专利名称：人、大鼠、小鼠hsp70双抗夹心法检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术产品，具体地说涉及一种双抗夹心法快速检测HSP70蛋白的检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
热休克蛋白家族(HSPs)是一类高度保守的蛋白，HSP70是热休克蛋白家族中的重要成员，其分为诱导型的组成型的。当机体受到外界环境中多种不良因素刺激时，诱导型的HSP70蛋白表达升高。HSP70蛋白对细胞损伤的修复、存活和维持正常的细胞功能是必需的。在环境刺激、病原菌感染、疾病引起细胞应激损伤中发挥分子伴侣作用，阻止蛋白聚集，促进损伤蛋白的重新折叠。在大多数的哺乳动物，只有在应激条件下HSP70表达，而且显著的细胞和机体应激后才能检测到，但是在人和灵长类，诱导型的HSP70有一个基准值，在一些特殊条件下如过热、化学有毒物质暴露、缺氧、缺血、感染、自身免疫性疾病、凋亡、器官移植、细菌和病毒引起的感染，动脉粥样硬化等心血管疾病中，生物体的HSP70表达显著升高；在正常老化过程，精子发生，月经，运动练习等正常生理过程中，生物体的HSP70表达也显著升高，提示其在这些过程中可能发挥重要作用。一般认为诱导型的HSP70是细胞内的蛋白，但是研究发现在正常人的外周循环和一些疾病状态下能够检测到可溶性的HSP70和HSP70抗体，细胞内的HSP70能够释放到细胞外，细胞外的HSP70成为科学研究的热点。近来的研究主要是探讨HSP70作为细胞保护治疗药物，作为内环境失衡和细胞应激的敏感生物预警指标。现在检测HSP70的方法主要有免疫组化法、Western Bloting、Elisa方法。各种方法互相印证，同时又存在检测灵敏度、专业性、设备设施条件及成本的影响。目前，以血清学反应原理为基础的酶联免疫吸附吸附测定(Elisa)是被广泛接受和推广的方法。
1969年，Avrameas将酶联抗体应用于学清学技术，1971年Engvall和Perlmann将该方法进一步完善发展了ELISA方法。1974年Voller等将ELISA技术应用于人和动物的抗体检测。之后，此方法进一步发展，广泛应用于人和动物的体液蛋白检测。与其他检测方法相比，ELISA检测方法具有成本低、检测设施设备简单、快速高效的特点，并在不断改进当中，已经有直接ELISA、间接ELISA、单抗体ELISA，微波ELISA、双抗体夹心ELISA方法。目前市售的检测HSP70试剂盒主要是双抗夹心法检测，主要是美国的Stressgen公司的HSP70检测试剂盒，其基本上垄断了HSP70检测试剂盒的市场；目前Stressgen公司市售的检测HSP70的试剂盒一个检测盒中的96孔板的价格约10000元人民币约测定样品50个，每个样品检测费用约200元人民币。我国这方面的销售公司大部分是代理或者进口分装的，也有偶有自行研制的报道，但是其检测灵敏度低，检测范围窄，远没有达到生产检测的程度。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种检测灵敏度高、准确性强、高效的人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒。
本发明的技术方案概述如下 一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的固化HSP70单克隆抗体的酶标板和设在盒体内的物质，盒体内的物质包括HIS-HSP70蛋白标准品、生物素标记的HSP70多克隆抗体、样品稀释液、洗涤缓冲液、抗体稀释液、辣根酶标记亲和素、辣根酶标记亲和素稀释液、底物显色液A液、底物显示液B液和终止液； 所述HIS-HSP70蛋白标准品是用下述方法制成 先设计上游引物5‘CGGAATTCATGGCCAAGAAAACAGCG 3’，下游引物5‘CCCAAGCTTCTAATCCACCTCCTCGAT 3’，PCR扩增，双酶切连入PET-32a载体中，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，纯化，SDS胶鉴定纯度，透析后冷冻干燥，即制成HIS-HSP70蛋白标准品，分装，-70℃冻存； 所述生物素标记的HSP70多克隆抗体是用下述方法制成 (1)制备HSP70多克隆抗体选用健康雌性家兔为免疫动物，用2mg/ml的所述HIS-HSP70蛋白作为免疫抗原，4℃保存；进行免疫注射程序，将0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐剂，充分混合，在兔子背部皮下多点注射，每点0.2ml，下肢腹股沟0.2ml；一个月后，将0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐剂，充分混合，在兔子背部皮下多点注射，每点0.2ml，下肢腹股沟0.2ml；再一个月后，用0.5ml免疫抗原耳静脉注射；再7-10天后，颈动脉全采血，分离血清，加入质量百分浓度为0.8-1.2％的硫柳汞水溶液，-70℃下保存，得HSP70多克隆抗体血清；采用硫酸铵沉淀法纯化HSP70多克隆抗体血清； (2)对HSP70多克隆抗体进行生物素标记 1)制备生物素N-羟基丁二酰亚胺酯取生物素1g混悬于10-18ml N，N-二甲基甲酰胺，加入0.4-0.8gN-羟基丁二酰亚胺和0.6-1.0g二环己基碳二亚胺，置于密闭容器内，室温下磁力搅拌作用8-12小时，过滤，滤液经旋转蒸干，加8-12mL乙醚洗涤，继加160-220ml异丙醇使其重结晶，获得白色粉末状晶体，-30℃分装冻存； 2)生物素与HSP70多克隆抗体藕联 ①取所述生物素N-羟基丁二酰亚胺酯粉末，以二甲亚砜制备成1-2mg/ml溶液，备用； ②将纯化的HSP70多克隆抗体以0.1mol/L pH9.0的NaHCO3配成2-4mg/ml溶液； ③将步骤①与步骤②制备的溶液按体积比为1∶4-8混合，20-30℃搅拌3.5-5.5h； ④4℃条件下使上述混合液体以0.05mol/L，pH7.2 PBS透析8-12小时，加等体积甘油，-20℃分装存放； 所述固化HSP70单克隆抗体的酶标板是用下述方法制成 用2mg/ml的所述HIS-HSP70蛋白作为免疫抗原，选用18-20g的Balb/c雌鼠作为免疫动物，并取其脾细胞与SP2/0细胞融合，ELISA筛选、亚类鉴定、腹水制备，纯化单克隆抗体，将纯化的单克隆抗体包被酶标板，4℃保存。
所述样品稀释液的组成为每100ml含有NaCl 0.5g，KCl 0.0125g，KH2PO4 0.0125g，Na2HPO4 0.181g，余量为水。
所述洗涤缓冲液的组成为每100ml含有NaCl 5g，KCl 0.125g，KH2PO4 0.125g，Na2HPO41.81g，吐温-20 20ul，余量为水。
所述抗体稀释液的组成为每5ml含有小牛血清500ul，质量百分浓度为1％硫柳汞水溶液100ul，100mM的铁氰化钾50ul，吐温-20 2.5ul，10mg/ml的庆大霉素25ul，余量为pH7.4的0.01M的PBS。
所述辣根酶标记亲和素稀释液的组成为每5ml含有NaCl 0.025g，KCl 0.00125g，KH2PO4 0.00125g，Na2HPO4 0.009g，余量为水。
所述底物显色液A液的组成为每20ml含有醋酸钠0.544g，柠檬酸0.064g，体积百分浓度为30％的H2O2 12ul，余量为水。
所述底物显色液B液的组成为每20ml含有EDTA-Na 0.008g，柠檬酸0.038g，丙三醇2ml，四甲基联苯胺0.008g，余量为水，避光保存。
所述终止液的组成为每20ml含有浓H2SO4 1.15ml，余量为水。
本发明的优点是检测灵敏度高，准确性强、成本低，可以同时检测人、大鼠、小鼠细胞裂解液、组织提取液、血浆和血清中的HSP70蛋白。
随着研究的深入，HSP70可能会作为疾病的预警分子标记物和疾病预防的药物靶标，本试剂盒将会更多的应用于临床检测，试剂盒将有更大的应用前景。
图1生物素标记的多克隆抗体制备流程； 图2包被单克隆抗体的酶标板制备流程； 图3标准品阳性对照HSP70蛋白纯化图； 图4HSP70检测试剂盒检测灵敏度和检测范围曲线。
具体实施例方式 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1 一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的固化HSP70单克隆抗体的酶标板和设在盒体内的物质，盒体内的物质包括HIS-HSP70蛋白标准品、生物素标记的HSP70多克隆抗体、样品稀释液、洗涤缓冲液、抗体稀释液、辣根酶标记亲和素、辣根酶标记亲和素稀释液、底物显色液A液、底物显示液B液和终止液。
