本发明属于制备抑制肽技术领域，具体涉及一种混合酶解制备文蛤血管紧张素转化酶抑制肽的方法。
背景技术：
高血压是困扰当今的一种心血管疾病，可导致严重的并发症，对人类健康危害极大。血管紧张素转化酶（Angiotensin-converting enzyme，ACE）在机体血压调节过程中起重要作用，一方面ACE将无活性的血管紧张素Ⅰ转化为具有强烈收缩全身微动脉，使血压升高的血管紧张素Ⅱ；另一方面ACE能促进有降血压作用的缓激肽分解，引起血压升高。
食物蛋白源活性肽不仅能提供人体生长发育所需的营养，还具有调节血压、抗凝血、抗菌、免疫、抗氧化、降胆固醇、调节神经系统、降血脂、护肝等功能。
先有技术提供多种制备抑制肽的方法，例如，中国发明授权专利文献 一种利用海参制备ACE 抑制肽的方法 授权公告号 CN 102517364 B 该发明涉及一种利用海参制备ACE 抑制肽的方法，其是以包括鲜海参、或干海参、或水发参、或高压参在内的海参为原料，脱盐、软化处理，制浆后加水，加热灭除微生物，冷却后加入复合蛋白水解酶或风味蛋白水解酶中的一种进行酶解，灭酶，冷却后离心去除不溶物，上清液管滤，滤过液过3000Dalton 的有机膜截留分级，3000Dalton 以下的截留液通过纳滤，干燥，得ACE 抑制肽。其酶解技术方案实现了最佳优化，经管滤、超滤、纳滤进行分离提取技术，其提取的效率高，所得的ACE 抑制肽降压效果好。本发明的方法工艺合理、操作简便、可操作性强，易实现工业化生产。
文蛤是我国沿海常见的贝类，属于优质蛋白源。文蛤提取物具有抗氧化、调节血压、抗肿瘤和提高机体免疫作用等功效，是潜在的可开发降血压活性物质，目前，还未见有利用文蛤制备抑制肽的研究报道。
现有技术中利用海参提取的抑制肽的方法简单可操作性强，但其酶解效果和抑制肽的提取率有待提升。
技术实现要素：
本发明针对上述技术问题提供一种预处理时间短，抑制肽提取率优异、低失活，采用混合酶解而且酶解效果显著的一种混合酶解制备文蛤血管紧张素转化酶抑制肽的方法。
本发明针对上述技术问题所采取的方案为：一种混合酶解制备文蛤血管紧张素转化酶抑制肽的方法，制备步骤如下：
1）预处理：将文蛤去壳取肉，放入处理液中浸泡后洗净，匀浆，细化处理；将文蛤肉表面杂质和细菌去除，再进行匀浆及细化处理，便于酶解及提升酶解效果。
2）混合酶解：加入去离子水和盐酸溶液调节pH，加入文蛤1~3%重量份的α- 胰凝乳蛋白酶，酶解结束后进行灭酶，加入盐酸溶液调节pH，加入文蛤0.3~1.2%重量份的复合酶，灭酶；采用混合酶解，酶解效果优异，显著提升了文蛤蛋白酶解成抑制肽，充分酶解，避免了部分蛋白未被酶解的情况，还防止文蛤抑制肽的损失。
3）纳滤：将灭酶后的酶解液离心，取上清液，管膜过滤，纳滤，收集纳滤截留液；可很好的保存得到的文蛤抑制肽的完整结构和有效活性，保证文蛤抑制肽的功效。
4）冻干：将纳滤截留液进行冻干处理，得文蛤抑制肽，采用冻干保存可最大程度的避免抑制肽的活性成分产生变性或失去活力。
步骤2中复合酶由以下成分及重量份组成：碱性蛋白酶5~15份、中性蛋白酶8~12份、风味蛋白酶2~6份、嗜热菌蛋白酶2~4份和乳酸脱氢酶1~2份。在酶解过程中往往是一系列的复杂变化，一种酶只能催化一种反应，采用的复合酶可充分使文蛤蛋白酶解成抑制肽，提高抑制肽含量，避免了部分蛋白未被酶解的情况，而且酶解时间缩短，节约提取时间，采用的复合酶用量少，效果好，节约提取成本。
步骤1中将文蛤肉放入处理液浸泡1~2h后洗净，采用匀浆机进行匀浆后用胶体磨进一步细化处理。通过1~2h的浸泡，充分的将文蛤肉表面杂质溶解，及杀灭细菌，避免细菌和杂质对酶解的影响，浸泡的时间较短，但效果优异，可节省提取时间，加快提取速度。
步骤2中加入的去离子水是文蛤肉体积的3~5倍，使文蛤肉充分浸泡于去离子水内，为调节pH值作工艺准备。
