专利名称：利用水稻核蛋白基因OsSKIP1促进植物在逆境条件下的生长的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及一种水稻DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因OsSKIP1与植物生长有关。将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)结合后直接转入水稻，转基因植株在逆境条件下的生长速度显著提高；而通过RNAi技术抑制内源基因OsSKIP1的表达则显著降低植株生长速度。
背景技术：
植物的生长速度除了有其固有的遗传基础外，往往还会受到诸多环境因素的影响，其中一些不利的非生物逆境(如干旱、高温、低温或盐害等)往往限制了植物正常生长，从而造成作物减产。非生物逆境在许多地区是农业发展的瓶颈，因此，培育抗逆性作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了抵抗或适应环境不利因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子，从而对外界的变化做出相应的反应(Xiong等，Cell signaling during cold，drought andsalt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。而那些功能基因对环境做出反应的过程中能否正确表达受到调控因子的精细调节。转录因子作为一种调控基因，当生物体感受逆境胁迫时，能调控一系列下游基因的表达，从而增强植物体对逆境的耐受能力，达到抵抗不良环境条件胁迫的效果。Kawasaki等(2001)利用表达芯片分析了水稻在高盐胁迫下的早期表达谱，发现有大量的基因能被诱导或抑制，这些基因的诱导表达受到了转录因子的调节参与(Kawasaki S，Borchert C，Deyholos M，Wang H，Brazille S，KawaiK，Galbraith D and Bohnert H J.Gene expression profiles during the initial phase of salt stressin rice.Plant Cell，13889-905，2001)。而在拟南芥中发现AP2/EREBP，Zinc finger，Myb，bZIP类转录因子家族在不同的逆境胁迫下，可诱导表达或被抑制(Shinozaki等，Monitoring the Expression Patternof 1300 Arabidopsis Genes under Drought and Cold Stresses by Using a Full-Length cDNA Microarray.Plant Cell，1361-72，2001)。因而认为这些转录因子家族在植物对逆境的应答过程中起着非常重要的调控作用。因此分离和鉴定对逆境起核心调控作用的转录因子，并用于作物抗逆境的遗传改良有着重要的意义。根据已有的拟南芥转录因子的信息，人们已在植物抗性改良方面作了尝试，利用DREB1A和DREB2A培育的转基因拟南芥植株，其低温耐性和干旱，高盐耐性都比野生型强(Liu Q等，Two transcription factors，DREB1and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA domains separate two cellular signal thansduction pathways indrought-and low-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell，101391-1406，1998)。美国Michigan州立大学的Thomashow MF研究小组利用拟南芥CBF1基因，进行遗传转化，也培育出耐寒性增强的植株(Jaglo-Ottosen等，Arabidopsis CBF1 overexpression induces CORgenes and enhances freezing tolerance.Science，280(5360)104-106，1998)。近年来，通过遗传转化其它类型的转录因子来提高植物的抗逆性的报道也不少，如拟南芥NAC基因(Tran等，Isolation andfunctional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to adrought-responsive cis-element in the early responsiye to dehydration stress 1 promoter.Plant Cell，162481-2498，2004)，水稻锌指蛋白基因OSISAP1(Mukhopadhyay等，Overexpression of a zinc-fingerprotein gene from rice confers tolerance to cold，dehydration，and salt stress in transgenic tobacco.Proc Natl Acad Sci U S A，1016309-6314，2004)。
这些已经报道的转录调控基因所介导的抗逆性通常是使植物对极端逆境的耐受能力增强，但对于逆境条件下植物生长速度的影响还无详细研究。由于植物在遭受逆境胁迫时生长往往受阻(如水稻在孕穗期遭受干旱胁迫会延迟抽穗)，甚至暂时停止生长，这是植物避开不利环境的自我保护机制。但是，这种逆境导致的生长减缓往往使植物体变小、生育期延长从而使产量降低。因此，植物抗逆性遗传改良不仅要增强植物对极端逆境的耐受能力，更为重要的是要把植物在逆境条件下的生长受阻降低到最低程度。