实施例2 HIS-HSP70蛋白标准品是用下述方法制成 1.)先设计PCR扩增引物 上游5‘CGGAATTCATGGCCAAGAAAACAGCG 3’ 下游5‘CCCAAGCTTCTAATCCACCTCCTCGAT 3’ PCR扩增，扩增条件是 95℃4min；95℃30s 56℃ 60s 72℃60s(30cycle)；72℃10min 经EcoR I和HinDIII双酶切后连入质粒PET-32a 2.)重组质粒转化大肠杆菌BL21 37℃振摇，OD值0.5时加入IPTG 1.0ul/ml，诱导4h，超声破碎，离心收集上清。
3.)将收集的上清液按法玛西亚公司的HISTrap纯化试剂盒操作说明进行纯化。经过摸索最佳的纯化条件为1ml纯化柱，柱平衡液平衡6ml——上样(1ml上清液，流速0.5ml/ml)——柱洗涤液洗涤8ml——20mmol/L咪磋洗脱液洗脱8ml——300mmol/L咪磋洗脱液洗脱——收集2-4ml洗脱液。
4.)将收集到的洗脱液取100ul SDS胶鉴定纯度，其余装入透析袋中，PBS液中透析过夜，其间换液三次。
5.)将透析袋中的液体分装入冷冻干燥管中，每管中总蛋白量为1mg，冷冻干燥成粉末状，放入-70℃备用。
本发明所述的重组HSP70蛋白纯度及含量检测分别采用SDS胶鉴定和考马斯亮蓝染色法。具体方法为 1.SDS胶鉴定重组HSP70蛋白纯度 将纯化时300mmol/L咪磋洗脱液取80ul，加5×上样缓冲液20，100℃变性5min，10000g离心，取上清10ul上样，10％SDS胶，80v，10min，180v，45min；考染脱色，胶图分析。结果重组HSP70蛋白纯度≥95％，如图3所示，箭头所示HSP70蛋白。
图3为标准品阳性对照HSP70蛋白纯化图，其中泳道1为正常菌，2为诱导菌，3-7为分部纯化的HSP70，箭头所示HSP70蛋白。
2.蛋白浓度测定采用的考马斯亮蓝染色法是本领域技术人员公知技术。
试剂盒中HIS-HSP70蛋白标准品是阳性对照，分装成100ug/管，-20℃保存，使用时可用1ml PBS或蒸馏水溶解、稀释即可使用。
实施例3 生物素标记标的HSP70蛋白多克隆抗体是用下述方法制成 (1)制备HSP70蛋白多克隆抗体 选用2kg以上的健康雌性家兔作为免疫动物，用2mg/ml的实施例2制备的HIS-HSP70蛋白为免疫抗原，-4℃保存；然后进行免疫注射程序，将0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐剂，充分混合，在兔子背部皮下多点注射，每点0.2ml，下肢腹股沟0.2ml； 一个月后，将0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐剂，充分混合，在兔子背部皮下多点注射，每点0.2ml，下肢腹股沟0.2ml； 一个月后，用0.5ml免疫抗原耳静脉注射； 7-10天后，颈动脉全采血，分离血清，加入质量百分浓度为1％硫柳汞水溶液(也可以选用0.8％或1.2％的硫柳汞水溶液，成为新的实施例)，-70℃保存，获得HSP70多克隆抗体血清35ml； 对所采集的HSP70多克隆抗体血清进行纯化采用的是硫酸铵沉淀法，具体的方法为 1.)取血清10ml，置磁力搅拌器上搅拌，室温下加入30ml醋酸钠(60mmol/L，pH4.0)，用0.1mmol/LNaOH调pH值至4.5(也可以是4.2或4.8)； 2.)缓慢滴加辛酸至终浓度100ul/ml，继续搅拌30min； 3.)10000g离心30min，弃沉淀，滤纸过滤，加入1/10体积的10×PBS，调pH值到7.4； 4.)缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至45％饱和度，混匀后4℃过夜； 5.)3000g离心30min，用0.01mol/L PBS(pH7.4)重悬，并用透析袋透析； 6.)抗体定量如前述考马斯亮蓝定量方法，获得的抗体浓度为26mg/ml，-70℃保存， 对所采集的HSP70多克隆抗体进行检测分析，将HSP70多克隆抗体纯液倍比稀释为1∶10 1∶20 1∶40......1∶256000以间接ELISA法测定抗体效价。结果纯化后的多克隆抗体的效价为1∶128000，获得纯化的多克隆抗体5ml； (2)对纯化后的HSP70多克隆抗体进行生物素标记 1.)生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(biotinyl-N-hydroxy-succinnimide，BNHS)的制备 取生物素1g混悬于12ml(也可以选用10ml或8ml)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，加人0.6g(也可以选用0.4g或0.8g)N-羟基丁二酰亚胺和0.8g(也可以选用0.6g或1.0g)二环己基碳二亚胺，置于密闭容器内，室温下磁力搅拌作用10小时，(也可以选用8小时或12小时)，过滤，滤液经旋转蒸干，加10ml(也可以选用8ml或12ml)乙醚洗涤，继加200ml(也可以选用160ml或220ml)异丙醇使其重结晶，获得白色粉末状晶体。