步骤2中：调节pH至6~7,加入文蛤1~3%重量份的α- 胰凝乳蛋白酶，酶解结束后在90~95℃条件下沸水浴灭酶10~20min，加入盐酸溶液调节pH至7~8，加入文蛤0.3~1.2%重量份的复合酶，在90~95℃条件下沸水浴灭酶10~30min。以获得优异的酶解效果。
步骤1中处理液由以下成分及重量份组成：纳米银6~8份、纳米二氧化钛1.5~3份、二氧化硅0.5~1份、抗生素0.01~0.1份、碳酸二甲酯1~3份和氟化氢铵0.3~0.5份。可快速有效的清除文蛤肉的杂质和细菌，对文蛤肉无损伤，无毒，减少预处理时间，加快提取效率。
步骤3中将灭酶后的酶解液冷却至4℃，采用离心机进行离心，离心机转速为4000~6000r/min,离心时间为10~20min。有效保证获得的文蛤抑制肽的活性去除不容物质，获得高含量抑制肽的上清液。
盐酸溶液添加有氢氧化钠1~2重量份、十六烷基三甲基氯化铵0.04~0.08重量份和二甲基乙酰胺0.1~0.2重量份。快速调节pH值，对文蛤蛋白质无损伤，保证酶效果优异。
步骤3中取上清液采用管膜过滤脱除大分子，管膜滤过液通过孔径3000~6000Da的有机膜截留分级，收集截留液。可过滤掉大分子，获得纯度很高的抑制肽，不会损伤抑制肽的活性，提升抑制肽的提取率。
本发明相对于现有技术具有如下优点：
1)本发明所采用的原料为文蛤，产量高，价格低，获取方便，提高了文蛤的综合利用价值。
2）采用的混合酶解方式提高酶解液中的文蛤抑制肽含量，进而提高文蛤抑制肽的提取率，酶解充分，避免了部分蛋白未被酶解的情况，而且酶解时间缩短，用量减少，节约提取时间，效果优异，节约提取成本。
3）本发明制备的处理液可快速有效的清除文蛤肉的杂质和细菌，对文蛤肉无损伤，无毒，减少预处理时间，加快提取效率。
4）本发明使用的盐酸溶液可达到快速调节pH值效果，对文蛤肉浆无损伤，减少提取时间。
5）本发明提取的文蛤抑制肽可应用于食品业、制药业和饲料业。
6）本发明提供的制备方法预处理时间短，酶解效果优异，提取到的文蛤抑制肽含量和提取率高。
具体实施例
以下结合具体实施例作进一步详细描述：
实施例1：
一种混合酶解制备文蛤血管紧张素转化酶抑制肽的方法，制备步骤如下：
1）预处理：将文蛤去壳取肉，放入处理液中浸泡后洗净，匀浆，细化处理；将文蛤肉表面杂质和细菌去除，再进行匀浆及细化处理，便于酶解及提升酶解效果。
2）混合酶解：加入去离子水和盐酸溶液调节pH，加入文蛤1~3%重量份的α- 胰凝乳蛋白酶，酶解结束后进行灭酶，加入盐酸溶液调节pH，加入文蛤0.3~1.2%重量份的复合酶，灭酶；采用混合酶解，酶解效果优异，显著提升了文蛤蛋白酶解成抑制肽，充分酶解，避免了部分蛋白未被酶解的情况，还防止文蛤抑制肽的损失。
3）纳滤：将灭酶后的酶解液离心，取上清液，管膜过滤，纳滤，收集纳滤截留液；可很好的保存得到的文蛤抑制肽的完整结构和有效活性，保证文蛤抑制肽的功效。
4）冻干：将纳滤截留液进行冻干处理，得文蛤抑制肽，采用冻干保存可最大程度的避免抑制肽的活性成分产生变性或失去活力。
步骤2中复合酶由以下成分及重量份组成：碱性蛋白酶5~15份、中性蛋白酶8~12份、风味蛋白酶2~6份、嗜热菌蛋白酶2~4份和乳酸脱氢酶1~2份。在酶解过程中往往是一系列的复杂变化，一种酶只能催化一种反应，采用的复合酶可充分使文蛤蛋白酶解成抑制肽，提高抑制肽含量，避免了部分蛋白未被酶解的情况，而且酶解时间缩短，节约提取时间，采用的复合酶用量少，效果好，节约提取成本。
步骤1中将文蛤肉放入处理液浸泡1~2h后洗净，采用匀浆机进行匀浆后用胶体磨进一步细化处理。通过1~2h的浸泡，充分的将文蛤肉表面杂质溶解，及杀灭细菌，避免细菌和杂质对酶解的影响，浸泡的时间较短，但效果优异，可节省提取时间，加快提取速度。
步骤2中加入的去离子水是文蛤肉体积的3~5倍，使文蛤肉充分浸泡于去离子水内，为调节pH值作工艺准备。
