm比色杯内，以零管为参比，于波长 400nm处测量吸光度值，并从标准曲线上查出相应的氮含量，乘以样品在整个过程中的稀 释倍数1000,最后折算成氮含量单位为g/L。
[0047] 2. 4影响发酵效果的单因素试验
[0048] 将一定量的种子液接入盛有灭菌发酵培养基的250mL锥形瓶中进行摇瓶发酵，以 游离氨基酸态氮含量为评价指标，分别探宄了转速、水分含量、接种量、发酵温度、发酵时