-30℃分装冻存； 2.)生物素与抗体藕联 (1)取BNHS粉末，以二甲亚砜(DMSO)制备成1mg/ml(也可以选用2mg/ml)溶液，备用； (2)将纯化的HSP70多克隆抗体以0.1mol/L pH9.0的NaHCO3配成2mg/ml(也可以选用3mg/ml、4mg/ml)溶液； (3)将步骤(1)与步骤(2)制备的溶液按体积比为1∶8(也可以选用1∶4或1∶6)混合，室温搅拌4h(也可以选有20℃搅拌5.5h或30℃搅拌3.5h)； (4)4℃条件下使上述混合液体以0.05mol/L，pH7.2 PBS透析过夜，加等体积甘油，-20℃分装存放。
将标记生物素的HSP70多克隆抗体稀释成1mg/ml，备用。将纯化的HSP70蛋白稀释成1mg/ml，0.1mg/ml，0.01mg/ml，0.001mg/ml，0.0001mg/ml，0.00001mg/ml，0.000001mg/ml，以间接ELISA方法测定生物素标记的HSP70多克隆抗体灵敏度。结果经过纯化、生物素标记后，得到抗体3ml，最低检出度(检测灵敏度)达到0.01-0.001ng。
在组装本发明的试剂盒时，将生物素标记的HSP70多克隆抗体溶液加0.1％叠氮钠，无菌分装后，密封、冷贮(-70℃)、备用。在使用时可保存在4℃，不宜反复动融，有效期1年。每个试剂盒50ul，使用时用PBS或蒸馏水1∶2000稀释。
实施例4 固化HSP70单克隆抗体的酶标板的制备 用2mg/ml的所述HIS-HSP70蛋白作为免疫抗原，选用18-20g的Balb/c雌鼠作为免疫动物，并取其脾细胞与SP2/0细胞融合，ELISA筛选、然后对单克隆抗体亚类鉴定，腹水制备，纯化单克隆抗体，对所得的单克隆抗体进行分析，筛选出一个可以识别人、大鼠、小鼠天然HSP70蛋白的广谱单克隆抗体细胞株，间接ELISA测定抗体效价为1∶20000。
对所得的单克隆抗体进行酶标板抗体包被，具体步骤为 (1)取筛选到并纯化的单克隆抗体浓缩液，用包被缓冲液稀释成1mg/ml，4℃保存，备用。
(2)将上述液体包被酶标板，每孔加液体100ul，4℃过夜。
(3)洗板三次，拍干；每孔加150ul 10％胎牛血清封闭液，4℃封闭过夜。
(4)洗板三次，拍干，4℃存放，备用。
对所得到的包被有单克隆抗体的酶标板进行分析，将纯化的HSP70蛋白稀释成1mg/ml，0.1mg/ml，0.01mg/ml，0.001mg/ml，0.0001mg/ml，0.00001mg/ml，0.000001mg/ml，以间接ELISA方法测定酶标板的灵敏度。结果经过抗体纯化、包被后，得到酶标板，最低检出度(检测灵敏度)达到0.1-0.01ng。
在组装本发明所述的试剂盒时，酶标板一块(96孔，包被HSP70单克隆抗体)，4℃保存，不宜反复冻融，有效期一年。
实施例5 试剂盒中其他主要材料和药品，4℃保存。
(1)样品稀释液每100ml含有NaCl 0.5g，KCl 0.0125g，KH2PO4 0.0125g，Na2HPO40.181g，余量为水； (2)洗涤缓冲液每100ml含有NaCl 5g，KCl 0.125g，KH2PO4 0.125g，Na2HPO4 1.81g，吐温-20 20ul，余量为水； (3)抗体稀释液每5ml含有小牛血清500ul，质量百分比为的1％硫柳汞100ul，100mM的铁氰化钾50ul，吐温-20 2.5ul，10mg/ml的庆大霉素25ul，余量为pH7.4的0.01M的PBS； (4)辣根酶标记亲和素为HRP-avidin，分装，4℃保存，备用。每个试剂盒，5ul， 使用时用PBS或蒸馏水按1∶1000-2000稀释，可由Sigma购买。
(5)辣根酶标记亲和素稀释液每5ml含有NaCl 0.025g，KCl 0.00125g，KH2PO40.00125g，Na2HPO4 0.009g，余量为水； (6)底物显色液A液每20ml含有醋酸钠0.544g，柠檬酸0.064g，体积百分浓度为30％的H2O2 12ul，余量为水； (7)底物显色液B液每20ml含有EDTA-Na 0.008g，柠檬酸0.038g，丙三醇2ml，四甲基联苯胺0.008g，余量为水，避光保存； (8)终止液每20ml含有H2SO4 1.15ml，余量为水， 本发明试剂盒可以根据检测单位的实际需要，每个试剂盒组装成可以检测大样本的抗体及药品试剂量。