步骤2中：调节pH至6~7,加入文蛤1~3%重量份的α- 胰凝乳蛋白酶，酶解结束后在90~95℃条件下沸水浴灭酶10~20min，加入盐酸溶液调节pH至7~8，加入文蛤0.3~1.2%重量份的复合酶，在90~95℃条件下沸水浴灭酶10~30min。以获得优异的酶解效果。
步骤1中处理液由以下成分及重量份组成：纳米银6~8份、纳米二氧化钛1.5~3份、二氧化硅0.5~1份、抗生素0.01~0.1份、碳酸二甲酯1~3份和氟化氢铵0.3~0.5份。可快速有效的清除文蛤肉的杂质和细菌，对文蛤肉无损伤，无毒，减少预处理时间，加快提取效率。
步骤3中将灭酶后的酶解液冷却至4℃，采用离心机进行离心，离心机转速为4000~6000r/min,离心时间为10~20min。有效保证获得的文蛤抑制肽的活性去除不容物质，获得高含量抑制肽的上清液。
盐酸溶液添加有氢氧化钠1~2重量份、十六烷基三甲基氯化铵0.04~0.08重量份和二甲基乙酰胺0.1~0.2重量份。快速调节pH值，对文蛤蛋白质无损伤，保证酶效果优异。
步骤3中取上清液采用管膜过滤脱除大分子，管膜滤过液通过孔径3000~6000Da的有机膜截留分级，收集截留液。可过滤掉大分子，获得纯度很高的抑制肽，不会损伤抑制肽的活性，提升抑制肽的提取率。
实施例2：
一种混合酶解制备文蛤血管紧张素转化酶抑制肽的方法，优选制备步骤如下：
1）预处理：将文蛤去壳取肉，放入处理液中优选浸泡1h后洗净，采用匀浆机进行匀浆后用胶体磨进一步细化处理。通过优选的1h的浸泡，充分的将文蛤肉表面杂质溶解，及杀灭细菌，避免细菌和杂质对酶解的影响，浸泡的时间较短，但效果优异，可节省提取时间，加快提取速度。
2）混合酶解：加入去离子水和盐酸溶液调节优选pH至6.5,加入优选文蛤1.5%重量份的α- 胰凝乳蛋白酶，酶解结束后优选在93℃条件下沸水浴灭酶优选10min，加入盐酸溶液调节优选pH至8，加入优选文蛤0.5%重量份的复合酶，在优选92℃条件下沸水浴灭酶优选15min。加入的去离子水是文蛤肉体积优选的5倍，使文蛤肉充分浸泡于去离子水内，为调节pH值作工艺准备。采用混合酶解，酶解效果优异，显著提升了文蛤蛋白酶解成抑制肽，充分酶解，避免了部分蛋白未被酶解的情况，还防止文蛤抑制肽的损失。
3）纳滤：将灭酶后的酶解液冷却至4℃，采用离心机进行离心，离心机转速优选为5000r/min,离心时间优选为15min，取上清液，用管膜过滤脱除大分子，管膜滤过液通过孔径优选5000Da的有机膜截留分级，收集截留液，可过滤掉大分子，获得纯度很高的抑制肽，不会损伤抑制肽的活性，提升抑制肽的提取率。纳滤，收集纳滤截留液；可很好的保存得到的文蛤抑制肽的完整结构和有效活性，保证文蛤抑制肽的功效。
4）冻干：将纳滤截留液进行冻干处理，得文蛤抑制肽，采用冻干保存可最大程度的避免抑制肽的活性成分产生变性或失去活力。
步骤2中复合酶由以下成分及重量份组成：优选碱性蛋白酶10份、优选中性蛋白酶10份、优选风味蛋白酶3份、优选嗜热菌蛋白酶2份和优选乳酸脱氢酶1份。在酶解过程中往往是一系列的复杂变化，一种酶只能催化一种反应，采用的复合酶可充分使文蛤蛋白酶解成抑制肽，提高抑制肽含量，避免了部分蛋白未被酶解的情况，而且酶解时间缩短，节约提取时间，采用的复合酶用量少，效果好，节约提取成本。
步骤1中处理液由以下成分及重量份组成：优选纳米银7份、优选纳米二氧化钛2份、优选二氧化硅0.7份、优选抗生素0.06份、优选碳酸二甲酯2份和优选氟化氢铵0.4份。可快速有效的清除文蛤肉的杂质和细菌，对文蛤肉无损伤，无毒，减少预处理时间，加快提取效率。
盐酸溶液添加有优选的氢氧化钠1重量份、优选的十六烷基三甲基氯化铵0.05重量份、优选的二甲基乙酰胺0.15重量份、乙酰葡糖胺0.01~0.2份（优选0.01份）。快速调节pH值，对文蛤蛋白质无损伤，失活低，保证酶效果优异。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。