水稻是最重要的粮食作物之一，培育抗逆水稻新品种具有重要意义。在我们的前期研究中分离到一条受干旱诱导的cDNA，序列分析表明它与人类和动物中的SKIP(Ski-interacting protein)蛋白有一定的相似性。SKIP可能是一个起核心作用的核蛋白，通过它与众多不同的核蛋白互作来实现对基因组的表达调控(Scott等，CHES1/FOXN3 interacts with Ski-interacting protein and acts as a transcriptional repressor.Gene，359119-126，2005；Leong等，Ski-interacting protein interacts with Smad proteins to augmenttransforming growth factor-beta-dependent transcription.J Biol Chem.27618243-8，2001；Prathapam等，Ski interacts with the evolutionarily conserved SNW domain of Skip.Nucleic Acids Res.2293469-76，2001)。目前在植物中尚无SKIP同源基因的报道。因此，从水稻中分离出SKIP同源基因并鉴定它对水稻在非生物逆境条件下的生长速度的影响，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要意义。
发明内容
本发明的目的是从水稻中分离克隆一个包含核蛋白同源基因完整编码区段的DNA片段，利用该基因提高水稻或其它植物在逆境和/或正常条件下的生长速度。对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明它与人类和动物中的SKIP(Ski-interacting protein)蛋白有一定的相似性，因此被命名为OsSKIP1。
本发明涉及分离和应用一种包含OsSKIP1基因的DNA片段，该片段赋予植物(例如水稻)在在正常和逆境条件下的生长速度加快的能力。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示的高度同源DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO1所示序列的亚片段。
可以采用已经克隆的OsSKIP1基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsSKIP1基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsSKIP1基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得在正常和逆境条件下的生长速度加快的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。
携带有本发明OsSKIP1基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2ndEdition)。
可使用包括本发明的OsSKIP1基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育抗旱，抗盐或抗寒的植物品种。
本发明基因是受逆境诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的逆境诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物在逆境条件下的生长速度。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
序列表SEQ ID No1显示的是本发明分离克隆的包含有OsSKIP1基因编码区和启动子区的DNA片段序列。
图1是本发明利用ClustalW软件(公开使用软件)将OsSKIP1基因预测的蛋白序列与SKIP同源蛋白序列进行比对的结果。
图2是本发明利用RT-PCR检测OsSKIP1基因在不同组织中的的表达水平。图中1.分蘖期的根；2.剑叶；3.茎；4.短于1cm的幼穗；5.3-5cm的幼穗；6.长于10cm的幼穗；7.雄蕊；8.雌蕊；9.发芽3天的幼苗；3周的幼叶；10.3周的幼苗；11.3周的黄化苗。
图3是本发明的OsSKIP1基因的启动子控制的GUS报告基因在转基因水稻中的表达情况。其中A为对照植株；B为转基因植株；C为对照植株 D为转基因植株E为对照植株；F为转基因植株；G为对照植株；H转基因植株I上为对照植株；I下为转基因植株；J为转基因植株愈伤时期的GUS染色图。
图4是本发明的RNAi转基因植株T1代种子无菌条件下在含125μMG418(一种在植物转基因筛选中使用的商品化的抗生素)的生根培养基上发芽(经PCR检测，G418上能发芽的均为转基因阳性)，对照(野生型中花11)三天后在不含抗生素的生根培养基上发芽，长到大小基本一致移栽。图为其中一个RNAi转基因植株(S59R)和对照(ZH11)的生长曲线。
图5是本发明在水培条件下10个代表性OsSKIP1抑制表达转基因家系(T1)的生长速度(生长天后的株高和鲜重)。其中1号家系为转基因阴性。
图6是本发明在水培条件下代表性OsSKIP1超量表达转基因家系(T1)和对照的生长速度比较。
图7是本发明在不同逆境条件下5个OsSKIP1超量表达转基因家系(T1)和对照的生长速度比较。