本发明的人、大鼠、小鼠HSP70检测试剂盒是在现有的ELISA方法上，采用双抗夹心法检测HSP70，并且能够同时检测人、大鼠、小鼠的HSP70，检测的灵敏度高，检测灵敏度可达到195pg/ml，检测范围是390pg～50000pg/ml，比StressGen公司的检测试剂盒要高5-10倍，试剂成本便宜，易于实现批量化生产，每个样品的检测费用约为40元人民币左右，远远低于国外的同类产品，对于研究HSP70的功能作用有很大帮助。
实施例6 本发明进行HSP70双抗夹心法检测，具体方法如下 1.将标准品阳性对照用1ml样品稀释液稀释成10ug/ml，进一步稀释成50 12.5 3.1250.78 0.195ng/ml。
2.加样分别设空白孔、5个标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，37℃，120分钟。
2.弃去液体，拍干，不用洗涤。
3.每孔加多克隆抗体溶液(生物素标记)100ul，37℃，60分钟。洗涤缓冲液洗板3次，350ul/每孔/次，拍干。
4.每孔加HRP-avidin 100ul，37℃，60分钟，洗板5次，拍干。
5.依序每孔加底物显色液AB各90ul，37℃避光显色30分钟。
依序每孔加终止溶液90ul，终止反应。用酶标仪在450nm波长读数(OD值)。
实施例7 本实施例的目的确定本试剂盒检测的检测范围和灵敏度。
材料本检测试剂盒。
方法取阳性对照标准品与PBS配成1ug/ml，倍比稀释成10个管，按实施例6中的方法进行，双复孔测定。
结果如图4所示，本试剂盒检测HSP70的灵敏度195pg/ml，检测范围是390pg～50000pg/ml 实施例8 本实施例的目的确定阴阳性判别、准确性比较。
每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2N H2SO4，测量时先用此孔调OD值至零；待测样品OD值与阴性对照OD值之比大于等于2.1时，待测样品为阳性，否则为阴性。为防止样品蒸发，实验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。
洗板方法手工洗板方法吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。自动洗板如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标轴上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
实施例9 本实施例的目的在于测定HSP70 EIISA检测试剂盒的稳定性，通过试剂盒内部和组间的变异度判定，确定试剂盒的稳定性，具体方法如下 1.HSP70 ELISA试剂盒内部变异系数确定方法三个已知浓度样品(5ng，12ng，25ng)在一块HSP70免疫反应板上各单独测定20次。变异系数计算方法 CV＝批内标准差S/平均值×100％ 结果变异系数的值CV＝8.2％＜10％。
2.HSP70 ELISA试剂盒反应之间变异系数确定方法三个已知浓度的样品由四个研究人员单独各测定20次。试剂盒反应之间的变异系数CV＝批间标准差S/批间平均值×100％CV＝7.6％＜10％。
结果通过两组的CV值，本试剂盒具有良好的稳定性。
实施例10 本实施例目的是确定本试剂盒检测HSP70种属特异性。
本实施例所述的HSP70双抗夹心法检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板(单克隆抗体包被)和盒体内的物质，盒体内的物质包括HIS-HSP70蛋白标准品、生物素标记的HSP70多克隆抗体、样品稀释液、洗涤缓冲液、抗体稀释液、辣根酶标记亲和素、辣根酶标记亲和素稀释液、底物显色液A液、底物显示液B液和终止液，所述的多克隆抗体和单克隆抗体分别由2mg/ml重组HSP70作为免疫抗原，免疫兔子和小鼠制备而成。
实施例11 本试剂盒中的单克隆抗体制备过程中，我们筛选出了一株广谱的单克隆抗体细胞株，间接ELISA法确定其可以识别人、大鼠、小鼠天然的HSP70蛋白，我们进一步研究本试剂盒特异性检测人、大鼠、小鼠HSP70蛋白。具体方法为 材料HSP70 EIISA试剂盒；人血清(1∶10)，血浆(1∶10)，细胞提取液(原液)，组织提取液(原液) 方法 1.将标准品阳性对照用1ml样品稀释液稀释成10ug/ml，进一步稀释成50 12.5 3.1250.78 0.195ng/ml。
