一种黄曲霉毒素的快速筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速筛选黄曲霉毒素的检验法，该方法用胶体金标记抗黄曲霉毒素B1(AFB1)单克隆抗体作为分析探针，AFB1完全抗原AFB1-O-BSA偶联物作为竞争抗原，以羊抗鼠抗体作为控制抗体,进行AFB1的检测分析。利用胶体金产生的信号颜色深浅，进行定性或半定量检测。该检测方法特异性强,灵敏度高于市销的同类产品，可用于食品中、农产品中黄曲霉毒素的快速检测，对今后免疫分析方法和生物传感器的研究起到一定的作用。
【专利说明】一种黄曲霉毒素的快速筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种化妆品中成分的测定方法，尤其是一种食品、农产品中黄曲霉毒素的快速筛选方法。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素(AFT)是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉(aspergillus flavus))寄生曲霉(a.parasiticus))产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。
[0003]人类健康受黄曲霉毒素的危害主要是由于人们食用被黄曲霉毒素污染的食物。对于这一污染的预防是非常困难的其原因是由于真菌在食物或食品原料中的存在是很普遍的。国家卫生部门禁止企业使用被严重污染的粮食进行食品加工生产，并制定相关的标准监督企业执行.但对于含黄曲霉毒素浓度较低的粮食和食品无法进行控制。在发展中国家食用被黄曲霉毒素污染的食物与癌症的发病率呈正相关性.亚洲和非洲的疾病研究机构的研究工作表明，食物中黄曲霉毒素与肝细胞癌变(Liver Cell Cancer，LCC)呈正相关性。长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致肝癌胃癌，肠癌等疾病的主要原因。1988 年国际肿瘤研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)将黄曲霉毒素B1列为人类致癌物。除此以外黄曲霉毒素与其它致病因素(如肝炎病毒)等对人类疾病的诱发具有叠加效应。
[0004]为了降低AFB1对人类的危害，世界各国不断制定尽可能低的食品中AFB1的限量标准，通过检验机构进行监测。高灵敏的仪器分析方法和快速有效的免疫分析方法正逐渐被应用于AFB1的检测。目前测定AFB1的主要方法12?32是薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)。薄膜层析法和液相色谱法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法。但由于其检测周期长，程序复杂所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求.随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学生物化学，分子生物学的不断发展人们已创建了不少快速，简便特异，敏感低耗且适用的黄曲霉毒素检测方法。而且以金标试纸为代表的这些方法已经被先进国家所广泛使用，引进和消化这些先进的方法是我们检测领域的当务之急。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是，提供一种食品、农产品黄曲霉毒素的快速筛选方法，以解决现有技术上存在的效率低、操作强度大、分析成本高的不足之处。免疫亲和柱法优点很多但由于检测费用过高，而无法普及。
[0006]解决上述问题的的技术构思是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法。由此产生的一步式黄曲霉毒素快速检测试纸可在5-10分钟完成对样品中黄曲霉毒素的定性测定.借助黄曲霉毒素标准样品这种方法能估算黄曲霉毒素的含量，非常适用于现场测试和进行大量样品的初选。[0007]本发明的目的是这样实现的，验证了一种快速筛选黄曲霉毒素的方法，黄曲霉毒素快速检测试纸，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维膜和样品吸收垫，其特征在于:所述背板上依次连续粘附有样品吸收垫、硝酸纤维膜、金标垫、样品垫；所述样品垫靠金标垫一端搭接在金标垫上；所述样品吸收垫上表面吸附有手控区封膜，是在背衬另一端吸水区粘贴吸水纸所述样品垫上表面吸附有样品端封膜；所述硝酸纤维膜上包有喷涂浓度为lmg/mL黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白作检测线，喷涂2mg/mL羊抗鼠IgG作质控线，1%牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜；所述金标垫是粘贴在背衬一端的注样区的，将胶体金-抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合物原液2mL，加稀释液稀释成已选最佳浓度14mL，混均配成工作浓度，放入10mm玻璃纤维素膜，浸泡l0-20min，37°C烘干得到的，保存条件为4°C~8°C。
[0008]由于采用上述结构，本发明之一种食品、农产品中黄曲霉毒素的筛选检验法与现有技术相比，具有以下有益效果:
本发明用胶体金标记抗黄曲霉毒素B1 (AFB1)单克隆抗体作为分析探针，AFB1完全抗原AFBl-O-BSA偶联物作为竞争抗原，以羊抗鼠抗体作为控制抗体，进行AFB1的检测分析，利用胶体金产生的信号颜色深浅，进行检测。该检测方法特异性强，灵敏度高于市销的同类产品，分析效率高，可操作性强，大大降低了分析成本，方法简单，本发明的筛选检验法简单，无复杂步骤，易于推广应用。
[0009]下面，结合实施例对本发明之一种食品、农产品中筛选检验法的技术特征作进一步的说明。
[0010]1、试纸条的制备
试纸条由样品垫、金标垫、硝酸纤维膜和样品吸收垫四部分组成。将胶体金-抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合物原液2mL，加稀释液稀释成已选最佳浓度14mL，混均配成工作浓度；放入10mm玻璃纤维素膜，浸泡l(T20min，37°C烘干，4°C~8°C保存备用，粘贴在背衬一端的注样区作为金标垫。在背衬中间检测区粘贴硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上喷涂浓度为lmg/mL黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白作检测线，喷涂2mg/mL羊抗鼠IgG作质控线，再用1%牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜。在背衬另一端吸水区粘贴吸水纸作为样品吸收垫。
[0011]2、样品处理
称取5.0g大米样品(已粉碎)于IOOmL具塞三角瓶中，准确加入25.0mL甲醇水(1+1)溶液，振摇15min过滤，弃去1/4初滤液，收集样品滤液。用PBS溶液稀释样品滤液，使最终样品待测液中的甲醇含量为10%~15%。
[0012]3、操作步骤
取样品滤液100L缓慢滴加于试纸条的玻璃纤维素膜上，15min后观察试纸条上检测线、质控线的显色情况。根据试纸条的检测原理来限量判定样品提取液中AFB1的含量:若只有一条红色色带出现则判定样液为阳性(大于限值)；若出现两条红色色带则判定样液为阴性(小于限值)；若无色带出现则该试纸条失效。
[0013]4黄曲霉毒素的快速筛选检验的验证试验 4.1最低检出限实验
配制AFB1标准工作浓度:0，0.05，0.1，0.5，1.0，2.5,5.0(ng/mL)，分别用试纸条检测，观察各个浓度的显色情况。根据检测原理最先出现阳性反应的即为最低检出限。通过对AFB1标准溶液的测定，观察试纸条对标准浓度的抑制情况来确定最低检测浓度。检测AFBi标准溶液(缓冲液体系为甲醇/PbS，1:9溶液)的免疫层析试纸条的目测结果。从目测结果分析，最低检出限为2.5ng/mL。
[0014]4.2重复性实验
配制AFB1三个标准工作浓度:0，2.5，5.0 (ng/mL)，每个浓度分别用7条试纸条检测，观察各个浓度的显色情况。实验现象为测定O ng/mL标液的7条试纸条显色正常，均出现两条红色色带，判为阴性；测定2.5,5.0ng/mL标液的14条试纸条显色正常，均只出现一条红色色带，判为阳性。结果表明该方法研制的试纸条的重复性相当好。
[0015]4.3定性实验
将试纸条放入37°C环境下进行加速破坏性实验，每隔24h (37°C下24h相当于4°C下45天)进行一次测定，检测AFB1标准溶液0、2.5ng/mL,观察试纸条显色有无异常,确定试剂条的稳定周期。实验结果:该试纸条在37°C环境下能稳定7天以上，因此推算该试剂条在4°C条件下可稳定10个月以上。
[0016]4.3交叉反应实验
选择两种AFB1的类似毒素:AFB2、AFG2进行交叉反应试验。将这两种毒素配制成各个标准工作浓度:10、20、35、40、60、80、100、200、500 (ng/mL)，用试纸条分别去检测，观察显色情况并计算它们的交叉反应率CR%(最先出现阳性反应的竞争物的浓度/AFB1的最低检出限的浓度)。抗AFB1单克隆抗体与结构类似物交叉反应情况见表1。
[0017]表1抗AFBl单克隆抗体与结构类似物交叉反应情况
【权利要求】
1.一种食品、农产品中黄曲霉毒素的快速筛选方法，其特征在于，使用了黄曲霉毒素快速检测试纸。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素快速检测试纸包括样品垫、金标垫、硝酸纤维膜和样品吸收垫，其特征在于:所述背板上依次连续粘附有样品吸收垫、硝酸纤维膜、金标垫、样品垫；所述样品垫靠金标垫一端搭接在金标垫上；所述样品吸收垫上表面吸附有手控区封膜，是在背衬另一端吸水区粘贴吸水纸所述样品垫上表面吸附有样品端封膜；所述硝酸纤维膜上包有喷涂浓度为lmg/mL黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白作检测线，喷涂2mg/mL羊抗鼠IgG作质控线，1%牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜；所述金标垫是粘贴在背衬一端的注样区的，将胶体金-抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合物原液2mL，加稀释液稀释成已选最佳浓度14mL，混均配成工作浓度，放入IOmm玻璃纤维素膜，浸泡l(T20min，37°C烘干得到的，保存条件为4°C、°C。
【文档编号】G01N33/558GK103675270SQ201310624253
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】郭狄 申请人:中山鼎晟生物科技有限公司