图8本发明的超量表达载体OsSKIP1pCAMBIA1301的结构示意图。将本发明实施实例中用到的启动子CaMV35S插入pCAMBIA1301多克隆位点EcoRI和SacI处，再将OsSKIP1全长基因插入该启动子后。
图9本发明的抑制表达载体OsSKIP1’pHellsgate2的结构示意图。将OsSKIP1的一段特异序列重组到抑制表达载体pHellsgate2上。
图10本发明的启动子表达载体OsSKIP1PpCAMBIAI1391Z载体结构示意图。将OsSKIP1的启动子插入pCAMBIAI1391Z的多克隆位点。
具体实施例方式
本发明的前期工作获得了来源于水稻品种“明恢63”(一种中国普遍推广应用的一个杂交水稻亲本)的cDNA克隆V2CHIP15006。该cDNA是OsSKIP1基因的cDNA片段，是一个影响植物生长速度的SKIP同源基因。主要依据有以下几个方面(1)采用cDNA芯片技术分析发现cDNA克隆V2CHIP15006在水稻品种“中旱5号”(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个水稻品种)干旱胁迫处理15天后表达量增加2.1倍。对其进行测序，分析发现其编码产物与人蛋白SKIP同源性高达62.3％，且含有保守的SNW结构域(图1)，据此将此基因命名为OsSKIP1。(2)对其进行逆境条件下的表达谱分析，发现在胁迫处理的过程中，表达量有明显的提高，RT-PCR(图2)和启动子表达活性分析(图3)表明OsSKIP1在不同组织中均有一定表达量。(3)通过RNAi技术抑制水稻内源基因OsSKIP1的表达，转基因植株与对照植株相比，其生长速度大大降低((图4，图5)；而将其全长基因在植株中超量表达后，转基因植株与对照植株相比，无论在正常生长条件还是在逆境条件下其生长速度都显著要快(图6，图7)。这些结果都表明OsSKIP1基因不仅是水稻中一个新的SKIP同源基因，并且可用于调控植物的生长速度。
以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有OsSKIP1基因完整编码区段的DNA片段以及验证OsSKIP1基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1分离克隆包含有OsSKIP1基因区段的DNA片段和OsSKIP1基因通过水稻品种“中旱5号”(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个水稻品种)的干旱诱导基因表达谱分析，发现了一个受干旱诱导(干旱胁迫后期表达量提高2.1倍)的EST(表达序列签)，经序列分析发现，该基因(OsSKIP1)编码产物与人蛋白SKIP有62.3％同源性，并且是5’端部分序列。通过查找日本水稻全长数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所对应的cDNA克隆JO13098N03，并将其定位于第2染色体BAC克隆AP004159的34212 bp-36565 bp上。根据BAC克隆AP004159中OsSKIP1对应的基因组序列，预测其启动子区域，并设计引物PF(5’-TAGGTACCGATCGCGTTGCCCAAATAATTAC，见序列表SEQ ID NO1所示，该序列特异引物外加接头KpnI位点)和PR(5’-TAGGATCCCAGAACACGGAATTTATGTATC，见序列表SEQ ID NO1所示，在该序列特异引物外外加接头BamHI)，将BAC克隆AP004159的34212 bp-36581bp从“明恢63”(一个中国普遍推广应用的一个杂交水稻亲本)的总DNA中扩增出来。扩增产物就是本发明的序列1-2351bp。具体步骤为提取水稻品种“明恢63”叶片中的总DNA(CTAB法抽提，参照文献Zhang等，genetic diversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，Theor Appl Genet，83，495-499，1992)作为模板进行扩增，反应条件为94℃预变性3min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 3min，30个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序(ABI3730测序仪)，获得所需的包含有OsSKIP1基因的DNA片段。该克隆命名为pGEM-OsSKIP1。
采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)从干旱胁迫处理的水稻品种“中旱5号”中提取叶片总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA第一链，反应条件为65℃ 5min，42℃ 50min，70℃ 10min。用上述引物(PF和PR)扩增出OsSIPK1基因的全长cDNA。PCR反应条件为94℃预变性2min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因cDNA。该克隆命名为pGEM-OsSKIP1c。
实施例2，OsSKIP1基因抑制表达、超量表达以及启动子表达载体的构建和转化为了能更好地阐明此基因的功能，申请人将其在水稻中抑制表达和超量表达，从转基因植株的表型来验证；同时也将其启动子融合于GUS报告基因后转化水稻，检测其活性。
