专利名称：：一种快速检测黄曲霉毒素含量的方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物含量的测定方法，确切地说是一种农副产品中黄曲霉毒素含量的快速测定方法。二
背景技术：
：黄曲霉毒素(Aflatoxin)是常见曲霉菌黄曲霉(AspergiUusflavus)和寄生曲(」parasiticus)中产毒菌株的代谢产物。主要毒素是B1、B2、Gl和G2,其中B1是毒性和危害最大的一种。黄曲霉毒素是目前所知致癌性最强的化合物，广泛存在于花生、花生油、大米、玉米、糕点等粮油食品和动物饲料中,严重影响人们的健康，甚至威胁着人们的生命安全。我国是世界上的花生主产和出口国之一，国内的一些花生进出口企业，往往由于报检通关手续繁杂，造成成品花生在仓库积压，而在花生贮藏过程中往往由于管理不善或者天气等原因，易受到微生物污染造成质量严重下降。国外有些国家对于花生等农产品的检测标准也趋见苛刻。目前,为满足出入境检验检疫的需要,各国采取的检测黄曲霉毒素的方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫亲和柱净化荧光光度法、免疫亲和柱净化高效液相色谱法、多功能柱色谱净化高效液相色谱法等，这些方法一般操作比较复杂、检测时间长、检测结果不够精确。而更为快速精确的液相-串联质谱联用检测法(LC-MS/MS)却鲜有报道，本研究就利用LC-MS/MS法检测花生样品中的黄曲霉毒素含量。三
发明内容本发明旨在提供一种快速测定农副产品中黄曲霉毒素含量的方法。所要解决的技术问题是建立高效液相色谱和质谱串联使用系统(LC-MS/MS)。本发明的技术方案首先将原料(农副产品)粉碎，然后萃取、过滤，滤液经纯化后进行检测，以花生为例，具体过程如下1、取50g粉碎后过筛样品和5g氯化钠转移到干净的均质器中，加入100ml80%甲醇水溶液(80:20)高速均质lmin。将其过滤，至少留滤液10ml，用20ml去离子水稀释5ml萃取液并彻底混合，再用玻璃纤维滤纸过滤，取滤液。2、将10ml无菌注射器接于免疫亲和柱上部，取10ml已稀释的萃取液以1-2滴/S的速度通过免疫亲和柱，再用2ml去离子水洗柱，最后用lml甲醇洗脱并将洗脱液收集于干净的比色皿或其他容器中待用。3、色谱条件的选择色谱柱WatersSymmetryC18柱(2.1x150mm,3.5fmi);流动相A:10mM乙酸水溶液；流动相B:100%甲醇；柱温40°C;流速0.2~lml/min;梯度程序B在0min为50%，在010min增至90X,在1015min从90%降低为50%。4、质谱条件的优化本研究离子化模式采用电喷雾(ESI)正离子模式,通过全离子扫描(Fullscan)确定AFB卜AFB2的选择离子,丰度最高的碎片是含Na离子的化合物AFB!对应335.2m/z、AFBz对应337.2m/z、。对质谱条件进行优化气帘气(CUR)10~30ml/min、离子化电压(IS)4500V、雾化气(GSl)1030ml/min、辅助雾化气(GS2)30~40ml/min、辅助加热器温度(TEM)450°C。本方法对5份脱皮花生仁样品进行了黄曲霉毒素含量检测，结果见表1。TablelLC-MS/MS测脱皮花生仁样品中黄曲霉毒素含量结果sampleAFTBl(ug/kg)AFTB2(ug/kg)0.28nd10.290.29±0.00440.30nd1.420.451.421.42±0.00250.430.43±0.01031.430.420.960.1330.970.96±0.00250.150.13±0.01190.960.110.26nd40.260.25±0.0071nd0.24nd0.560.120.560.56±0.00090.120.12±0扁90.560.12本方法提取和净化过程使用的是甲醇，减少了对试验人员的伤害，同时检测花生中的黄曲霉毒素B!、B2，检测限分别为0.15pg/kg、0.09itig/kg回收率为84.3%107.5%，相对标准偏差为5.3%9.7%。本发明具有简便、快捷、精密、准确的特点，为农副产品中黄曲霉毒素含量检测提供方便可靠的检测手段。四图1是黄曲霉毒素B"B2总的离子流色谱图，在20min内出峰顺序为AFB2、AFB^分离效果好。图2是黄曲霉毒素B"B2的选择离子(SIM)色谱图。就是选择离子(SIM)条件下的色谱图图3是LC-MS/MS测黄曲霉毒素B^示准曲线。图4是LC-MS/MS测黄曲霉毒素B2标准曲线。五具体实施例方式现以花生为例，非限定实施例叙述如下1、实验原料与试剂1.1主要原料与试剂花生，取自于安徽凯利粮油食品有限公司，黄曲霉毒素B1和B2，甲醇和乙腈均为色谱纯，乙酸为分析纯(AR)。