2.加样分别设空白孔、5个标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，37℃，120分钟。
2.弃去液体，拍干，不用洗涤。
3.每孔加多克隆抗体溶液(生物素标记)100ul，37℃，60分钟。洗涤缓冲液洗板3次，350ul/每孔/次，拍干。
4.每孔加HRP-avidin 100ul，37℃，60分钟，洗板5次，拍干。
5.依序每孔加底物显色液AB各90ul，37℃避光显色30分钟。
依序每孔加终止溶液90ul，终止反应。用酶标仪在450nm波长读数(OD值)。仪器酶标仪、洗板机等 结果 本试剂盒可以检测人不同体液中天然HSP70蛋白。
实施例12 方法同实施例11中的方法，不同的是材料是大鼠的血清(1∶10)，血浆(1∶10)，细胞提取液(原液)，组织提取液(原液) 仪器酶标仪、洗板机等 结果 本试剂盒可以检测大鼠不同体液中天然HSP70蛋白。
实施例13 方法同实施例11中的方法，不同的是材料是小鼠的血清(1∶10)，血浆(1∶10)，细胞提取液(原液)，组织提取液(原液) 仪器酶标仪、洗板机等 结果 本试剂盒可以检测小鼠不同体液中天然HSP70蛋白。
本ELISA试剂盒能够特异性的检测重组；其他的种属包括猴子、仓鼠、猪、牛、羊和狗的Hsp70没有进行检测。
实施例14 HSP70 ELISA试剂盒检测操作说明书 热休克蛋白70(HSP70)ELISA 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 应用 双抗夹心ELISA法定量测定人、大鼠、小鼠细胞裂解液、组织提取液、血浆和血清中HSP70含量。
实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中HSP70水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入HSP70抗原、生物素化的抗大鼠HSP70抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HSP70呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，计算样品浓度。
试剂盒组成 1.酶标板一块(96孔)(包被单克隆抗体)。
2.标准品(冻干品，阳性对照)1瓶，临用前以样品稀释液稀释至1ml，其浓度为10000000pg/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成50000pg/mL，25000pg/mL，12500pg/mL，6250pg/mL，3125pg/mL，1562.5pg/mL，781.25pg/mL，390pg/mL，195pg/mL，样品稀释液直接作为标准浓度0pg/mL，临用前15分钟内配制。
3.生物素标记多克隆抗体1×50ul/管。
4.抗体稀释液5ml/瓶。
5.样品稀释液100ml/瓶。
6.酶标亲和素1×0.5ml/管。
7.酶标亲和素稀释液1×5ml/瓶。
8.洗涤缓冲液1×100ml/瓶。
9.显色液A1×20ml/瓶。
10.显色液B1×20ml/瓶。
11.终止液1×20ml/瓶。
标本的采集及保存 1.血清标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
2.血浆可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，或将标本放于-70℃保存，但应避免反复冻融。
3.组织提取液取新鲜组织或者液氮冻存组织加入提取液匀浆，离心1000g 10min提取蛋白，立即测定，或将标本放于-70℃保存，但应避免反复冻融。
4.细胞提取液1×PBS洗三次，加细胞裂解液刮取，4℃离心10000g 10min。取上清进行测定(适当增加细胞的浓度)。
注标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。检测样品视具体情况进行适当的稀释或者增加浓度测定。取上清时勿将沉淀吸入，影响检测结果。
操作步骤 1.将标准品阳性对照用1ml样品稀释液稀释成10ug/ml，进一步稀释成50 12.5 3.1250.78 0.195ng/ml。
2.加样分别设空白孔、5个标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，37℃，120分钟。