抑制表达(RNAi)载体构建方法如下本发明如图9所示首先用RNAi引物V15006F(5’-CACCGACTCTGGGTTTGCTACAG)和V15006R(5’-AAGATGCCCCTTGGAAGTAGA)以从实施例1获得的克隆pGEM-OsSKIP1c为模板扩增出OsSKIP1基因的特异片段(572bp)。反应条件为94℃预变性2min；94℃30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸5min。将该片段亚克隆到pGEM-T载体上。再用引物ALLF(5’-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G)和ALLR(5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTA TTT AGG TGA CAC TAT AG)从带有该片段的pGEM-T载体上扩增出一条可供重组到pHellsgate2载体上的片段(622 bp)。PCR条件同上。重组反应按Invitrogen公司提供的重组克隆试剂盒说明书进行。pHellsgate2是已公开发表的专门用于RNAi载体构建的载体(Wesley等，Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing inplants.Plant J，27581-590，2001)。
超量表达载体构建方法如下如图8所示首先将实施例1中得到的阳性克隆pGEM-OsSKIP1质粒用BamHI和KpnI双酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带不同启动子的遗传转化载体pC1301S酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(按体积比24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含OsSKIP1基因的酶切片段和酶切后的载体做连接反应，转化大肠杆菌DH10β(菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体。遗传转化的载体pC1301S是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(其构建见图8，其原始载体来自澳大利亚CAMBIA[Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture]实验室)基础上，在酶切位点EcoRI和SacI处引入广泛使用的组成型表达的CaMV 35S启动子而得到的。
启动子与报告基因的融合载体构建方法如下如图10所示OsSKIP1启动子序列通过引物5’-TAAAGCTTTGTTTGTGCTTTTGGAG和5’TAAGAATTCTTTGGTTCGATTCGTGTAAT，见序列表SEQ ID NO2所示(扩增产物对应NCBI数据库中BAC克隆AP004159的36566-37565 bp)，以水稻品种明恢63的基因组DNA为模板扩增获得；通过HindIII和EcoRI将OsSIPK1启动子序列酶切后连接到国际上常用的植物启动子活性检测载体pCAMBIA1391Z(来自澳大利亚CAMBIA实验室)中的GUS报告基因前面。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的一个水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素或G418抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant J，6271-282，1994)基础上改良进行。
具体步骤(1)愈伤诱导将成熟的水稻种子(水稻品种“中花11”)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在诱导培养基上；将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。(2)愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。(3)预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。(4)农杆菌培养在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHAi05(来源于CAMBIA，商用菌株)两天，温度28℃；将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。(5)农杆菌侵染将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。(6)愈伤洗涤和选择培养灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次培养2周(第一次筛选用400ppm羧苄青霉素+250ppm潮霉素，第二次以后为250ppm羧苄青霉素以+250ppm潮霉素)。(7)分化将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。(8)生根剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。(9)移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