2、试验方法2.l样品的准备粉碎好的样品过20目筛并在取样前彻底混合，不立即分析的样品应放在冰箱中储存。取50g过筛样品和5g氯化钠转移到干净的均质器中，加入100ml8(^甲醇水溶液(80:20)高速均质lmin。将其过滤，至少留滤液lOml，用20ml去离子水稀释5ml萃取液并彻底混合，再用玻璃纤维滤纸过滤，取滤液。2.2样品预处理将100ml无菌注射器接于免疫亲和柱上部，取10ml已稀释的萃取以1-2滴/S的速度通过免疫亲和柱，再用2ml去离子水洗柱，最后用lml甲醇洗脱并将洗脱液收集于干净的比色皿或其他容器中待用。2.3色谱条件的选择色谱柱WatersSymmetryC18柱(2.1x150mm,3.5nm);流动相A:10mM乙酸水溶液；流动相B:100%甲醇；柱温4(TC;流速0.2-1ml/min;梯度程序B在0min为50X，在010min增至90X，在1015min从90%降低为50%。2.4质谱条件的优化本研究离子化模式采用电喷雾(ESI)正离子模式,通过全离子扫描(Fullscan)确定AFB!、AFB2的选择离子，丰度最高的碎片是含Na离子的化合物AFBi对应335.2m/z、AFB2对应337.2m/z、。对质谱条件进行优化气帘气(CUR)10~30ml/min、离子化电压(IS)4500V、雾化气(GS1)1030ml/min、辅助雾化气(GS2)30~40ml/min、辅助加热器温度(TEM)450°C。2.5精密度与回收率实验取同一花生样品，按2.1的步骤处理样品,分析并测定其精密度及回收率。结果见表2。表2C-MS/MS法测定黄曲霉毒素的回收率及精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实验结果显示其回收率在84.3%到107.5%之间，平均回收率为94.9%，其精密度为5.3%到9.8%，平均精密度为8.1%，充分表明这种方法准确可靠。2.6标准曲线及检出限准确吸取不同浓度的黄曲霉毒素混合标准工作溶液10pL，HPLC-MS/MS分析,分别以黄曲霉毒B卜B2、GhG2的峰面积对样品的浓度进行线性回归分析,即得标准曲线;按信噪比S/N>3:1时溶液浓度计,可得黄曲霉毒B"B2、G卜G2的检出限。结果见图3、图4和表3。表3LC-MS/MS法黄曲霉毒素的回归方程及检出限黄曲霉素回归方程相关系数检出限RegressionequeationCorrelationcoefficientLimitofdetactio'n(ng)Bly=432.92x+2032.70.99940.15B2y=471.9x-53640.99180.09权利要求1、一种快速检测黄曲霉毒素含量的方法，包括农副产品原料的粉碎、80％甲醇溶液萃取、过滤和免疫亲和柱纯化以及检测，其特征在于所述的检测是液相色谱串联质谱联用检测法，液相色谱检测条件色谱柱WatersSymmetryC18柱(2.1×150mm，3.5μm)；流动相A10mM乙酸水溶液；流动相B100％甲醇；柱温40℃；流速0.2～1ml/min；梯度程序B在0min为50％，在0～10min增至90％，在10～15min从90％降低为50％；质谱检测条件采用电喷雾(ESI)正离子模式，通过全离子扫描(Fullscan)确定AFB1、AFB2的选择离子，气帘气(CUR)10～30ml/min、离子化电压(IS)4500V、雾化气(GS1)10～30ml/min、辅助雾化气(GS2)30～40ml/min、辅助加热器温度(TEM)450℃。全文摘要一种快速检测黄曲霉毒素含量的方法，包括农副产品的粉碎、萃取和纯化以及检测，所述的检测是色-质联用检测法，色谱条件色谱柱WatersSymmetryC18柱(2.1×150mm，3.5μm)；流动相A10mM乙酸水溶液；流动相B100％甲醇；柱温40℃；流速0.2~1ml/min；梯度程序B在0min为50％，在0～10min增至90％，在10～15min从90％降低为50％；质谱条件采用电喷雾(ESI)正离子模式，通过全离子扫描(Fullscan)确定AFB<sub>1</sub>、AFB<sub>2</sub>的选择离子，气帘气(CUR)10～30ml/min、离子化电压(IS)4500V、雾化气(GS1)10～30ml/min、辅助雾化气(GS2)30～40ml/min、辅助加热器温度(TEM)450℃。本发明具有简便、快捷、精密、准确的特点。文档编号G01N30/00GK101655480SQ20091014422公开日2010年2月24日申请日期2009年7月24日优先权日2009年7月24日发明者孟凡莉,易苗苗,毅杨,潘丙南,范远景,谢慧明,伟陈,高海成,黄文东申请人:合肥工业大学