2.弃去液体，拍干，不用洗涤。
3.每孔加多克隆抗体溶液(生物素标记)100ul，37℃，60分钟。洗涤缓冲液洗板3次，350ul/每孔/次，拍干。
4.每孔加HRP-avidin 100ul，37℃，60分钟，洗板5次，拍干。
5.依序每孔加底物显色液AB各90ul，37℃避光显色30分钟。
依序每孔加终止溶液90ul，终止反应。用酶标仪在450nm波长读数(OD值)。
注 1.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
2.为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。
洗板方法 手工洗板方法吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
自动洗板如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性 本试剂盒可同时检测重组或天然的大鼠HSP70，亦可检测人、小鼠天然HSP70，且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标(普通坐标)，在坐标轴上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项 1.洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
2.一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
3.请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
4.如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
5.在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
6.底物请避光保存。
检测范围 390pg-50000pg/ml 说明 1.试剂盒保存-20℃(较长时间不用时)；2-8℃(频繁使用时)。
2.有效期6个月 3.浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
4.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
权利要求
1.一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的固化HSP70单克隆抗体的酶标板和设在盒体内的物质，盒体内的物质包括HIS-HSP70蛋白标准品、生物素标记的HSP70多克隆抗体、样品稀释液、洗涤缓冲液、抗体稀释液、辣根酶标记亲和素、辣根酶标记亲和素稀释液、底物显色液A液、底物显示液B液和终止液；
所述HIS-HSP70蛋白标准品是用下述方法制成
先设计上游引物5‘CGGAATTCATGGCCAAGAAAACAGCG 3’，下游引物5‘CCCAAGCTTCTAATCCACCTCCTCGAT 3’，PCR扩增，双酶切连入PET-32a载体中，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，纯化，SDS胶鉴定纯度，透析后冷冻干燥，即制成HIS-HSP70蛋白标准品，分装，-70℃冻存；
所述生物素标记的HSP70多克隆抗体是用下述方法制成
(1)制备HSP70多克隆抗体选用健康雌性家兔为免疫动物，用2mg/ml的所述HIS-HSP70蛋白作为免疫抗原，4℃保存；进行免疫注射程序，将0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐剂，充分混合，在兔子背部皮下多点注射，每点0.2ml，下肢腹股沟0.2ml；一个月后，将0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐剂，充分混合，在兔子背部皮下多点注射，每点0.2ml，下肢腹股沟0.2ml；再一个月后，用0.5ml免疫抗原耳静脉注射；再7-10天后，颈动脉全采血，分离血清，加入质量百分浓度为0.8-1.2％的硫柳汞水溶液，-70℃下保存，得HSP70多克隆抗体血清；采用硫酸铵沉淀法纯化HSP70多克隆抗体血清；
(2)对HSP70多克隆抗体进行生物素标记