上述步骤的培养基如下所述试剂配方(1)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下6-BA(6-苄基腺嘌呤)；CN(羧苄青霉素)；KT(激动素或称细胞分裂素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(2、4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制硝酸钾(KNO3) 28.3g磷酸二氢钾(KH2PO4)4.0g硫酸铵((NH4)2SO4) 4.63g硫酸镁(MgSO4·7H2O) 1.85g氯化钙(CaCl2·2H2O) 1.66g逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。
2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制碘化钾(KI)0.08g硼酸(H3BO3) 0.16g硫酸锰(MnSO4·4H2O) 0.44g硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 0.15g室温下溶解并定容至1000ml。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(100X)配制烟酸(Nicotinic acid) 0.1g维生素B1(Thiamine HCl)0.1g维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g甘氨酸(Glycine) 0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ml，4℃保存备用。
5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制硝酸铵(NH4NO3)16.5g硝酸钾19.0g磷酸二氢钾1.7g硫酸镁3.7g
氯化钙 4.4g室温下溶解并定容至1000ml。
6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制碘化钾 0.083g硼酸 0.62g硫酸锰 0.86g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.025g硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.0025g室温下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液1均为mg/ml。
8)葡萄糖贮存液0.5g/ml。
9)AS贮存液的配制秤取AS 0.392g，DMSO 10ml。
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方1)诱导培养基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA贮存液(100X) 10ml维生素贮存液(100X)10ml2，4-D贮存液 2.5ml脯氨酸(Proline) 0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose) 30gPhytagel 3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)继代培养基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA贮存液(100X) 10ml维生素贮存液(100X) 10ml2，4-D贮存液 2.0ml脯氨酸 0.5gCH 0.6g蔗糖 30gPhytagel 3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
3)预培养基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml维生素贮存液(100X) 2.5ml2，4-D贮存液 0.75mlCH 0.15g蔗糖 5g琼脂粉(Agarose)1.75g加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml维生素贮存液(100X) 2.5ml2，4-D贮存液 0.75mlCH 0.2g蔗糖 5g琼脂粉 1.75g加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。
5)悬浮培养基N6max母液(10X) 5mlN6mix母液(100X) 0.5mlFe2+EDTA贮存液(100X)0.5ml维生素贮存液(100X) 1ml2，4-D贮存液0.2mlCH 0.08g蔗糖2g加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。
6)选择培养基N6max母液(10X) 25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml维生素贮存液(100X) 2.5ml
2，4-D贮存液0.625mlCH 0.15g蔗糖7.5g琼脂粉 1.75g加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml6-BA贮存液0.5mlKT贮存液 0.5mlNAA贮存液 50μlIAA贮存液 50μlCH0.15g蔗糖 7.5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA贮存液(100X) 10ml维生素贮存液(100X)10ml6-BA贮存液2mlKT贮存液 2mlNAA贮存液 0.2mlIAA贮存液 0.2mlCH1g蔗糖 30gPhytagel 3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。