1)制备生物素N-羟基丁二酰亚胺酯取生物素1g混悬于10-18ml N，N-二甲基甲酰胺，加入0.4-0.8gN-羟基丁二酰亚胺和0.6-1.0g二环己基碳二亚胺，置于密闭容器内，室温下磁力搅拌作用8-12小时，过滤，滤液经旋转蒸干，加8-12mL乙醚洗涤，继加160-220ml异丙醇使其重结晶，获得白色粉末状晶体，-30℃分装冻存；
2)生物素与HSP70多克隆抗体藕联
①取所述生物素N-羟基丁二酰亚胺酯粉末，以二甲亚砜制备成1-2mg/ml溶液，备用；
②将纯化的HSP70多克隆抗体以0.1mol/L pH9.00的NaHCO3配成2-4mg/ml溶液；
③将步骤①与步骤②制备的溶液按体积比为1∶4-8混合，20-30℃搅拌3.5-5.5h；
④4℃条件下使上述混合液体以0.05mol/L，pH7.2 PBS透析8-12小时，加等体积甘油，-20℃分装存放；
所述固化HSP70单克隆抗体的酶标板是用下述方法制成
用2mg/ml的所述HIS-HSP70蛋白作为免疫抗原，选用18-20g的Balb/c雌鼠作为免疫动物，并取其脾细胞与SP2/0细胞融合，ELISA筛选、亚类鉴定、腹水制备，纯化单克隆抗体，将纯化的单克隆抗体包被酶标板，4℃保存。
2.根据权利要求1所述的一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，其特征是所述样品稀释液的组成为每100ml含有NaCl0.5g，KCl0.0125g，KH2PO4 0.0125g，Na2HPO4 0.181g，余量为水。
3.根据权利要求1所述的一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，其特征是所述洗涤缓冲液的组成为每100ml含有NaCl 5g，KCl 0.125g，KH2PO4 0.125g，Na2HPO41.81g，吐温-20 20ul，余量为水。
4.根据权利要求1所述的一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，其特征是所述抗体稀释液的组成为每5ml含有小牛血清500ul，质量百分浓度为1％硫柳汞水溶液100ul，100mM的铁氰化钾50ul，吐温-20 2.5ul，10mg/ml的庆大霉素25ul，余量为pH7.4的0.01M的PBS。
5.根据权利要求1所述的一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，其特征是所述辣根酶标记亲和素稀释液的组成为每5ml含有NaCl 0.025g，KCl 0.00125g，KH2PO4 0.00125g，Na2HPO4 0.009g，余量为水。
6.根据权利要求1所述的一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，其特征是所述底物显色液A液的组成为每20ml含有醋酸钠0.544g，柠檬酸0.064g，体积百分浓度为30％的H2O2 12ul，余量为水。
7.根据权利要求1所述的一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，其特征是所述底物显色液B液的组成为每20ml含有EDTA-Na 0.008g，柠檬酸0.038g，丙三醇2ml，四甲基联苯胺0.008g，余量为水，避光保存。
8.根据权利要求1所述的一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，其特征是所述终止液的组成为每20ml含有浓H2SO4 1.15ml，余量为水。
全文摘要
本发明公开了一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的固化HSP70单克隆抗体的酶标板和设在盒体内的物质，盒体内的物质包括HIS-HSP70蛋白标准品、生物素标记的HSP70多克隆抗体、样品稀释液、洗涤缓冲液、抗体稀释液、辣根酶标记亲和素、辣根酶标记亲和素稀释液、底物显色液A液、底物显示液B液和终止液；本发明的优点是检测灵敏度高，准确性强、成本低，可以同时检测人、大鼠、小鼠细胞裂解液、组织提取液、血浆和血清中的HSP70蛋白。
文档编号G01N33/543GK101105498SQ20071005862
公开日2008年1月16日 申请日期2007年8月8日 优先权日2007年8月8日
发明者钱令嘉, 雪 冷, 锐 战 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所