9)生根培养基MSmax母液(10X)50mlMSmix母液(100X) 5ml
Fe2+EDTA贮存液(100X) 5ml维生素贮存液(100X) 5ml蔗糖 30gPhytagel 3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。
将OsSKIP1抑制表达的转基因水稻植株分别命名为S59-N(其中S59为pHellsgate2-OsSKIP1载体，含有组成型启动子CaMV 35S，N独立转化植株的编号)；将OsSKIP1超量表达的转基因水稻植株分别命名为S60-N(S60为pC1301S-OsSKIP1载体，含有组成型启动子CaMV 35S)；将OsSKIP1启动子与GUS报告基因的融合载体的转基因水稻植株分别命名为S61-N(S61为pCAMBIA1391-OsSKIP1-P载体，含有OsSKIP1启动子和GUS报告基因)。每个转化载体获得了至少30株独立的转基因水稻植株，本发明总共获得独立转基因水稻植株101株。
实施例3检测水稻内源基因OsSKIP1的表达水平以水稻品种“明恢63”为材料，提取不同生长时期的组织的RNA用RT-PCR检测OsSKIP1基因的表达水平。选取的10种组织分别是1.分蘖期的根；2.剑叶；3.茎；4.短于1cm的幼穗；5.3-5的幼穗；6.长于10cm的幼穗；7.雄蕊；8.雌蕊；9.发芽3天的幼苗；10发芽3周的幼叶；11.3周的黄化苗。总RNA采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA第一链(方法根据反转录酶试剂说明书)，反应条件为65℃ 5min，42℃ 50min，70℃ 10min。以cDNA第一链为模板，采用引物(5’-GACTCTGGGTTTGCTACAG和5’-AAGATGCCCCTTGGAAGTAGA)PCR扩增出OsSKIP1基因的特异片段(572bp)。采用引物(AF5’-GCGTCGACTCCACTCTCGC和AR5’-CCATGAAACAAATCCAACAACA)扩增出的水稻Actin1基因的特异片段(1400bp)以作为内对照进行定量分析。反应条件为94℃预变性2min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸5min。将扩增出的OsSKIP1基因及Actin1基因的特异带的亮度进行比较，并以Actin1基因的特异带的亮度为标准进行均一化后比较不同组织中OsSKIP1基因的表达量。结果表明OsSKIP1基因在所选取的组织中均有一定量的表达，但以黄化苗和幼穗中表达量相对较高(图2)。
启动子活性分析将OsSKIP1基因启动子序列通过引物5’-TAAAGCTTTGTTTGTGCTTTTGGAG和5’-TAAGAATTCTTTGGTTCGATTCGTGTAAT(扩增产物对应NCBI数据库中BAC克隆AP004159的36566-37565bp)从水稻品种明恢63扩增获得后，通过HindIII和EcoRI将OsSKIP1启动子序列酶切后连接到国际上常用的植物启动子活性检测载体pCAMBIA1391Z(由澳大利亚CAMBIA[Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture]实验室提供)的GUS报告基因前面并通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种中花11中。对转基因植株不同组织和器官进行GUS染色。染色液配方；pH＝7.0的0.1M磷酸钠缓冲液20mL，0.5M EDTA溶液1mL，Trion X-100 0.5mL，亚铁氰化钾(Pataxium ferrocyamide)42.5mg，铁氰化钾(Pataxium ferricyamide)33mg，氯霉素(Chloramphenicol)5mg，X-Gluc 50mg，甲醇溶液10mL，加水至50mL)。取新鲜的转化植株的不同组织器官浸泡于GUS染液中置于37℃恒温箱中过夜。脱色后(脱色液使用70％的乙醇)过夜后观察并拍照记录。GUS染色情况(图3)表明OsSKIP1基因启动子具有组成型表达活性，这与RT-PCR的结果是一致的。
实施例4OsSKIP1抑制表达转基因T1家系的生长速度本发明选取了10个OsSKIP1表达受明显抑制的T1家系进行生长速度的测定。具体步骤如下每个T1代家系选取30-40粒种子在含有G418抗生素的水溶液(50mg/ml)中浸种，去除不发芽种子(不含转基因的种子)。将转基因和野生型对照(水稻品种中花11)发芽后5天的幼苗水培种植在90×60×20cm3的培养盒中，培养盒上盖有92×62cm2大小的木盖，木盖上钻有均匀分布的96个孔，每孔种一棵苗，用海绵固定植株。水培的营养液成份如下N40ppm；P10ppm；K40ppm；Ca40ppm；Mg40ppm；Mn0.5ppm；Mo0.05ppm；B0.2ppm；Zn0.01ppm；Cu0.01ppm；Fe2ppm。母液配方如下1、NH4NO3914g/10L2、NaH2PO4-2H2O403g/10L3、K2SO4714g/10L4、CaCl2886g/10L5、MgSO4-7H2O3240g/10L6、MnCl2-4H2O15g，(NH4)6Mo7O24-4H2O0.74g，H3BO39.34g，ZnSO4-7H2O0.35g，CuSO4-5H2O0.31g，FeCl3-6H2O77g，(CH2O)n119g。分别溶解后与500ml浓硫酸混合，定容至10L。
水培时，每3970mL水中加上述母液各5mL.
每家系种植8单株，随即区组设计，三次重复(每个盒中设置对照)。在发芽后的第8，14，20，26，45天时小心45取出秧苗测量植株高度和鲜重。随后将45天的秧苗移栽到大田，按水稻生产上的正常的栽培管理，考查抽穗期和单株产量。图4是一个代表性转基因家系和对照的苗期生长曲线；图5是10个转基因家系和对照在水培45天后的株高和鲜重比较。结果表明OsSKIP1抑制表达的转基因植株的生长显著地受到抑制。
实施例5OsSKIP1超量表达转基因T1家系在不同环境条件下的生长速度本发明选取了5个OsSKIP1超量表达T1家系进行了不同条件下生长速度的测定。具体步骤如下每个T1代家系选取100-150粒种子在含有潮霉素抗生素的水溶液(50mg/ml)中浸种，去除不发芽种子(不含转基因的种子)。将转基因和野生型对照(水稻品种中花11)发芽后5天的幼苗水培种植。水培种植方法同实施例4。与实施例4不同的是，除了正常生长实验外还设置了三个逆境处理实验缺水胁迫(发芽后第10天加入PEG6000，终浓度10％)，盐胁迫(发芽后第10天加入NaCl，终浓度100mM)和低温处理(发芽后第10天移入低温生长箱，昼温10℃保持16小时并且光照充足，夜温6℃保持8小时无光照)。四个生长条件下的生长实验均按随即区组设计，三次重复(每个盒中设置对照)，每个重复中每家系种植8单株。在发芽后的第8，14，20，26，45天时小心取出秧苗测量植株高度和鲜重。随后将45天的秧苗移栽到大田，按水稻生产上的正常的栽培管理，考查抽穗期和单株产量。图6是5个代表性转基因家系和对照的苗期生长曲线；图7是5个转基因家系和对照在不同逆境条件下生长45天后的植株鲜重比较。结果表明OsSKIP1超量表达的转基因植株的生长不论在正常条件还是在逆境胁迫处理下都要显著地优于对照，说明OsSKIP1基因的表达不仅对水稻生长具有促进作用，而且还可以缓解逆境条件造成的植株生长受阻。
序列表SEQUENCE LISTING<110>华中农业大学<120>利用水稻核蛋白基因OsSKIP1促进植物在逆境条件下的生长<130>
<141>2005-10-13<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2351<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
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l5 20 25cgg tat ggc ggg gag tcg gcg caa tcc gac gcg gcg gcg gcg gcg gcg266Arg Tyr Gly Gly Glu Ser Ala Gln Ser Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala30 35 40 45aag cct tcg ggc ccc gcc aag ccc gtg ccg ccg tat ggg aag cgt ggc314Lys Pro Ser Gly Pro Ala Lys Pro Val Pro Pro Tyr Gly Lys Arg Gly50 55 60ggg ttc gtg ccg cgg cgg ccg gag gac ttc ggc gac ggc ggc gcc ttc362Gly Phe Val Pro Arg Arg Pro Glu Asp Phe Gly Asp Gly Gly Ala Phe65 70 75ccg gag atc cac gtc gcg cag tac ccg ctc ggc atg ggc cgg cgc gac410Pro Glu Ile His Val Ala Gln Tyr Pro Leu Gly Met Gly Arg Arg Asp80 85 90gag aag ggc ggt tcg aag atc ctc gcg ctc acc gtc gac gcc aag ggc458Glu Lys Gly Gly Ser Lys Ile Leu Ala Leu Thr Val Asp Ala Lys Gly95 100 105agc gtc gcc ttc gac gcc gtc gtg aag cag ggt gag aac gcc tct aag506Ser Val Ala Phe Asp Ala Val Val Lys Gln Gly Glu Asn Ala Ser Lys110 115 120 125atc gtt tac tca aag cac agc gac ctc gtg ccc aag att gcc acg gct554Ile Val Tyr Ser Lys His Ser Asp Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Ala130 135 140gat tcc gag gca acc gcg gac gac gag gag tac cag aaa cag atc gaa602Asp Ser Glu Ala Thr Ala Asp Asp Glu Glu Tyr Gln Lys Gln Ile Glu145 150 155aaa acc act gaa cga act aaa gct gcc ttg gag aag ggt gtc aat gtt650Lys Thr Thr Glu Arg Thr Lys Ala Ala Leu Glu Lys Gly Val Asn Val160 165 170cgg ttt ttc gcc gac aag cca aag aat gtg cca acg cat gat tca aag698Arg Phe Phe Ala Asp Lys Pro Lys Asn Val Pro Thr His Asp Ser Lys175 180 185tca aag ttt atc aag tat aag cca tcg cag caa tcg gca gcc ttc aat746Ser Lys Phe Ile Lys Tyr Lys Pro Ser Gln Gln Ser Ala Ala Phe Asn190 195 200 205tca ggt gcc aag gaa agg att att agg atg tca aag atg gtt aag gat794Ser Gly Ala Lys Glu Arg Ile Ile Arg Met Ser Lys Met Val Lys Asp210 215 220
cct ctt gag cca ccg aaa ttc aag cat aag cga gtg ccc cgc gct tct842Pro Leu Glu Pro Pro Lys Phe Lys His Lys Arg Val Pro Arg Ala Ser225 230 235gga tca ccg cct gtc cca gtg atg cac tcg cca cca cgg cca gtg aca890Gly Ser Pro Pro Val Pro Val Met His Ser Pro Pro Arg Pro Val Thr240 245 250gtg aag gac cag caa gat tgg aag att cca cca tgc att tca aat tgg938Val Lys Asp Gln Gln Asp Trp Lys Ile Pro Pro Cys Ile Ser Asn Trp255 260 265aaa aat cca aag ggt tac acc ata cca ctc gac aag agg ttg gca gct986Lys Asn Pro Lys Gly Tyr Thr Ile Pro Leu Asp Lys Arg Leu Ala Ala270 275 280 285gat gga agg ggg ctg cag gag gtt caa att aat gat aac ttt gca aag1034Asp Gly Arg Gly Leu Gln Glu Val Gln Ile Asn Asp Asn Phe Ala Lys290 295 300ctc tct gaa gca ctg tat gtg gcg gag cag aag gcc agg gag gca gta1082Leu Ser Glu Ala Leu Tyr Val Ala Glu Gln Lys Ala Arg Glu Ala Val305 310 315cag atg cga tcc aag gtg cag agg gag ctg cag ctg aag gag aag gag1130Gln Met Arg Ser Lys Val Gln Arg Glu Leu Gln Leu Lys Glu Lys Glu320 325 330agg aag gag caa gag cta agg gca ctt gca cag aag gcg cgc atg gag1178Arg Lys Glu Gln Glu Leu Arg Ala Leu Ala Gln Lys Ala Arg Met Glu335 340 345agg act ggt gcc cca cct gca cct aca ggg gtt cct gct ggt ggt ggt1226Arg Thr Gly Ala Pro Pro Ala Pro Thr Gly Val Pro Ala Gly Gly Gly350 355 360 365aga ggt gct gtt ggt gac agg gag gaa gat atg gat ttg gag cag cct1274Arg Gly Ala Val Gly Asp Arg Glu Glu Asp Met Asp Leu Glu Gln Pro370 375 380cgt gag caa cga agg ggg agt aga gaa gaa agg gaa gca agg att gag1322Arg Glu Gln Arg Arg Gly Ser Arg Glu Glu Arg Glu Ala Arg Ile Glu385 390 395cgt gac agg att cgt gag gag agg aga cgt gag agg gag aga gag agg1370Arg Asp Arg Ile Arg Glu Glu Arg Arg Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg400 405 4l0agg ctg gag gcc agg gat gct gca atg ggc aag aag agt aag ctc act1418
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权利要求
1.OsSKIP1基因介导的赋予植物在逆境和/或正常条件下生长速度加快的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO1中第1-2351位所示的DNA序列；或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。
2.合适启动子连接的权利要求1所述的DNA序列。
3.权利要求2所述的DNA序列，它是SEQ ID NO1所示的DNA序列。
4.赋予植物在逆境和/或正常条件下生长速度加快的DNA序列，它是与SEQ ID NO1中第1-2351位所示DNA序列相似性达90％以上的DNA序列。
5.权利要求1-4任一项所述的DNA序列在促进水稻在逆境和/或正常条件下生长中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻DNA片断的分离克隆、功能验证及其在转基因水稻中的应用。所述的DNA片断包含水稻逆境诱导的核蛋白基因OsSKIP1，它赋予植物在逆境和/或正常条件下的生长速度显著提高的能力。将代表该基因的DNA片段与外源启动子结合后直接转入植物体，转基因植物在正常和逆境条件下的生长速度比对照显著提高。
文档编号C12N15/82GK1952141SQ20051001959
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月17日 优先权日2005年10月17日
发明者熊立仲, 侯昕 申请人:华中农业大学